March 28th, 2025
本报告描述了用于培养和实验纵单细胞链藻 Penium margaritaceum 的基本方法。它还提供了基于显微镜的成像的基本方案,包括使用单克隆抗体和其他荧光探针进行活细胞标记以及扫描电子显微镜检查。
我们的研究重点是细胞壁在维持细胞形状和响应外部压力方面的作用。我们使用一系列光学显微镜和共聚焦激光扫描显微镜技术对活细胞的细胞壁结构进行成像,并使用电子显微镜对细胞壁进行高分辨率成像。
目前缺乏表达特定亚细胞蛋白的链藻转化细胞系,以突出细胞壁动力学。然后,这需要使用抗体和其他荧光探针进行研究。Penium 的细胞壁对各种形式的非生物和生物胁迫做出反应,这导致表型可塑性。我们发现细胞壁果胶是这一过程的重要组成部分。单细胞表型和用 Penium 进行活细胞标记的能力为植物生物学家提供了深入研究细胞壁结构和发育的机会。
[导师]首先,取出五毫升活跃生长的玛格丽藤铅液态细胞培养物。转移到 15 毫升塑料离心管中,然后离心。倒出上清液后,将沉淀重悬于五毫升新鲜 WHM 中。紧紧固定管盖并剧烈摇动管 10 秒钟以重悬沉淀并去除细胞壁表面的任何细胞外聚合物物质。最后洗涤后,将沉淀重悬于一毫升新鲜WHM中,然后将200微升等分试样的细胞悬液转移到1.5毫升微量离心管中。在微量离心机中以1000G离心一分钟,然后吸出上清液并将沉淀重悬于400微升新鲜WHM中。接下来,将 20 微升稀释的单克隆抗体添加到细胞悬液中并涡旋良好。然后,用铝箔包裹试管,并在实验室旋转器上孵育 90 分钟。离心悬浮液,吸出上清液,并将沉淀重悬于 500 微升新鲜 WHM 中,然后涡旋 10 秒钟。最终离心后,将沉淀重悬于400微升WHM中,并加入8微升山羊抗大鼠TRITC或FITC。最后,将沉淀重悬于 100 微升生长培养基中。盖上管子并用铝箔包裹,直到准备好成像。在WHM中将用JIM5抗体标记的细胞稀释十倍。将 50 微升稀释的细胞悬液滴到盖玻片上。将细胞在黑暗中孵育两分钟以允许细胞粘附,然后小心地滴加一毫升 WHM 以冲洗掉任何未粘附的细胞。在附着的细胞顶部添加 30 微升 WHM。在液滴上 30 微升温热的 4% 琼脂糖在 WHM 中覆盖,让其凝固。对于培养皿中的样品,添加足够的WHM以完全覆盖琼脂糖包埋的细胞。对于盖玻片上的细胞,将盖玻片倒置并轻轻地将其放在充满 WHM 的凹陷玻片上。将准备好的细胞安装到荧光显微镜上。设置外部灯或使用显微镜的内置照明来支持细胞生长和运动。使用TRITC滤光片组每10至30分钟捕获一次图像,以跟踪细胞壁扩增。准备一个装有 5 毫升洗涤过的 10 至 14 天细胞培养物的试管。接下来,将约 100 微升 0.75 微米荧光珠加入 1.5 毫升微量离心管中。将一毫升WHM移液到试管中,用力摇晃以重悬珠子。将试管以 10,000 G 离心三分钟。将最终沉淀重悬于 500 微升 WHM 中。接下来,将一毫升WHM培养基移液到12孔板的每个孔中。添加抑制剂或生长调节剂以达到所需的浓度并轻轻旋转板。加入 10 微升珠子溶液并再次轻轻旋转以混合,然后在混合前向每个孔中加入 10 微升洗涤的细胞。将板在光照下孵育24小时。在不干扰板的情况下,将其放在配备FITC滤光片的倒置荧光显微镜上。将一毫升细胞悬液移出到 1.5 毫升微量离心管中。将试管以 4,000 G 离心一分钟。丢弃上清液后,将装有沉淀的试管放入液氮中或在零下80摄氏度下冷冻。将解冻的沉淀重悬于 20 微升 WHM 中。将一滴致密细胞悬液滴在尺寸为 45 x 50 毫米的盖玻片上。在水滴的顶部放第二个盖玻片以制作三明治。连续按压三明治 30 秒以破裂细胞。小心地将盖玻片分开。在盖玻片上加入WHM,将破裂的细胞洗涤到15毫升离心管中并离心。丢弃上清液后检查白色或微绿色的沉淀。 将含有细胞壁的沉淀重悬于去离子水中。细胞破裂和离心后,将沉淀重悬于 100 微升去离子水中,然后将其转移到 1.5 毫升离心管中。接下来,将碳带贴在剑桥短截线的表面。将五微升重悬的细胞壁悬液滴到碳带上。让短管干燥过夜后,使用钯靶溅射涂层 50 秒。在 5 千伏特的电压下观察细胞,适当的光斑尺寸位于距二次电子探测器 10 厘米处。用抗果胶单克隆抗体标记玛格丽松细胞壁,揭示了形成不规则晶格图案的钙络合纤维网络。果胶沉积在细胞中心或峡部,将较老的果胶推向两极。JIM7标记表明,高甲酯化果胶最初在峡部以窄带分泌。用单克隆抗体JIM13检测细胞壁中的其他聚合物,如阿拉伯半乳聚糖蛋白。细胞壁外分泌大量细胞外聚合物,实现滑动和细胞聚集。标记技术允许定量细胞壁和扩增研究,整合发育成像方法。相关结构研究表明,典型的果胶晶格由纤维网组成,这些纤维网以不同的突起向外部终止。如在 JIM5 标记细胞中观察到的那样,用高浓度钙处理将果胶晶格转化为不规则沉积物。在扫描电镜下检查钙处理的细胞壁时,详细观察到杂乱无章的果胶结构。
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本研究调查了单细胞绿藻Penium margaritaceum的细胞壁结构和功能,重点关注其对各种非生物和生物压力的响应。研究采用一系列显微镜技术来可视化细胞壁动态,并识别涉及表型可塑性的关键组分。
Microscopy-based immunocytochemical screening in Penium margaritaceum enables high-resolution analysis of plant cell wall dynamics under stress, supporting early-stage target validation in plant biotechnology. The unicellular model and quantitative imaging outputs facilitate mechanistic de-risking and predictive confidence for cell wall modification strategies. These protocols position R&D teams to interrogate cell wall responses with translational continuity from discovery to preclinical research.
These protocols integrate from early discovery through lead identification and preclinical validation in plant cell wall research pipelines.