高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

在实验室中，我们致力于研究各种发育生物学问题。我个人更侧重于技术层面，致力于开发新的方法，以利用成像技术更有效地解答这些问题。秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域已成功采用多种技术，从CRISPR基因编辑、转录组学和蛋白质组学，到超分辨率显微镜技术，范围广泛。C. elegans 是一种卓越的模式生物，但在高分辨率活体观察的背景下仍面临挑战，通常需要对样本进行固定以获得最佳分辨率，而这反过来又限制了动物的存活能力。本实验方案提出了一种可用于长期观察 C. elegans 的成像方法，使研究人员能够在自身实验室中采用该技术，直接在活体内研究多种动态发育过程。在本实验室中，该方法已实现对器官形成的精细观察，例如在形态发生过程中，或从体细胞分裂直至成体发育的连续过程。此后，该方法已被众多实验室广泛采用，用于研究多种多样的发育过程。

[Presenter] 首先，将装置连接至支撑架，并将其安装在直立显微镜上。用去离子水填充一支注射器，然后连接一根23号针头和一段长约1英寸×16英寸的软管，软管末端接一个中空弯曲的钢针。用注射器中的去离子水充满软管，并将钢针插入阀门入口的穿孔中以连接软管。在将软管连接到芯片外电磁阀之前，取下注射器和针头。使用成像软件打开电磁阀，并对装置加压数分钟，以排出阀门中的所有空气。通过肉眼观察，若气液界面变暗并消失于PDMS材料中，则表明排气完成。使用成像软件关闭电磁阀。接下来，用过滤后的细菌溶液填充一支1毫升注射器，并在针头上连接一根30号针头和一段长约1英寸×32英寸的软管。推动推杆，使针头及相连的软管完全充满细菌溶液。然后使用镊子将1英寸×32英寸的软管直接插入微流控装置的食物入口，并将注射器放置于注射泵上。通过后部的拇指螺丝推动注射器推杆，使液体充满装置。用密封的钢针封闭线虫入口和出口，并利用调节螺丝施加额外压力，以去除装置中残留的空气。随后移除出口处的封闭钢针，并将废液容器连接至出口。推动注射器，确保废液容器连接正确且系统中无堵塞。从入口移除第二个封闭钢针，并推动注射器，直至线虫入口处出现少量液滴。然后使用一根23号针头，将一段长约15至20厘米的1英寸×16英寸软管连接至装有S-碱性缓冲液的1毫升注射器。在软管另一端连接一根直型23号钢针。用注射器中的S-碱性缓冲液充满针头和软管。接着，将软管末端的钢针插入含有线虫的管中，推动少量液体通过软管，确保其中无空气残留。将线虫吸入软管，但不要吸入注射器内。然后推动连接线虫的注射器，直至钢针末端出现少量液滴，再将钢针插入微流控装置的线虫入口。将装置置于低倍显微镜（5x或10x）或解剖显微镜下。调整装置位置，使入口位于视野一侧，而捕获通道入口的背面位于视野另一侧。轻轻推动线虫注射器的推杆。接着，将线虫推向通道阵列。当某一线虫正对通道时，将其推入通道，并对其他线虫重复此操作。在捕获足够数量的线虫后，将仍连接在线虫入口的注射器放置于显微镜载物台上，并在整个实验过程中保持该位置。若加载操作是在解剖显微镜下完成的，则将装置转移至成像显微镜。现在启动注射泵，以每小时1微升的预设速率运行0.5微升。编程设定注射泵：先以每小时1微升的流速运行0.5微升，随后流速增加至每小时100微升并运行0.5微升，该流动模式在整个实验过程中重复进行。将装置放置于显微镜载物台上，并确保其固定牢固。切换至所需的成像放大倍数。在捕获通道阵列中识别目标线虫及感兴趣区域，并设置所需的成像条件。在设定的成像条件下进行成像，在图像采集前10秒通过电磁阀激活芯片上的阀门，使线虫固定在原位。由于采用了170微米厚的盖玻片，该微流控装置在多种显微成像模式下均保持了高成像质量，包括明场、落射荧光、转盘共聚焦以及超分辨率成像方法。从早期L1至中期L2幼虫阶段，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）上皮细胞的发育过程得以清晰观察。从晚期L1至早期L4幼虫阶段，初级退化型阴门前体细胞的诱导及其后续分裂过程明显可见。阴门形成的各个阶段从早期L3持续至成虫期。通过图像去卷积和图像配准技术对获取的图像进行增强处理，显著提高了视觉清晰度。所有线虫中观察到的细胞分裂均以一致且准时的方式发生，所有分裂均在典型的幼虫阶段持续时间内完成。在L2和L3阶段，性腺长度稳定增长，且由于线虫呈直线排列，实现了可重复的精确测量。