En face 小鼠视网膜冷冻切片用于高维空间分子分析

视网膜是研究神经元计算的有用模型。这些计算依赖于细胞的特定位置。然而，对此的全面图谱仍难以获得。

在过去十年中，单细胞测序已对视网膜细胞类型提供了清晰的描述。如今，空间转录组学为在完整组织中利用这些描述提供了一种全新的方法。应用空间转录组学的一个关键挑战在于，其需要非常薄的组织切片。而我们所关注的视网膜在水平平面上本身已经非常薄。

通过发明这种制备薄而快速切片的方法，结合空间转录组学与机器学习技术，可在同一样本组织中绘制出所有视网膜神经节细胞的图谱。在过去30年中，仅完成了45种小鼠视网膜神经节细胞中的17种的图谱绘制，而该技术使我们能够一次性完成全部细胞类型的图谱绘制。

[讲师] 首先将一只已安乐死的小鼠放置在实验台上。在角膜上标记眼球的颞极以保持方向性，并为解剖创造一个薄弱点。将眼球浸入含有滤纸片的培养皿中的溶液中。使用尖头5号镊子和虹膜剪，仔细去除眼球上的所有肌肉、筋膜、血管和神经，注意不要刺穿巩膜。将其中一把虹膜剪的一个刀尖垂直于角膜缘定位。在此位置刺穿眼球。通过角膜和角膜缘做一次干净的切口，继续切至巩膜和视网膜，朝向视神经乳头。然后将刀片重新定位，使其垂直于初始切口，位置大约在角膜缘后方1毫米处。开始沿径向切开巩膜和视网膜。使用尖头镊子引导并旋转眼球，保持切割线在角膜缘后方且与之平行。如果视网膜与巩膜发生分离，应重新调整虹膜剪的位置，确保两者一同被切开。通过虹膜剪刀片的中段宽度估算1毫米的后移距离。完成与角膜缘平行的径向切口后，检查是否存在残留的视网膜连接。使用虹膜剪小心切断这些连接，直至眼球的前段与后段完全分离。接下来，使用两对尖头5号镊子轻轻分离眼球的前部和后部。在老年小鼠中，若晶状体与视网膜杯之间存在透明纤维连接，应使用虹膜剪小心切断这些纤维，同时尽量减少视网膜与巩膜的分离。以滤纸作为支撑平台，用虹膜剪将视网膜剪成三叶草形，也称为十字形（iron cross pattern）。对第二只眼睛重复上述解剖步骤。剪去一次性塑料移液管的尖端，使其开口大于解剖后的视网膜和巩膜。轻柔地用移液管吸取视网膜，并将其转移至玻璃载玻片上。使用实验室擦拭纸去除多余的灌注溶液，直至视网膜不再漂浮并可被展平。现在使用两把尖头5号镊子展开视网膜，使其平铺，内侧眼杯朝上。在每个三叶草形的叶片部分做0.5至2毫米长的松弛切口，以帮助展平并调整防止折叠。除紧邻视网膜的液体外，清除所有剩余的灌注溶液。使用盖玻片迅速按压并转移视网膜，使外侧巩膜朝上，内侧眼杯与盖玻片接触。确认视网膜无折叠，必要时进行调整。可添加灌注溶液辅助操作，但需用擦拭纸去除多余液体，防止卷曲，并让其在空气中干燥5至10秒。现在用OCT包埋剂覆盖视网膜。然后用镊子将OCT均匀铺展在盖玻片上，防止漂浮。使用被液氮蒸气冷却的金属板或直接接触干冰的方式，将视网膜在OCT中快速冷冻。将冷冻后的视网膜保存在干冰上以备立即使用。进行冷冻切片时，在样本夹头上制作一个OCT圆顶，若使用相同型号的冷冻切片机，应占据内侧2至3个环形区域。将样本夹头与切割面保持水平对齐。建立或记录夹头与冷冻切片机载物台之间的方向参照标记。然后修整OCT圆顶，形成一个与刀片平行的平整表面。用剃刀片从侧面去除多余的OCT，并小心地将视网膜从盖玻片上分离，使其可移动。将夹头从载物台上取下，在已准备好的平整OCT表面上滴加少量液态OCT。接着将视网膜直接放置在液态OCT上。使用预冷的玻璃载片按压并固定视网膜，直至其冻结。在视网膜和夹头上再添加更多OCT，以确保牢固粘合。然后将整个组件放入冷冻切片机的快速冷冻区域进行冷冻。开始切片前，小心修整多余的OCT，直至视网膜可见。使用剃刀片将OCT块边缘修整至靠近视网膜的位置。在修整过程中持续检查是否出现巩膜。当巩膜可见时，根据需要调整载物台角度。当巩膜在切片中分布基本均匀时，停止修整。现在使用预冷的载玻片和两把细毛刷操作切片并进行收集。将手指置于切片下方约5秒钟，使OCT融化并将组织牢固粘附于载玻片上。随后将载玻片放回低温表面重新冷冻。将制备好的载玻片保存在干冰上以备立即使用。在神经节细胞层中观察到明显的RBPMS免疫反应性，以及番茄凝集素标记的血管丛清晰分层，证实了视网膜层状结构和蛋白标志物的成功保存。使用12重RNA Scope探针组进行多重RNA检测，成功维持了空间结构，并揭示了Grm6和RBPMS等标志物在视网膜切片正面的特异性表达。高分辨率图像确认了RBPMS及其他标志物（如Mafb6和Meis2）在单细胞水平的表达模式，验证了神经节细胞层中蛋白和RNA的定位准确性。三叶草形切片中信号分布均匀，且在Xenium空间转录组数据中显示出强信号，表明高通量分析和RNA完整性均获得成功。使用Xenium进行的单细胞分辨率成像与人工检测模式一致，证明该方案在不同平台间具有良好的稳健性。细胞类型特异性转录标志物在视网膜横截面及正面图谱中呈现分层分布，并在不同深度上保持其空间位置。对神经节细胞层进行详细放大观察，进一步证实了空间转录信号检测结果与DAPI核染色的精确定位关系。