基于基质的 DNA 提取，用于对去污痰液样本进行靶向下一代测序
June 6th, 2025
我们提出了一种优化的从去污痰液中提取 DNA 的方法，该方法使用基于基质的提取方法结合磁珠纯化，用于结 核分枝杆菌的下游靶向下一代测序。
我们的研究是通过结合 NGS 进行个性化患者护理来缩短结核病诊断和随后启动的周转时间。我们的方案通过解决工作流程集成、成本和周转时间来优化 TNGS 的常规使用，旨在减少诊断延迟并改善及时的治疗启动。
与传统的 CTAB 方法相比，该协议允许在数小时内从临床样本中提取具有成本效益、快速且足够质量的 DNA，后者需要长达三天的时间。
我们的结果提出了将 TNGS 整合到常规诊断中以及优化涂片阴性和稀缺样本的提取方法以提高灵敏度和临床实用性的关键问题。我们将探讨常规诊断的残留样本是否可用于下游测序，包括痰液的直接全基因组测序，以简化和扩大结核病基因组监测。
[旁白]首先，获得热灭活的痰沉淀物。以 16,800 G 或全速离心样品 15 分钟。使用 20 至 200 微升移液器轻轻吸出并丢弃上清液，确保沉淀不受干扰。轻轻摇动基质悬浮液进行混合，然后移液 200 微升充分混合的基质以重悬沉淀。将全部体积转移到 1.5 毫升螺旋盖管中，其中包含三个直径为 2 毫米的预灭菌玻璃珠。现在，将样品放入 56 摄氏度的加热块中 15 分钟。孵育后，用涡旋将样品均质化10秒，使细胞分散，然后将样品在100摄氏度的加热块中孵育10分钟。使用高速均质机以每秒4.0米的速度对样品进行均质化，一个循环为60秒。然后，将悬浮液以 12,000 G 离心五分钟。将 130 微升含 DNA 的上清液转移到新鲜的 1.5 毫升低结合管中，而不会干扰沉淀。丢弃第一个装有基质和细胞碎片的试管。使用磁珠纯化DNA，首先在使用前将磁珠储备瓶或配制的等分试样彻底涡旋以重悬珠子，然后在提取的DNA中加入1.2倍体积的磁珠，移液悬浮液10次以混合样品，然后在室温下孵育5分钟。将样品放在 1.5 毫升管磁架上三分钟，或直到液体变清，然后小心地吸出并丢弃上清液，不要干扰珠子。将管子放在磁铁上，加入 200 微升 80% 乙醇，确保珠子不受干扰。孵育 30 秒后，小心地吸出并丢弃乙醇，不要干扰珠子。第二次洗涤后，使用 1 至 10 微升移液器去除任何残留的乙醇。让管子打开，将珠子风干 10 分钟，或直到它们呈现哑光外观。一旦珠子具有哑光外观，从磁铁上取出试管，并将 50 微升无核酸酶水直接添加到每个样品中的珠子上。然后，通过移液 10 次混合每个单独的样品。检查管子里面是否有任何珠子。在室温下孵育五分钟后，将试管放回磁架上三分钟，或直到液体变清。将试管放在磁架上，将含有 DNA 的上清液转移到标记清晰的无菌低结合管中。两毫升沉积物样本中的 DNA 浓度较高，而所有涂片等级的 DNA 浓度均为 500 微升。在 500 微升沉积物样品中观察到 DNA 产量的变异性更大。在所有涂片等级中，两毫升沉积物样本的测序读数覆盖深度高于 500 微升。从 500 微升沉积物中提取的三个涂片级样品的变异性更大。与 500 微升样品相比，2 毫升样品的测序可接受性评分通常更高，高度可接受的结果比例更高。与涂片一加和二加涂片相比，涂片三级以上样本的可接受结果比例最高。500 微升的样品中有更多病例被归类为不可接受或未确定。
概述
本研究提出了一种从消毒的痰样本中提取DNA的优化方法。该方法利用基于基质的提取技术结合磁性珠子纯化，便于针对结核分枝杆菌的下一代测序。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因组学
- 传染病学
背景
- 结核分枝杆菌是全球健康的重大问题。
- 准确的DNA提取对于有效的病原体检测至关重要。
- 传统方法可能效率低下或受到污染。
- 优化技术可以提高测序结果。
研究目的
- 开发一种从痰中可靠的DNA提取方法。
- 提高提取的DNA的纯度和产量。
- 便于下游应用如下一代测序。
使用的方法
- 基于基质的提取方法。
- 磁性珠子纯化。
- 痰样本的消毒处理。
- 针对结核分枝杆菌的下一代测序。
主要结果
- 展示了改进的DNA产量和纯度。
- 成功应用于结核分枝杆菌的测序。
- 与传统提取技术进行了验证。
- 为研究人员提供了一个可重复的协议。
结论
- 优化方法提高了DNA提取效率。
- 适用于临床和研究应用。
- 未来的研究可以在此方法基础上进行更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Matrix-based DNA extraction combined with magnetic bead purification enables rapid, high-quality nucleic acid preparation from decontaminated sputum, directly supporting targeted next-generation sequencing (tNGS) for drug-resistant tuberculosis. This workflow addresses a critical bottleneck in infectious disease diagnostics by reducing turnaround time and increasing reliability for actionable resistance profiling. Streamlined extraction protocols facilitate broader tNGS adoption in both centralized and resource-limited settings, impacting portfolio strategies for infectious disease R&D and global health initiatives.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables robust interrogation of resistance-associated genetic loci in Mycobacterium tuberculosis.
- Supports functional validation of drug resistance targets through direct clinical sample analysis.
- Improves predictive confidence in resistance mechanism identification for portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Delivers high-quality DNA suitable for standardized tNGS workflows and downstream assay development.
- Facilitates reproducible, scalable sample processing for high-throughput resistance screening.
- Enables reliable evaluation of new diagnostic or therapeutic candidates targeting TB resistance pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling direct genotypic resistance profiling from patient samples.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation by providing clinically relevant genetic data.
- Reduces risk in advancing candidates by ensuring accurate resistance detection in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
This extraction protocol integrates at the interface of clinical sample processing and targeted sequencing, bridging early discovery, lead identification, and translational research for infectious disease portfolios.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing for resistance mechanisms by enabling direct genetic analysis from clinical specimens.
- Screening: Standardizes DNA input quality for tNGS-based resistance screening platforms.
- Analytics: Provides quantitative, high-purity DNA for robust sequencing readouts and comparative analytics.
- Translational Research: Ensures biomarker alignment and preclinical continuity by using patient-derived material.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, adaptable extraction workflow for diverse TB research and diagnostic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance detection and target validation.
- Operational Value: Reduces hands-on time and complexity, supporting reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions for resistance-targeted assets and diagnostics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of TB and infectious disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid extraction and tNGS workflows.
- Needs access to magnetic bead purification and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data quality.
- Adaptable to various sputum sample qualities and decontamination protocols.
- Dependent on validated downstream tNGS assays for actionable outputs.
