食管类器官的建立和组织学分析模拟从正常组织到癌性组织的进展

本方案描述了代表肿瘤进展不同阶段的食管类器官模型的建立和组织学分析。该方法使研究人员能够研究从正常组织到癌组织过渡期间细胞形态、空间组织和分子标志物表达模式的变化。

我们的研究重点是肿瘤发生和早期肿瘤发生。我们研究正常细胞如何转化为肿瘤细胞，以及这些细胞如何改变其微环境以促进肿瘤发生。目前，用于促进研究的技术有很多，包括干细胞技术、基因编辑技术、先进的三维培养系统和生物材料以及单细胞和空间组学技术。我们面临的最大挑战是保持类器官免受细菌和真菌的侵害。这些污染物在组织处理和运输过程中潜入，常常破坏我们的培养物。

[导师]首先，在4摄氏度下解冻基底膜基质和人食管类器官培养基。将组织样品转移到五毫升离心管中，然后用室温洗涤缓冲液洗涤样品三次。使用无菌剪刀，在1.5毫升离心管中将组织切碎成一毫米立方的碎片。现在，将组织片段悬浮在一毫升消化缓冲液中。在 37 摄氏度下以每分钟 50 至 100 转的速度摇动混合物 10 至 20 分钟以消化组织。接下来，将混合物在 400G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后弃去上清液。将沉淀重悬于 500 微升 0.025% 胰蛋白酶-EDTA 中。将悬浮液在37摄氏度下孵育10分钟。然后加入一毫升补充有10%胎牛血清的DMEM以停止酶活性。接下来，将悬浮液通过 70 微米无菌过滤器，并将滤液收集到 1.5 毫升离心管中。将滤液在4摄氏度下以400G离心5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于 100 微升 H-EOCM 中。重悬细胞后，使用细胞计数器测定细胞密度。然后将每毫升 5,000 至 15,000 个细胞转移到新鲜的 1.5 毫升管中。对于类器官接种，将细胞轻轻重悬于 50 至 100 微升基底膜基质中。将 50 微升基质细胞混合物移液到 24 孔板的每个孔的中心。在37摄氏度下孵育30分钟，使基底膜基质聚合。现在将 500 微升预热的 H-EOCM 移液到每个孔中以覆盖基质。然后将板在加有 5% 二氧化碳的加湿培养箱中以 37 摄氏度孵育。要更换培养基，请吸出用过的培养基。用预热至 37 摄氏度的 500 微升新鲜 H-EOCM 补充每个孔。对再分解蜡和再水合的类器官进行多重免疫荧光染色。加入绵羊血清阻断溶液，将类器官覆盖在放置在湿度室中的载玻片上，并将载玻片在室温下孵育30分钟。用含PBS的吐温洗涤载玻片两分钟。接下来，滴下稀释的一抗以覆盖类器官区域。根据抗体要求在湿度室中孵育。孵育后，在耐热室中以 80 PMM 在 PBS-T 中洗涤载玻片两次，每次两分钟。现在将二抗溶液滴到类器官区域，并在室温下在湿度室中孵育20分钟。孵育后，在耐热室中以 80 RPM 在 PBS-T 中洗涤载玻片两次，每次两分钟。将荧光染料溶液移液到洗涤后的载玻片上以覆盖类器官区域并再次孵育。孵育后，在PBS-T中洗涤载玻片两次。对于多染色，重复抗原修复和抗体阻断。然后滴下dappy溶液以覆盖类器官区域。将载玻片浸入消毒水中两分钟，以洗去多余的污渍。在获取数字图像之前，添加防褪色封片剂并贴上盖玻片。类器官结构从正常阶段到癌阶段变得越来越混乱，如 KRT6A 染色所示。PDL1的表达从正常食管黏膜逐渐升高到食管鳞状细胞癌。