Name: 食管类器官的建立和组织学分析模拟从正常组织到癌性组织的进展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 学习建立食管类器官模型并进行组织学分析，利用多重免疫荧光染色技术观察KRT6A和PDL1表达变化，研究从正常组织到癌性组织的肿瘤进展过程。该方法为肿瘤生物学研究提供重要工具。

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作者感谢中国医学科学院（CAMS）肿瘤医院和北京协和医学院（PUMC）参与研究的所有患者和医生。本研究由国家自然科学基金（82203156，项目负责人：S.Z.）、国家重点研发计划（2023YFC3503200，项目负责人：S.Z.）以及中国医学科学院医学与健康科技创新工程基金（2023-I2M-QJ-002，项目负责人：S.Z.）资助。图1 使用 BioRender.com 制作。

本研究经中国医学科学院肿瘤医院机构审查委员会批准（批准号：20/069–2265、22/221-3423 和 23/305-4047）。食管组织样本来源于2021年至2024年间在中国医学科学院肿瘤医院接受食管鳞状细胞癌（ESCC）手术或早期筛查的患者，用于建立人源食管类器官。本研究纳入的所有患者在样本采集前均未接受过化疗或放疗。所有参与者均签署了知情同意书，相关临床信息从病历资料中获取。本研究所用试剂与设备的完整清单见于 材料表.
1. 食管上皮类器官的制备
<ol>
	<li>制备L-WRN条件培养基
	<ol>
		<li>制备L-WRN细胞系
		<ol>
			<li>将L-WRN细胞系（储存于-80 °C）在37 °C水浴中解冻1-2分钟。加入5 mL预热的基础培养基（DMEM添加10%胎牛血清FBS）混匀。</li>
			<li>在室温（RT）下以200 × g 离心5分钟。</li>
			<li>弃去上清液。用2-3 mL新鲜预热的选择培养基（含10% FBS、0.5 mg/mL潮霉素B和0.5 mg/mL G-418的DMEM）重悬细胞。 
			注：将培养基保存于4 °C（最长储存1个月）。</li>
			<li>将细胞转移至含有选择培养基的10 cm培养皿中，在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中培养。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>L-WRN细胞系传代
		<ol>
			<li>使用0.025%胰蛋白酶-EDTA（37 °C下作用1-2分钟）消化汇合细胞，并按1:2比例传代。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>收集L-WRN条件培养基
		<ol>
			<li>当细胞融合度达到80%时，更换为基础培养基。将上清液转移至离心管中。</li>
			<li>经0.22 µm滤膜过滤以去除细胞碎片。收集滤液作为L-WRN条件培养基。 
			注：将L-WRN条件培养基保存于4 °C（可保存1周）或-80 °C（可保存6个月）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>人食管类器官培养基（H-EOCM）的配制
	<ol>
		<li>H-EOCM配制
		<ol>
			<li>将L-WRN条件培养基（1.5 mL体积）在4 °C平衡4小时后涡旋混匀。</li>
			<li>将Advanced DMEM/F12培养基与以下添加剂混合配制H-EOCM：3% L-WRN条件培养基、1× 抗生素-抗真菌剂（Anti-Anti）、1× L-谷氨酰胺、1× N2补充剂、1× B27补充剂、0.15 mM HEPES、40 ng/mL EGF、10 µM Y-27632和50 µM A83-01。 
			注：H-EOCM应冷冻保存于-20 °C，可稳定保存六个月。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实验前准备
	<ol>
		<li>将H-EOCM置于4 °C环境中4小时以解冻。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 人食管类器官的建立
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>在 4 °C 下解冻基底膜基质和 H-EOCM。为下一次实验灭菌手术剪刀和镊子。</li>
		<li>将移液器吸头预冷至 4 °C。将 24 孔板预热至 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织处理与细胞分离 
	注意：食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤组织、不典型增生病变（距肿瘤边缘 ≤2 cm）以及配对的正常食管组织（距肿瘤边缘 ≥5 cm）均来自接受手术切除的同一 ESCC 患者。此外，多阶段食管样本通过 ESCC 早期检测和筛查项目获得，具体方法见我们之前的研究6,7。
	<ol>
		<li>使用室温洗涤缓冲液（含 1× 抗生素-抗真菌剂和 0.15 mM HEPES 的 PBS）在 5 mL 离心管中清洗样本三次。 
		注意：清洗样本超过三次以降低污染风险。</li>
		<li>用无菌剪刀将组织剪成 1 mm3 大小的碎片。将碎片转移至 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>加入 1 mL 消化缓冲液重悬样本，在 37 °C、50–100 rpm 条件下振荡 10–20 分钟以消化组织。</li>
		<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。</li>
		<li>用 500 µL 0.025% 胰蛋白酶-EDTA 重悬沉淀物。在 37 °C 孵育 10 分钟。加入 1 mL 含 10% FBS 的 DMEM 以终止酶活性。</li>
		<li>将悬液通过 70 µm 无菌滤膜过滤。将滤液收集至 1.5 mL 离心管中。</li>
		<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心滤液 5 分钟。弃去上清液。用 100 µL H-EOCM 重悬细胞。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官接种
	<ol>
		<li>测定细胞密度，然后在新的 1.5 mL 离心管中制备含有 5,000–15,000 个细胞的悬液。</li>
		<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液。轻柔地用 50–100 µL 基底膜基质均匀重悬细胞。 
		注意：将基底膜基质保存在 4 °C 以防止凝固。</li>
		<li>将含混合细胞的 50 µL 基底膜基质加至每个 24 孔板的中央。在 37 °C 下孵育 30 分钟，使基底膜基质聚合。</li>
		<li>加入 500 µL 预热的 H-EOCM（37 °C）覆盖基底膜基质。将类器官置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润培养箱中培养。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>更换培养基
	<ol>
		<li>吸除旧培养基，并补充 500 µL 新鲜 H-EOCM（预热至 37 °C）。 
		注意：每 3 天更换一次 H-EOCM。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 类器官传代
<ol>
	<li>材料准备
	<ol>
		<li>在 4 °C 下解冻基底膜基质和 H-EOCM。将移液器吸头预冷至 4 °C。将 24 孔板预热至 37 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官消化
	<ol>
		<li>轻柔移除 H-EOCM 培养基。在孔中加入 500 µL 预冷的传代缓冲液（含 1× 抗生素-抗真菌剂和 0.15 mM HEPES 的 Advanced DMEM/F12，预冷至 4 °C），以溶解基底膜基质。</li>
		<li>将基底膜基质与传代缓冲液转移至 1.5 mL 离心管中。用 500 µL 预冷的传代缓冲液冲洗孔板，并收集缓冲液以回收残留的类器官。</li>
		<li>在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟。轻柔吸除上清液。向管中加入 500 µL 重组胰蛋白酶，进行酶消化（37 °C，15 分钟）。每 5 分钟轻柔重悬一次。</li>
		<li>将消化后的样品在 4 °C 下以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。重复步骤 3.2.6 和 3.2.7。将细胞重悬于 100 µL H-EOCM 中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官接种
	<ol>
		<li>进行类器官接种时，重复步骤 2.3。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 类器官的冻存与复苏
<ol>
	<li>类器官冻存
	<ol>
		<li>材料准备：重复步骤 2.1。</li>
		<li>类器官消化：重复步骤 3.2。</li>
		<li>类器官冻存
		<ol>
			<li>确定细胞密度，然后在新的 1.5 mL 离心管中将 10,000 个细胞重悬于悬浮液中。</li>
			<li>在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液。</li>
			<li>用 500–1000 µL 冷冻保存液重悬细胞，转移至新的冻存管中。将冻存管于 -80 °C 冷冻 24 小时，随后转移至液氮储存系统中长期保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>冻存类器官的复苏
	<ol>
		<li>材料准备：重复步骤 2.1。</li>
		<li>冻存类器官的复苏
		<ol>
			<li>将冻存管在 37 °C 水浴中快速解冻 2–3 分钟。将解冻后的样品转移至 9 mL 预热的基礎培养基（37 °C）中，并均匀重悬细胞。</li>
			<li>将细胞悬液在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。小心吸除上清液。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>类器官接种
		<ol>
			<li>类器官接种：重复步骤 2.3。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 类器官的组织学分析
<ol>
	<li>石蜡包埋切片的制备
	<ol>
		<li>材料准备
		<ol>
			<li>在250 mL锥形瓶中灭菌50 mL包埋介质（水溶液：2%琼脂 + 2.5%明胶） 通过 高压灭菌。分装5 mL至15 mL离心管中。室温保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>类器官固定
		<ol>
			<li>重复步骤 3.2.1–3.2.2。在新的 1.5 mL 离心管中，用 1 mL 传代缓冲液重悬沉淀。</li>
			<li>400 x g 离心 g 4 °C 下离心 5 分钟。弃去上清液。将类器官重悬于 500 µL 4% 多聚甲醛（PFA）中。室温孵育 1 小时，或 4 °C 孵育至少 6 小时。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>类器官包埋
		<ol>
			<li>离心混合物（400 x g，5 分钟，室温）。去除上清液。向管中加入 1 mL 传代缓冲液，重悬沉淀。</li>
			<li>离心混合物（400 x g，5 分钟，室温）。弃去上清液。</li>
			<li>将一个含包埋介质（5 mL）的试管（15 mL）放入水浴（100 mL，150 mL容器）中。用微波炉以最大功率加热，直至水开始沸腾。 
			注意：微波加热前请先拧开15 mL离心管的管盖。</li>
			<li>重悬&#160;将类器官与50 µL包埋胶混合置于1.5 mL离心管中。将离心管冷却至4 °C，直至胶完全凝固。</li>
			<li>转移凝固的凝胶&#160;70% 乙醇中，4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>石蜡包埋块制备
		<ol>
			<li>通过乙醇梯度脱水（30% → 50% → 70% → 80% → 95% → 100%），每级30分钟&#160;每浓度</li>
			<li>将凝固的凝胶放入透明的二甲苯中30分钟。将凝固的凝胶浸入石蜡中，并使用加热的石蜡包埋装置进行包埋。</li>
			<li>用切片机切取4 µm厚的切片。将切片贴附于载玻片上，在65 °C下干燥1小时。置于干燥环境中保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>类器官切片的免疫组织化学（IHC）染色
	<ol>
		<li>脱蜡与水化
		<ol>
			<li>在65 °C的组织透明剂中加热切片40分钟。将切片浸入新鲜的组织透明剂中，室温下孵育20分钟。</li>
			<li>将切片依次放入盛有乙醇系列溶液的玻璃染色缸中处理：先浸入100%乙醇中10分钟，重复一次；随后转移至95%乙醇中5分钟，再依次放入85%乙醇中5分钟、75%乙醇中5分钟；最后置于4% PFA中固定10分钟。</li>
			<li>向耐热室中加入灭菌水，在80 rpm条件下振荡5分钟。重复此步骤两次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>抗原修复
		<ol>
			<li>向耐热染色缸中加入Tris-EDTA抗原修复液（pH 9.0），浸没载玻片。将装有载玻片的耐热染色缸置于微波炉中，高功率（700 W，3 min）加热至沸腾。随后调至低功率（70 W，15 min）继续微波加热，然后自然冷却至室温。</li>
			<li>在摇床（80 rpm）上用蒸馏水洗涤2分钟，重复两次。用组织学标记笔圈出类器官的位置。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>过氧化物酶阻断
		<ol>
			<li>滴加过氧化物酶阻断液以覆盖样本区域，在室温下于湿盒中孵育20分钟。</li>
			<li>将载玻片转移至耐热孵育盒中，在PBST（PBS + 0.1% Tween 20）中以80 rpm振荡洗涤2分钟，重复两次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>一抗孵育
		<ol>
			<li>轻轻擦去载玻片上多余的 PBST 液滴。 
			注意：避免触碰载玻片上的类器官。</li>
			<li>滴加稀释的一抗以覆盖类器官区域，在湿盒中室温孵育2小时，或4 °C孵育8–14小时。重复此步骤一次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>二抗孵育
		<ol>
			<li>重复步骤5.2.4.1。滴加稀释的HRP二抗以覆盖类器官区域，在室温湿润环境中孵育20分钟。重复此步骤一次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>DAB（3,3′-二氨基联苯胺）染色
		<ol>
			<li>重复步骤5.2.4.1。滴加1× DAB覆盖类器官区域，在室温湿盒中孵育，直至颜色变为棕色。</li>
			<li>将切片浸入蒸馏水中5-10秒，以终止颜色变化。重复该步骤。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>苏木精染色
		<ol>
			<li>苏木精染色5-8分钟。用1%酸性乙醇（1% HCl溶于70%乙醇）分化5-10秒。</li>
			<li>将载玻片浸入蒸馏水中5-10秒。重复此步骤一次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>脱水
		<ol>
			<li>将玻片依次通过玻璃染色缸进行处理：先浸入75%乙醇中5分钟，转移至85%乙醇中5分钟，再移入95%乙醇中5分钟，随后分别在100%乙醇中浸洗两次，每次10分钟，最后置于二甲苯中连续处理两个20分钟周期。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>载玻片封片
		<ol>
			<li>加入二甲苯至中性树胶中直至变透明，稍作风干。然后滴加含二甲苯的树胶覆盖类器官区域。</li>
			<li>盖上盖玻片。扫描并分析载玻片。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>多重免疫荧光（mIF）染色
	<ol>
		<li>脱蜡和水化：重复步骤 5.2.1。</li>
		<li>进行过氧化物酶阻断时，重复步骤 5.2.3。</li>
		<li>抗原修复：重复步骤 5.2.3。</li>
		<li>羊血清封闭
		<ol>
			<li>重复步骤5.2.4.1。加入羊血清封闭液以覆盖类器官区域，在室温下的湿盒中孵育30分钟。</li>
			<li>用PBST洗涤2分钟，重复两次。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>进行一抗孵育时，重复步骤 5.2.4。</li>
		<li>对于二抗孵育，重复步骤 5.2.4.1。
		<ol>
			<li>滴加特异性二抗溶液以覆盖类器官区域，在室温下的湿盒中孵育20分钟。重复步骤5.2.3.2。 
			注意：从本步骤开始直至实验结束，需避免光照保护载玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>荧光染料染色
		<ol>
			<li>重复步骤5.3.4.1。滴加荧光染料溶液以覆盖类器官区域。</li>
			<li>在室温下的湿盒中孵育10-20分钟。重复步骤5.2.3.2。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于多重染色，重复步骤 5.3.3–5.3.7。</li>
		<li>DAPI 染色
		<ol>
			<li>重复步骤5.2.4.1。滴加DAPI溶液以覆盖类器官区域。重复步骤5.2.3.2。接着，重复步骤5.3.4.2。</li>
			<li>将载玻片浸入无菌水中 2 分钟。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>载玻片封片
		<ol>
			<li>滴加抗荧光淬灭封片剂以覆盖类器官区域，加盖盖玻片。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>使用切片扫描仪获取数字图像并进行分析。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务利益或利益冲突。

类器官的建立及其组织学分析在模拟肿瘤进展方面代表了重要的技术进步。该方案在研究肿瘤发生方面相较于现有方法具有显著优势20与传统的二维细胞培养系统不同，类器官具有复杂的三维结构和细胞异质性，能更真实地模拟 体内 条件。与动物模型相比，源自人体组织的类器官更能准确地反映人类疾病的特征9,21,22多重免疫荧光染色技术的引入可实现多种标志物的同步可视化，有助于揭示肿瘤演化过程中关键分子与组织结构之间的空间关系。通过采用这一先进方案，本研究揭示了食管鳞状细胞癌中的显著动态变化，具体表现为肿瘤细胞增殖水平在肿瘤发展过程中逐步改变，并伴随免疫抑制分子PD-L1表达的相应变化。
本方案提供了研究肿瘤发生过程中形态学和分子变化的全面方法，其中多个关键步骤需要特别注意。组织处理过程中的消化时间必须严格监控，因为消化过度会导致细胞大量死亡，而消化不足则...

肿瘤发生是一个复杂的多阶段过程，其特征是细胞发生渐进性的分子和形态学改变1,2。食管鳞状细胞癌（ESCC）是一种预后较差的常见恶性肿瘤3,4，其发展过程典型地经历了四个明确的阶段：正常黏膜、低级别上皮内瘤变（LGIN）、高级别上皮内瘤变（HGIN）以及浸润性癌5。在这些阶段中，上皮细胞表现出分子表达模式和空间组织的动态变化，同时伴随组织形态从正常向恶性状态逐步演进的系统性改变6,7。尽管对ESCC发病机制的理解已取得进展，但仍缺乏能够真实再现肿瘤演化过程中时空特征、同时支持系统性组织学和分子分析的实验模型，这限制了对疾病进展机制的深入理解以及治疗策略的开发。
尽管二维永生化癌细胞系在阐明肿瘤发生机制方面做出了重要贡献，但其在模拟原发肿瘤的生物学复杂性和病理特征方面存在固有局限性8。动物模型虽然提供了体内研究环境，但由于物种特异性差异，往往难以准确预测人类的反应9。相比之下，类器官作为一种变革性的临床前研究平台，能够高度忠实地保留人类组织的细胞异质性、结构特征和功能特性10,11,12,13。作为临床前模型，类器官能更真实地反映原发性肿瘤的特征，从而实现对肿瘤进展过程中关键分子事件和细胞变化的深入研究14。例如，Chen 等人利用来自不同 ESCC 阶段的患者来源食管类器官，阐明了上皮细胞与成纤维细胞之间的相互作用，最终验证 ANXA1-FPR2 信号轴是驱动 ESCC 发病的关键因素6。同样，Ko 等人采用基因工程改造的食管类器官，鉴定出驱动 ESCC 起始和免疫逃逸的关键遗传决定因子，展示了类器官模型如何有效重现疾病特征并揭示新的治疗靶点15。
本方法通过建立可重复的多阶段食管鳞状细胞癌（ESCC）类器官培养方案，解决了食管癌建模中的重大难题，所生成的类器官能够模拟从正常上皮到浸润性癌的组织学进展过程。该体系采用L-WRN条件培养基优化培养条件，以维持上皮干细胞特性，并结合标准化的组织学处理和多重免疫荧光（mIF）分析流程，为长期纵向分析肿瘤发生过程中的空间与分子变化提供了理想平台。与2D培养等其他技术相比，此类器官样平台能够独特地保留组织结构，从而实现对空间有序分布的分子标志物的可视化观察，包括介导肿瘤免疫逃逸的免疫检查点蛋白PD-L1（CD274）——其通过抑制T细胞反应发挥作用16,17,18，以及增殖标志物Ki-67。本方案支持正常食管组织及癌前病变组织来源的类器官传代培养，有助于研究人员构建从正常组织到肿瘤的连续类器官模型19。通过实现对肿瘤发生过程中空间与分子变化的精细分析，该方案为深入理解癌症发生与进展的机制提供了有力工具，有望推动更有效的治疗策略的开发。
该方法特别适用于研究食管鳞状细胞癌（ESCC）及相关鳞状细胞恶性肿瘤的上皮癌变、肿瘤微环境相互作用或治疗反应的研究人员。其模块化设计允许在纳入适当验证步骤的前提下，用于研究其他分子标志物或信号通路。本方案提供了一个标准化且灵活的平台，旨在推动肿瘤生物学领域的临床前研究，并加速将机制性研究成果转化为靶向治疗策略。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;mu;m 滤膜</td><td>Merck</td><td>Cat#SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Corning</td><td>Cat#3524</td><td></td></tr><tr><td>4% 多聚甲醛</td><td>Beyotime</td><td>Cat# P0099</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m 无菌筛网</td><td>Falcon</td><td>Cat#352350</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris Bioscience</td><td>Cat# 2939</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>Cat# 12634028</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Solarbio</td><td>Cat# A8190</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti（抗生素-抗真菌剂）</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15240062</td><td></td></tr><tr><td>B-27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>Cat# 17504044</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>Cat#371GPCN</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶 IV</td><td>Gibco</td><td>Cat# 17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor</td><td>STEMCELL</td><td>Cat# 07930</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>Cat# 10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>Cat# PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Cell Technologies</td><td>Cat# 30070</td><td></td></tr><tr><td>G-418</td><td>Sigma</td><td>Cat# A1720</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>Solarbio</td><td>Cat# G8061</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>Cat# 35050061</td><td></td></tr><tr><td>生长因子减少型 Matrigel</td><td>Corning</td><td>Cat# 354230</td><td></td></tr><tr><td>HE 染色试剂盒</td><td>北京易利精细化学品有限公司</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>Cat# 15630080</td><td></td></tr><tr><td>组织学笔</td><td>Zsbio</td><td>Cat#ZLI-9305</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素 B</td><td>Sigma</td><td>Cat# 400050</td><td></td></tr><tr><td>免疫组织化学染色试剂盒</td><td>ZSGB-BIO</td><td>PV-8000</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN</td><td>ATCC</td><td>CRL-3276; RRID:CVCL_DA06</td><td></td></tr><tr><td>N-2 添加剂</td><td>Gibco</td><td>Cat# 17502048</td><td></td></tr><tr><td>中性树胶&amp;nbsp;</td><td>Zsbio</td><td>Cat#ZLI-9555</td><td></td></tr><tr><td>Opal 5-色手动免疫组化试剂盒</td><td>PANOVUE</td><td>Cat# 10144100100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>MeilunBio</td><td>Cat#MA0015</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆抗 PD-L1 抗体</td><td>CST</td><td>Cat# 13684; RRID:AB_2687655</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗 Ki67 抗体</td><td>Abcam</td><td>Cat# ab16667; RRID:AB_302459</td><td></td></tr><tr><td>兔多克隆抗 KRT6A 抗体</td><td>Proteintech</td><td>Cat# 10590-1-AP; RRID: AB_2134306</td><td></td></tr><tr><td>羊血清</td><td>Zsbio</td><td>Cat#ZLI-9056</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>Cat# 12604021</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Cat#15400-054</td><td></td></tr><tr><td>全片图像扫描仪</td><td>Hamamatsu</td><td>Cat#C13210</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Selleck Chemicals</td><td>Cat# S1049</td><td></td></tr></tbody></table>

建立模拟食管组织从正常向癌变进展的类器官模型及其组织学分析

Establishment and Histological Analysis of Esophageal Organoids Modeling the Progression from Normal to Cancerous Tissues

类器官已成为推动肿瘤发生机制研究和癌症治疗理解的关键工具。通过构建代表不同肿瘤阶段的人类类器官模型，并进行组织学分析，可以更深入地理解肿瘤进展过程中细胞形态、空间结构以及关键分子标志物表达的变化。本研究提供了一套建立和培养食管鳞状细胞类器官的全面实验方案。此外，该方案还详细描述了利用固定、包埋和染色等技术，评估类器官内关键分子表达模式与空间分布的方法。通过该方案，研究人员发现了食管鳞状上皮细胞在肿瘤发生过程中其空间结构及多种肿瘤生物标志物表达的显著变化。该方案有助于类器官的构建及其组织学分析，使科研人员能够探究在肿瘤发生不同阶段及治疗干预过程中上皮细胞的空间架构与分子改变。

本方案描述了食管鳞状细胞癌（ESCC）肿瘤发生不同阶段的类器官取样与组织学分析（图1）。通过对 ESCC 患者的正常食管黏膜、低级别上皮内瘤变（LGIN）、高级别上皮内瘤变（HGIN）以及肿瘤组织进行取样，可构建代表肿瘤发生不同阶段的类器官。此外，对这些类器官进行石蜡包埋和切片，随后进行免疫荧光染色。
为研究肿瘤发生过程中免疫抑制分子的表达及细胞克隆的形态学特征，采集了食管上皮组织在肿瘤发育不同阶段的样本，并进行了免疫荧光染色。染色完成后，在扫描切片前为各标记物定义了四种伪彩色：PD-L1、Ki-67 和 KRT6A 分别被赋予绿色、红色和灰色的伪彩色，细胞核则用 DAPI 标记。实验结果表明，食管黏膜类器官的形态在肿瘤发生过程中发生变化，主要表现为结构更加紊乱。免疫荧光染色显示，随着肿瘤的发生发展，上皮细胞的增殖发生改变，并伴随免疫抑制分子（如 PD-L1）表达升高（图 2）。
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本方案描述了代表肿瘤进展不同阶段的食管类器官模型的建立及其组织学分析。该方法使研究人员能够研究从正常组织向癌变组织转变过程中细胞形态、空间结构以及分子标志物表达模式的变化。

类器官已成为推动肿瘤发生机制研究和癌症治疗进展的关键工具。通过构建人类类器官模型……

我们的研究聚焦于肿瘤的发生及早期 tumorigenesis。我们探讨正常细胞如何转变为肿瘤细胞，以及这些细胞如何改变其微环境以促进 tumorigenesis。目前，有多种技术被用于推动相关研究，包括干细胞技术、基因编辑技术、先进的三维培养系统与生物材料，以及单细胞和空间组学技术。我们面临的最大挑战是保持类器官无细菌和真菌污染。这些污染物常在组织处理和运输过程中侵入，往往导致培养失败。[指导教师] 首先，在4摄氏度下解冻基底膜基质和人食管类器官培养基。将组织样本转移至5毫升离心管中，然后用室温洗涤缓冲液清洗样本三次。使用无菌剪刀，在1.5毫升离心管中将组织剪切成1立方毫米大小的碎片。接着，将组织碎片悬浮于1毫升消化缓冲液中。在37摄氏度下以每分钟50至100转的速度振荡混合物10至20分钟，以消化组织。随后，在4摄氏度下以400×g离心5分钟。弃去上清液。将沉淀物重悬于500微升0.025%胰蛋白酶-EDTA溶液中。在37摄氏度下孵育10分钟。然后加入1毫升含10%胎牛血清的DMEM以终止酶活性。接下来，将悬液通过70微米无菌滤膜，并将滤液收集至1.5毫升离心管中。在4摄氏度下以400×g离心滤液5分钟。弃去上清液后，将细胞重悬于100微升H-EOCM中。重悬细胞后，使用细胞计数仪测定细胞密度。然后将每毫升5,000至15,000个细胞转移至新的1.5毫升离心管中。进行类器官接种时，将细胞轻轻重悬于50至100微升基底膜基质中。将50微升基质-细胞混合物滴加至24孔板每个孔的中央。在37摄氏度下孵育30分钟，使基底膜基质聚合。然后向每孔加入500微升预热的H-EOCM，覆盖基质。将培养板置于含5%二氧化碳的37摄氏度湿化培养箱中孵育。更换培养基时，吸除用过的旧培养基。向每孔补充500微升预热至37摄氏度的新鲜H-EOCM。对脱蜡并复水的类器官进行多重免疫荧光染色时，将羊血清封闭液滴加至置于湿盒中的载玻片上，完全覆盖类器官区域，并在室温下孵育30分钟。用含Tween的PBS洗涤载玻片2分钟。接下来，滴加稀释的一抗溶液以覆盖类器官区域。根据抗体要求，在湿盒中孵育。孵育结束后，在恒温腔中用PBS-T以每分钟80转的速度洗涤载玻片两次，每次2分钟。现在向类器官区域滴加二抗溶液，并在室温下的湿盒中孵育20分钟。孵育结束后，在恒温腔中用PBS-T以每分钟80转的速度再次洗涤载玻片两次，每次2分钟。将荧光染料溶液滴加至洗涤后的载玻片上，覆盖类器官区域，并再次孵育。孵育结束后，用PBS-T洗涤载玻片两次。对于多重染色，重复抗原修复和抗体封闭步骤。然后滴加DAPI溶液以覆盖类器官区域。将载玻片浸入无菌水中2分钟，以洗去多余的染料。加入抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，随后采集数字图像。通过KRT6A染色观察可见，类器官结构从正常到癌变阶段逐渐变得紊乱。PDL1的表达水平从正常食管黏膜到食管鳞状细胞癌逐步升高。

establishment-histological-analysis-esophageal-organoids-modeling

Research

科研

JoVE Journal

Cancer Research

癌症研究

食管类器官的建立和组织学分析模拟从正常组织到癌性组织的进展

本手稿描述了一种由正常原代人食管成纤维细胞和鳞状上皮细胞在脱细胞猪源支架内接种培养而构建的组织工程三维食管结构，介绍了其制备方法、表征结果及潜在应用。研究结果表明，该结构可形成成熟的复层上皮，类似于正常人食管组织。...

三维组织工程人食管黏膜模型的制备、表征及其潜在应用

本方案描述了食管腺癌类器官的传代培养和冷冻保存方法，包括使用和不使用单细胞消化的两种方式，以帮助研究人员根据实验设计选择合适的策略。...

食管腺癌类器官的传代培养与冷冻保存：单细胞消化的优缺点

本方案介绍了一种通过差速离心法从原代正常及肿瘤乳腺组织中生成上皮类器官的方法。此外，还包括对包埋类器官进行三维培养以及免疫荧光成像的操作说明。...

无需传代培养的小鼠与人正常及肿瘤乳腺组织上皮类器官的生成与成像

本方案描述了通过化学致癌方法诱导生成并表征小鼠口腔-食管三维类器官的关键步骤，这些类器官代表了正常、癌前病变及鳞状细胞癌病灶。...

建立三维类器官模型研究口腔-食管鳞状细胞癌

类器官-成纤维细胞共培养为研究提供了模型 体内...

利用类器官共培养对食管成纤维细胞进行功能表征与可视化

胃源性患者类器官在研究中的应用日益广泛，但目前尚缺乏从单细胞消化物出发、以标准化接种密度培养人胃类器官的正式方案。本方案提供了一种详细方法，可从上消化道内镜活检组织中稳定地构建胃类器官。...

建立和表征源自良性胃体与胃窦上皮活检组织的患者来源胃类器官

本文提供了一种人食管类器官及其气液界面培养的实验方案。食管类器官的气液界面培养可用于研究细胞因子对食管上皮屏障功能的影响。...

用于研究嗜酸性粒细胞食管炎上皮屏障的三维细胞培养模型

本方案描述了一种从同一食管鳞状细胞癌（ESCC）患者中同时分离癌类器官、癌相关成纤维细胞（CAFs）和非肿瘤相关成纤维细胞（CFs）的方法。使用这些来自同一患者的匹配样本可避免个体间差异带来的问题，为ESCC研究提供合适的实验平台。...

从同一食管癌患者建立肿瘤类器官、癌相关成纤维细胞及配对正常成纤维细胞

最近研究发现，骨肉瘤中的肿瘤干细胞（CSCs）与其发病机制相关。本文介绍了从常规骨肉瘤（OS）患者活检组织获得的原代细胞培养物中分离CSCs的方法，该方法基于CSCs在非黏附条件下生长的能力。...

建立人传统型骨肉瘤的肿瘤干细胞培养

需要一种动物模型来解析循环肿瘤细胞（CTCs）在癌症转移过程中促进肺部定植的作用。在此，我们建立并成功实施了一种体内检测方法，专门用于验证CTC表面聚合纤连蛋白（polyFN）组装对肺部定植的必要性。...

肺组织中循环肿瘤细胞可视化肺定植检测方法的建立

学习建立食管类器官模型并进行组织学分析，利用多重免疫荧光染色技术观察KRT6A和PDL1表达变化，研究从正常组织到癌性组织的肿瘤进展过程。该方法为肿瘤生物学研究提供重要工具。

建立模拟食管组织从正常向癌变进展的类器官模型及其组织学分析

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