Name: 所有幼虫阶段的高分辨率 秀丽隐杆线 虫成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: 学习使用微流控技术对秀丽隐杆线虫进行高分辨率活体延时成像的方法，观察从L1幼虫到成虫阶段的动态发育过程，包括器官形成和细胞分裂等关键生物学事件。

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我们感谢Hajnal实验室的成员对本文手稿提出的宝贵讨论和意见。我们还感谢由美国国立卫生研究院研究基础设施项目（P40 OD010440）资助的 C. elegans 遗传学中心（CGC）。此外，我们感谢Galli实验室（Hubrecht研究所）、Conradt实验室（伦敦大学学院）以及van den Heuvel实验室（乌得勒支大学）对本方案提供的有益建议。本研究得到了瑞士国家科学基金会（项目编号31003A-166580）对AH的资助、瑞士癌症联盟（项目编号4377-02-2018）对AH的资助，以及苏黎世联邦理工学院对AdM的资金支持。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 器件制备
注意：所有器件均采用以下方案制备，但也可直接向作者获取。每种器件类型均在独立的晶圆上制备，每个器件晶圆由两层不同高度的 SU8 材料构成（即食物层和捕获层）。阀门晶圆在另一独立晶圆上制备，仅使用单一高度的 SU-8 材料，并省略步骤 1.3–1.6。硅烷具有毒性并会释放腐蚀性蒸气，因此该步骤必须在通风橱中进行。有关制备工艺的详细信息，请参见 Berger 等人18。
<ol>
	<li>使用空气等离子体清洁晶圆。</li>
	<li>旋涂第一层 SU8，然后在 95 °C 下进行预烘。</li>
	<li>曝光第一层，随后在 95 °C 下进行后烘并显影。</li>
	<li>晶圆显影并干燥后，再次进行等离子体清洁。</li>
	<li>旋涂第二层 SU8，然后在 95 °C 下进行预烘（如有必要，可先在 65 °C 下进行初始烘烤）。</li>
	<li>利用晶圆两侧的对准标记，将第二层掩模与已有结构精确对准，然后曝光第二层。</li>
	<li>进行后烘并显影晶圆，随后在 200 °C 下进行硬烘。</li>
	<li>用三甲基氯硅烷处理晶圆至少 2 小时。</li>
	<li>准备 20 g PDMS 预聚物（A 组分），并彻底混合 1 g 交联剂（比例 20:1，B 组分）（参见 材料表）。</li>
	<li>脱气 10 分钟，或直至所有气泡消失。</li>
	<li>取出 2 mL PDMS 混合物，留作步骤 1.13 使用。</li>
	<li>向剩余的 PDMS 混合物中再加入 3 g 交联剂，并充分混合（最终比例约为 5:1）。</li>
	<li>使用 20:1 的 PDMS 混合物，在器件晶圆上以 750 rpm 旋涂 30 秒。</li>
	<li>将阀晶圆放入铝制培养皿中，并浇注 5:1 的 PDMS。对器件晶圆脱气约 10 分钟。脱气后，用移液器去除残留气泡。</li>
	<li>将阀层和器件层分别在 70 °C 下烘烤约&#160;15/20 分钟。</li>
	<li>用移液器尖端或镊子轻轻探触，评估器件层和阀层的固化程度。阀层应已固化，而器件层应仍略有黏性。</li>
	<li>将阀层剥离，并使用手术刀或剃刀片修剪至所需尺寸。</li>
	<li>在阀通道上打一个接入孔（20 号针头）。</li>
	<li>将器件晶圆置于配备顶部照明的体视显微镜下。</li>
	<li>小心地将含有阀层的 PDMS 片段放置在器件晶圆上。</li>
	<li>精确对准阀层与器件层的结构，确保完全排除层间夹带的空气。</li>
	<li>将组装好的器件转移至烘箱，并在 70 °C 下烘烤过夜。</li>
	<li>将器件从晶圆上剥离。</li>
	<li>打穿所有剩余的接入孔（20 号针头）。</li>
	<li>使用空气等离子体将 PDMS 键合到盖玻片上，然后将键合后的器件置于 70 °C 烘箱中数小时。</li>
</ol>
2. 线虫制备
注意：本节描述通过漂白法进行线虫制备，该方法可获得大量（数百条）同步化线虫。其他同步化方法（如手动挑取）也可行，但通常更耗时且劳动强度较大。本实验方案中所用线虫均按照标准操作程序在20 °C条件下培养，置于接种有大肠杆菌OP50的NGM平板上维持培养。 E. coli OP50
<ol>
	<li>从含有大量怀卵动物的平板开始。</li>
	<li>使用 M9 缓冲液将动物从平板上冲洗下来。</li>
	<li>向线虫悬浮液中加入 5% 次氯酸钠（NaClO）和 5 M 氢氧化钠（NaOH）（每 1 mL 线虫悬浮液加入 200 µL 次氯酸钠和 100 µL 氢氧化钠）。</li>
	<li>轻轻振荡漂白混合液，直至动物开始解体（约 10 分钟）。</li>
	<li>在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>用移液器移除上清液，并加入等体积的新鲜 M9 缓冲液。</li>
	<li>再次在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>移除上清液，将沉淀的线虫转移至含有 5 mL 新鲜 M9 缓冲液的 15 mL 离心管中。</li>
	<li>在 20 °C 下振荡过夜。</li>
	<li>将线虫悬浮液通过 10 µm 细胞筛过滤。</li>
	<li>在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用等体积的 M9 缓冲液重悬线虫。</li>
	<li>再次在室温下以 1300 × g 离心 1 分钟。</li>
	<li>移除上清液，将线虫转移至 NGM 平板。若需要 L1 幼虫，请立即使用。</li>
	<li>当线虫达到所需发育阶段后，使用经 0.2 µm 滤膜过滤的新鲜 S-Basal 缓冲液将其从平板上冲洗下来。</li>
	<li>让线虫通过重力沉降，或在室温下以 750 × g 离心 1 分钟形成沉淀。</li>
	<li>弃去上清液，加入等体积的新鲜 S-Basal 缓冲液。</li>
	<li>重复沉降或离心步骤（步骤 2.16 和 2.17）。</li>
	<li>移除上清液，加入等体积的新鲜 S-Basal 缓冲液。</li>
	<li>最后进行一次沉降或离心操作。</li>
	<li>移除大部分上清液。</li>
	<li>将线虫保留在离心管中，直至实验开始。</li>
</ol>
3. 细菌制备
注意：芯片上可使用不同的细菌菌株（例如 OP50、NA22、HT115 等）。根据细菌密度的差异，调整加入食物混合物中的密度梯度介质的比例。所有缓冲液均需通过 0.2 µm 滤膜过滤，以去除颗粒物。
<ol>
	<li>准备40 mL LB培养基，可分装为2 × 20 mL至离心管或无菌锥形瓶等容器中。</li>
	<li>从保存平板上挑取细菌接种至LB培养基中。</li>
	<li>在37 °C条件下振荡培养过夜（约16小时）（OD600 = 1.9）。</li>
	<li>在3000 × g 条件下离心10分钟，收集细菌。</li>
	<li>弃去上清液，向每管中加入2 mL新鲜S-Basal缓冲液，合并所有管中的菌液。</li>
	<li>使用移液器通过机械方式重悬细菌。</li>
	<li>在3000 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，再次向每管中加入2 mL新鲜S-Basal缓冲液。</li>
	<li>使用移液器通过机械方式重悬细菌。</li>
	<li>在3000 × g 条件下离心5分钟。</li>
	<li>尽可能彻底去除上清液，加入1 mL新鲜S-Basal缓冲液，并通过机械方式重悬全部细菌。</li>
	<li>将0.60 mL密度梯度介质、0.38 mL含1%（质量分数）Pluronic F-127（一种非离子型三嵌段共聚物，本文简称为PF）的S-Basal缓冲液与1 mL OP50细菌悬液混合；或使用0.65 mL密度梯度介质、0.33 mL含1%（质量分数）PF的S-Basal缓冲液与1 mL NA22或HT114细菌悬液混合。</li>
	<li>使用涡旋振荡器充分混匀食物制备液。</li>
	<li>通过5 µm或10 µm细胞滤筛过滤食物。当使用较小装置（如L1装置）时，建议使用更小孔径的滤筛。 
	注意：食物可在室温下保存最多2天。</li>
</ol>
4. 芯片制备
注意：设备、管路和连接的示意图参见图2。所有缓冲液均需通过0.2 µm滤膜过滤，以去除灰尘。后续步骤中提到的钢针是一种短的中空管，用于将较大外径的管路（1/16&#34;）与在PDMS装置中加工出的小直径孔连接。这些钢针只需插入管路的内径中，然后推入PDMS材料内，即可有效实现两者的连接。
<ol>
	<li>首先用去离子水（DI 水）填充注射器。</li>
	<li>安装一个 23 G 针头和一段较长的 1/16&#34; 管路，管路末端连接一根空心钢针（弯成 90° 角）。管路长度应足以从电磁阀延伸至显微镜载物台。</li>
	<li>用注射器将去离子水注入管路中，并通过将钢针插入打孔处，将管路连接至阀门入口（图 2A，J）。</li>
	<li>取下注射器和针头，然后将管路连接至芯片外的电磁阀（图 2A，J）。</li>
	<li>使用成像软件打开电磁阀，并对装置加压数分钟，以排出阀门中的所有空气。通过肉眼观察芯片上的气-水界面来确认是否完成：界面应呈暗色并消失于 PDMS 材料中（图 2B）。</li>
	<li>关闭电磁阀（图 2C）。</li>
	<li>用过滤后的细菌溶液填充一支 1 mL 注射器（约 0.5 mL 食物已足够）。</li>
	<li>在注射器上安装一个 30 G 针头，并连接一段较长的 1/32&#34; 管路。</li>
	<li>推动推杆，使针头和连接的管路完全充满液体，确保注射器和管路中无残留空气。</li>
	<li>使用镊子将 1/32&#34; 管路直接插入微流控装置的食物入口，以防止管路损坏（推荐使用 SMD 镊子）（图 2D，K）。</li>
	<li>将注射器安装到注射泵上（图 2D）。</li>
	<li>使用注射泵后部的螺钉推动注射器推杆，使液体充满装置。每个开放连接处应出现液滴（图 2D，箭头）。</li>
	<li>用密封钢针封闭线虫入口和出口（将一段短的 1/16&#34; 管路连接至钢针，并通过灼烧密封）（图 2E，L）。</li>
	<li>使用螺钉施加额外压力，以去除装置中残留的空气（图 2E，箭头）。</li>
	<li>移除出口处的封闭钢针，并连接废液收集容器（由冻存管或微量离心管制成，盖子上插入两根钢针并用胶水固定）。使用一段短的 1/16&#34; 管路连接废液容器，一端连接容器，另一端连接一根弯成 90° 的空心钢针（图 2F，G，M）。</li>
	<li>推动注射器，确保废液容器连接正确且系统中无堵塞。为此，通过系统推动少量液体（旋转注射泵上的螺钉），直至液体流经废液管路（图 2G，箭头）。</li>
	<li>移除第二个封闭的钢针。</li>
	<li>推动注射器，直到线虫入口处出现一小滴液体（图 2H，N）。</li>
	<li>使用 23 G 针头，将一段较长的 1/16&#34; 管路（15–20 cm）连接至装有 S-Basal 缓冲液的 1 mL 注射器（图 2H，N）。</li>
	<li>在管路的另一端连接一根直的 23 G 钢针。</li>
	<li>用注射器中的缓冲液填充针头和管路，确保注射器和管路中无残留空气。</li>
	<li>将管路末端的钢针插入含有线虫的管中。</li>
	<li>推动少量液体通过管路，确保无空气残留。</li>
	<li>将线虫吸入管路中，但不要吸入注射器内。</li>
	<li>推动连接线虫的注射器，直到钢针末端出现一小滴液体（图 2H）。</li>
	<li>将钢针插入线虫入口（图 2I）。 
	注意：装置准备可在最终线虫处理前完成，并将其留在显微镜上，直至线虫准备好。</li>
</ol>
5. 线虫加样与成像
<ol>
	<li>将装置置于显微镜低倍镜（5倍或10倍）下或体视显微镜上。</li>
	<li>确认当前正在使用的装置单元，并在明场照明下找到线虫入口。</li>
	<li>调整装置位置，使入口位于视野一侧，而捕获通道入口的后端位于视野另一侧。</li>
	<li>轻轻推动线虫注射器的活塞。液体将明显从入口经通道阵列流向出口。由于细菌的存在以及密度梯度介质的加入导致折射率差异，液体流动清晰可见。</li>
	<li>确保线虫从入口出现，并向通道阵列后端流动。</li>
	<li>轻柔地将线虫推向通道阵列。当线虫头部对准通道时，将其推入通道，并对其他线虫重复此操作。 
	注意：为便于取食，线虫需保持头部朝向出口方向。可通过推动或回抽活塞以及利用线虫自身的游动来调整其方向。</li>
	<li>当足够数量的线虫被捕获后，将仍连接着线虫入口的注射器放置于显微镜载物台上，并在整个实验过程中保持该状态。为释放可能积聚的压力，可短暂将线虫导管从注射器上拆下，随后小心地重新连接至钝针头。</li>
	<li>若装载操作是在体视显微镜上完成的，则将装置转移至成像显微镜。导管可保持连接在芯片上，同时将注射器连接至泵。</li>
	<li>开启注射泵，以预设速率1 µL/h运行0.5 µL，随后将速率提高100 µL/h运行0.5 µL，再恢复至1 µL/h。该循环将在整个实验过程中自动重复。有关泵的编程操作，请参阅设备的用户手册。</li>
	<li>将装置放置于显微镜载物台上，并确保其被牢固固定（固定装置的建议可参见图3A）。</li>
	<li>若装载未在成像显微镜上进行，则需在低倍镜下识别目标装置单元。</li>
	<li>切换至所需的成像放大倍数。 
	注意：该装置适用于所有类型的物镜。</li>
	<li>在捕获通道阵列中识别目标线虫及感兴趣区域，并设置所需的成像条件。</li>
	<li>在设定的成像条件下进行成像，成像前10秒通过电磁阀驱动芯片上的阀门，使线虫固定在原位。 
	注意：驱动芯片上的阀门会使线虫被拉长并压平，可能需要调整成像的感兴趣区域（ROI）。</li>
</ol>
6. 实验准备
注意：本节涉及设备控制机制的初始准备工作，无需在每次实验前重复进行。请参考 图3B，C由于许多电磁阀需要较高的电压，因此电磁阀很可能不会直接连接到微控制器上 通过 继电器或MOSFET（参见 图 3C).
<ol>
	<li>确定一个加压空气源（例如，墙壁供气装置或气体钢瓶）。</li>
	<li>使用6 mm管路将压力源连接至合适的压力调节器（压力范围0-2 bar）（墙壁气源），或直接将合适的调节器连接至气体钢瓶。</li>
	<li>使用6 mm管路将压力调节器连接至电磁阀的输入端（参见图3B）。</li>
	<li>将电磁阀尽可能放置在靠近显微镜载物台的位置（建议距离载物台约0.5-1 m，但根据需要也可更远）。</li>
	<li>将电磁阀通过电子方式连接至选定的控制器。可选方案包括使用独立的微控制器板（例如Arduino）或现有的数据采集卡（DAQ）进行控制。</li>
</ol>
7. 清理与储存
<ol>
	<li>实验完成后，将装置从显微镜上取下。</li>
	<li>清除浸没液体。浸油可用有机溶剂（如丙酮、甲醇等）去除。</li>
	<li>将装置放置在平坦表面上，并断开所有管路，仅保留阀门管路。为安全断开每根管路，请在靠近管路的PDMS处向下按压，然后轻轻拉出。切勿抬起或弯曲装置，以免盖玻片破裂。</li>
	<li>用70%乙醇清洁PDMS表面。</li>
	<li>将装置在室温下保存，并保持阀门管路连接。 
	注意：该装置可重复使用，直至所有单元均被使用，期间通常无需重新填充阀门管路。然而，阀门管路中的水会在长时间存放后蒸发，最终可能需要重新加水。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在竞争性或经济利益冲突。

本文介绍了一种独特的微流控长期成像平台的操作方法，该平台适用于对多种发育过程进行高分辨率成像与追踪 秀丽隐杆线虫 在整个四个幼虫阶段直至早期成虫阶段18随时间推移追踪发育过程的能力 体内，使用此成像方法及其他方法，已在多个研究领域中变得不可或缺 秀丽隐杆线虫 研究，并使得过去无法解决的问题得以解答23,24,29.
与使用琼脂垫的传统成像方法以及先前发表的基于微流控的长期成像策略相比，该方法在整个实验过程中保持了线虫的身份和方向性，从而能够随时间追踪复杂的发育过程。无论发育阶段如何，动物均被限制在41个平行捕获通道之一中，每个通道连接到芯片上的食物供应，并由一个大型液压阀覆盖。所有被捕获的线虫通过液压阀的膨胀实现固定，在仅需成像时将线虫压在盖玻片上。由于捕获通道阵列间距紧密，单个视野内可同时观察多个动物，从而实现高通量成像。该长期成像装置适用于大多数显微镜系统，仅需极少的额外硬件（低于1000美元），且无需对现有设备进行任何改装。装置的操作设计得有意简化，所有用户均可通过遵循上述方案及结果描述快速掌握其使用方法。
简而言之，可在芯片上对动物进行成像，覆盖长达2.5个幼虫阶段图1C）。动物首先进行同步化处理，随后直接上样到芯片上（L1装置），或接种至NGM平板并培养至所需发育阶段（L1-L4和L2-A装置）。芯片上的动物通过高浓度细菌悬浮液喂食，并利用成像软件控制的芯片内液压阀进行固定。图1B）。使用注射器将动物引入捕获通道，小心调整动物方向，使其头部朝向食物供应端，最终将动物困在捕获通道的末端（图1A 和 图2）。必须小心操作，确保注射器、钝针和管路中无空气残留，因为气泡会轻易干扰动物的位置。这些装置可与大多数成像模式兼容18,19,24，由于PDMS材料具有高度透明、无荧光特性，并且与一层薄盖玻片密封结合（图4, 补充视频1，补充视频2 和 补充视频 3然而，在选择成像条件时必须谨慎，因为长时间曝光和高强度激发会显著影响动物的存活率，并导致荧光漂白。
除了本文介绍的成像方法版本外，该实验方案还可进行多种修改，其中一些修改已可实现。最直接的修改是替换标准细菌菌株，例如使用表达RNA干扰（RNAi）的细菌18或具有不同营养成分的细菌32。通过调整Optiprep的含量以补偿菌体密度的差异，可轻松实现菌株更换。类似地，可在细菌食物中添加多种化合物，例如生长素（auxin）、营养物质或小分子药物化合物，并直接在活体（in vivo）中观察其效应，而无需对实验方案进行任何修改。特别地，已开发出一种培养基交换装置，用于实现生长素诱导的蛋白质降解，或适用于需要定时或可逆暴露的任何其他应用；该装置通过在原有设计中增加一个食物入口实现，无需改变装置的几何结构或操作方式。新增的入口允许在两种不同条件之间进行简单切换（例如有生长素与无生长素），其连接方式与本文中单食物源的连接方式相同，相应的变化可被直接观察。此外，还开发了其他装置变体，其中每个单元拥有独立的液压阀，而非多个单元共用一个阀门，从而可在同一装置内独立地对多种条件进行成像，减少因长时间阀门操作和图像采集可能带来的不利影响。最后，除了Berger等人最初描述的装置变体18之外，还开发了两种新的装置变体：L3-A和L4-A（本文首次介绍），可实现从中L3期或中L4期直至成虫期的连续成像。这些修改的目的是将实验起始时间推迟至更晚的幼虫阶段，以便在无需关注早期发育阶段的研究应用中，能够加载体型更大的动物进行实验。

C. elegans 的成像可根据应用需求、通量和分辨率要求采用多种方式进行。当需要高分辨率时，标准方法是使用琼脂垫1,2,3，其结构简单，由载玻片、琼脂糖和盖玻片组成。线虫在这些载玻片上通过盖玻片施加的压力被固定。为进一步提高固定效果，可添加麻醉剂，例如左旋咪唑或叠氮化钠1,2，从而使琼脂垫上的线虫完全静止，适用于高分辨率成像，包括多种超分辨率成像方法2。然而，已知琼脂垫会影响线虫的发育进程，较高的压力结合麻醉剂可能导致发育延迟或完全发育停滞4,5。
除了这些标准方法外，近年来还出现了一些微流控技术，每种方法都有其各自的优缺点或特定的应用场景6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19。例如，Gritti 等人20提出了一种将线虫限制在较大腔室内的方法。将胚胎置于这些腔室内后，可在显微镜的指定观察区域内自由发育和移动。尽管该方法总体上有效，但仅适用于明亮的荧光标记物。最近，Keil 等人21提出了该方法的改进版本，通过在芯片上集成液压阀，在图像采集期间固定动物，从而克服了原始方法的一些局限性。然而，由于这两种方法所使用的腔室均大于用于固定线虫的腔室，动物在整个实验过程中仍会持续移动和旋转。因此，追踪发育过程变得困难，需要进行大量图像后期处理以校正动物的运动。
为解决这些局限性，本研究采用了 Berger 等人18提出的方法（图1），该方法不将动物置于大型腔室中，而是将其饲养在一种专门设计的捕获通道内，适用于发育时间窗较短的动物（最多涵盖2.5个幼虫阶段）。与现有的微流控方法不同，该方法在整个实验过程中保持了动物的朝向和个体身份，并可在单个装置内同时对多个线虫在多个幼虫阶段进行高分辨率成像。
利用一种特殊的通道结构来固定动物，该通道的高度在实验开始时接近动物的厚度，从而防止其发生旋转。通道的宽度和长度经过选择，使动物能够在其中活动并随时间生长，便于蜕皮以及从一个幼虫阶段过渡到下一个阶段。通过将多个捕获通道并排排列，即可实现并行化操作，使得在单个视野（FOV）中可同时观察多个动物。 图1A'），单个设备单元最多可对41只动物进行成像（图1A芯片上的动物持续获得高浓度的细菌食物悬浮液 通过 一个低高度通道，同时有助于将动物限制在捕获通道阵列末端（高度台阶， 图1A，红色）。与 Keil 等人采用的方法类似。21，采用了一种大型液压片上阀门，可在图像采集期间充气，将动物压向盖玻片，从而增强动物的固定效果（图1B）。将液压阀的驱动限制在图像采集期间，可最大限度地减少对动物发育的不利影响，确保所有幼虫阶段的发育均可靠。与Gritti等人描述的方法不同20 和 Keil 等人21，无法在同一装置中对动物整个 post-embryonic 发育阶段进行成像。相反，本研究引入了五种不同的装置，分别称为 L1、L1-4、L2-A、L3-A 和 L4-A，它们分别覆盖 L1 全阶段及早期 L2 阶段、中期至晚期 L1 至中期 L4 阶段、中期至晚期 L2 至年轻成虫期、中期至晚期 L3 至年轻成虫期，以及晚期 L4 至年轻成虫期（图1C），从而实现对胚胎后发育大部分过程的连续成像。采用该方法的原因在于动物从L1期到成体的体型增长显著：若通道尺寸仅适合L1期动物，则对成体而言过小，会导致发育停滞；而若通道尺寸适合成体，则对L1期动物而言过大，将导致过度移动、旋转以及动物逃逸出捕获通道。
采用这种方法，可实现多种组织可靠的发育进程记录18，例如表皮的胚后发育（L1至L4阶段）、外阴细胞命运的诱导（L2和L3阶段）、外阴形态发生（L3至成虫期19）以及锚定细胞的侵袭过程。自问世以来，这些长期成像装置已被用于研究多种生物学过程22,23，该平台甚至已与AiryScan超分辨率显微技术相结合24，实现了此前无法完成的多项重要发现。
下文将逐步介绍这些长期成像设备的操作步骤，重点说明系统搭建过程中的预期结果以及可能遇到的一些挑战。

<table><tbody><tr><td>3/2 电磁阀&amp;nbsp;</td><td>Distrelec</td><td>154-22-898 和 154-22-899</td><td>上述替代品。连接压力调节器与芯片上阀门的电磁阀。</td></tr><tr><td>Arduino</td><td>Distrelec</td><td>301-01-956</td><td>可选微控制器，取决于所选控制器和接口。</td></tr><tr><td>Bacto-胰蛋白胨</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>211705</td><td>用于LB培养基的制备。</td></tr><tr><td>Bacto-酵母提取物</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>212750</td><td>用于LB培养基的制备。</td></tr><tr><td>23G平头针头</td><td>Gonano Dosiertechnik</td><td>GGA723050&amp;nbsp;</td><td>连接1/16&quot;管路与注射器的平头针头。</td></tr><tr><td>30G平头针头</td><td>Gonano Dosiertechnik</td><td>IG-TE730050</td><td>连接1/32&quot;管路与注射器的平头针头。</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 构建体 1</td><td>NA</td><td>NA</td><td>AH5786 LGI: hmr-1(cp21[hmr-1::gfp + LoxP]) Marston, D.J. 等. MRCK-1 drives apical constriction in C. elegans by linking developmental patterning to force generation. Curr. Biol. 26 (16), 2079-2089. 2016.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 构建体 2</td><td>NA</td><td>NA</td><td>AH1187 LGII: arIs92[egl-17::cfp] Yoo, A.S., Bais, C., Greenwald, I. Crosstalk between the EGFR and LIN-12/Notch pathways in C. elegans vulval development. Science. 303 (5658), 663-666. 2004.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 构建体 3</td><td>NA</td><td>NA</td><td>AH5786 LGV: qyIs50[Pcdh-3&gt;mCherry::moeABD, unc-119(+)] Ziel, J.W., Hagedorn, E.J., Audhya, A., Sherwood, D.R. UNC-6 (netrin) orients the invasive membrane of the anchor cell in C. elegans. Nat. Cell Biol., 11 (2), 183-189. 2009.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; 构建体 4</td><td>NA</td><td>NA</td><td>ML2615 LGX: dlg-1(mc103[dlg-1::gfp]) Vuong-Brender, T.T.K., Suman, S.K., Labouesse, M. The apical ECM preserves embryonic integrity and distributes mechanical stress during morphogenesis. Development. 144 (23), 4336-4349. 2017.</td></tr><tr><td>电缆</td><td>Distrelec</td><td>143-46-644</td><td>若选择Distrelec的电磁阀则需要。连接电磁阀与MOSFET的电缆。</td></tr><tr><td>三甲基氯硅烷&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>386529-25ML</td><td>用于晶圆钝化的硅烷。</td></tr><tr><td>胆固醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td>用于&amp;nbsp;S-基础缓冲液的制备。</td></tr><tr><td>续流二极管</td><td>Distrelec</td><td>110-52-628</td><td>保护微控制器的续流二极管。</td></tr><tr><td>空心钢针</td><td>Gonano Dosiertechnik</td><td>GGA7R23050&amp;nbsp;</td><td>23G空心钢针，用于连接1/16&quot;管路与装置。</td></tr><tr><td>LB培养基</td><td>NA</td><td>NA</td><td>按标准配方自制。10 g Bacto-胰蛋白胨，5 g Bacto-酵母提取物，5 g NaCl，加水至1升，用1 M NaOH调节pH至7.0。</td></tr><tr><td>长期成像装置 L1</td><td>NA</td><td>NA</td><td>适用于L1至早期/中期L2幼虫的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。</td></tr><tr><td>长期成像装置 L1-4</td><td>NA</td><td>NA</td><td>适用于中期L1至中期L4幼虫的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。</td></tr><tr><td>长期成像装置 L2-A</td><td>NA</td><td>NA</td><td>适用于中期L2至成虫期（外翻）的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。</td></tr><tr><td>长期成像装置 L3-A</td><td>NA</td><td>NA</td><td>适用于中期L3至成虫期（外翻）的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。</td></tr><tr><td>长期成像装置 L4-A</td><td>NA</td><td>NA</td><td>适用于中期L4至成虫期（外翻）的长期成像装置。自制，可应要求提供。也可提供培养基交换型变体。</td></tr><tr><td>M9缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>按标准配方自制。</td></tr><tr><td>MOSFET</td><td>Distrelec</td><td>303-41-391</td><td>金属氧化物半导体场效应晶体管，用于切换电磁阀所需的24V直流电。</td></tr><tr><td>NGM平板</td><td>NA</td><td>NA</td><td>按标准配方自制。</td></tr><tr><td>尼龙鲁尔接头</td><td>Fisher Scientific</td><td>11776048</td><td>将外径6 mm管路连接至23G平头针头的适配器。</td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td>密度匹配液体。</td></tr><tr><td>PDMS</td><td>Ameba</td><td>Elastosil RT601A/B</td><td>PDMS弹性体试剂盒。</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td>非离子型表面活性剂。</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.37039</td><td>用于&amp;nbsp;S-基础缓冲液的制备。</td></tr><tr><td>磷酸氢二钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.05099</td><td>用于&amp;nbsp;S-基础缓冲液的制备。</td></tr><tr><td>24V直流电源</td><td>Distrelec</td><td>301-63-304</td><td>24V直流电源。选择适合所用电磁阀的电源。</td></tr><tr><td>精密压力调节器</td><td>Distrelec</td><td>154-23-578</td><td>上述替代品。压力调节器。</td></tr><tr><td>G1/8压力表</td><td>Distrelec</td><td>154-23-643</td><td>连接至压力调节器的压力表。</td></tr><tr><td>聚氨酯管 外径6 mm</td><td>Distrelec</td><td>154-23-866</td><td>连接压力源与调节器，以及调节器与电磁阀的管路。</td></tr><tr><td>G1/8转6 mm快插接头</td><td>Distrelec</td><td>301-69-330</td><td>上述替代品。两个快插接头连接至压力调节器并接6 mm管路。</td></tr><tr><td>M5转6 mm快插接头</td><td>Distrelec</td><td>301-69-459</td><td>两个快插接头连接至电磁阀和6 mm管路。</td></tr><tr><td>S-基础缓冲液</td><td>NA</td><td>NA</td><td>按标准配方自制。5.85 g NaCl，1 g K2HPO4，6 g KH2PO4，1 ml 胆固醇（5 mg/ml 乙醇溶液），加水至1升。通过高压灭菌进行灭菌。</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td>用于LB培养基和S-基础缓冲液的制备。</td></tr><tr><td>氢氧化钠（5M）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>567530</td><td>用于C. elegans漂白的氢氧化钠（配制5M浓度溶液）</td></tr><tr><td>次氯酸钠（5%）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.05614</td><td>用于C. elegans漂白的次氯酸钠（配制5%浓度溶液）</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;m筛网</td><td>pluriSelect</td><td>43-10010-40</td><td>细菌食物制备的替代品，尤其适用于较小装置。</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;m筛网</td><td>pluriSelect</td><td>43-10005-40</td><td>用于过滤过夜饥饿后的L1幼虫以及完成食物制备后的细菌。</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Gersteltec</td><td>GM1050</td><td>适用于1-10 &amp;micro;m高度的SU-8。</td></tr><tr><td>SU-8</td><td>Gersteltec</td><td>GM1060</td><td>适用于5-30 &amp;micro;m高度的SU-8。</td></tr><tr><td>SU-9</td><td>Gersteltec</td><td>GM1070</td><td>适用于15-200 &amp;micro;m高度的SU-8。</td></tr><tr><td>1 mL注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>11338763</td><td>1 mL注射器。若使用不同类型，请确保注射器筒体和推杆足够坚固，不会被注射泵压变形。</td></tr><tr><td>注射泵</td><td>WPI</td><td>Al1000-220</td><td>注射泵（https://www.wpiinc.com/var-2300-aladdin-single-syringe-pump.html）。</td></tr><tr><td>15 mL离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-809-220</td><td>用于线虫漂白和细菌制备的离心管。</td></tr><tr><td>2 mL离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1186931</td><td>用于线虫制备和细菌制备的离心管。</td></tr><tr><td>50 mL离心管</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-465-232</td><td>用于细菌制备和培养的离心管。</td></tr><tr><td>SMD镊子</td><td>Br&amp;uuml;tsch R&amp;uuml;egg Werkzeuge</td><td>448980</td><td>用于将1/32&quot;管路插入装置的镊子。</td></tr><tr><td>Tygon管 1/16&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>642002</td><td>柔性的1/16&quot;外径管路，用于连接大多数组件与装置。</td></tr><tr><td>Tygon管 1/32&quot;</td><td>Fisher Scientific</td><td>641900</td><td>柔性的1/32&quot;外径管路，用于连接细菌供应源与装置。</td></tr><tr><td>UV KUB-3</td><td>Kloe</td><td>NA</td><td>掩模对准仪和紫外曝光系统。</td></tr><tr><td>晶圆</td><td>Siegert Wafer</td><td>4P0/&gt;1/525&amp;plusmn;25/SSP/TTV&amp;lt;10</td><td>硅晶圆。</td></tr><tr><td>废液容器</td><td>NA</td><td>NA</td><td>使用2 mL离心管或冻存管及空心钢针自制。</td></tr></tbody></table>

高分辨率秀丽隐杆线虫（c. elegans）在所有幼虫阶段的成像

High-Resolution C. elegans Imaging Across All Larval Stages

Caenorhabditis elegans 已成为生物学中研究最广泛且最被深入理解的动物模型之一。C. elegans 作为模式生物的成功主要归功于三个关键特征：固定的细胞谱系、通体透明以及易于进行遗传操作。这些特性使其成为多种基于显微镜的活体研究的理想对象。秀丽隐杆线虫（C. elegans）的活体幼虫和成虫在图像采集过程中通常需要被固定。传统的固定方法会对线虫的发育产生不利影响，尤其是在延时成像应用中。本文介绍了一种新型微流控成像方法的详细装置搭建与操作流程，该方法克服了传统琼脂垫固定及其他微流控策略所存在的局限性。该技术能够同时对不同幼虫阶段的线虫进行活体成像，并在长时间内保持个体的方向性和身份识别。为实现这一目标，采用了一种几何结构经过精确设计的微流控捕获通道阵列，可在支持线虫生长和蜕皮的同时，维持其稳定的方向。固定过程通过一个主动液压阀实现，该阀仅在图像采集期间施加压力，将线虫压紧在盖玻片上。这种设计使得高分辨率成像成为可能，同时对线虫的存活率和发育时间影响极小。

本方案描述了基于微流控技术的秀丽隐杆线虫（C. elegans）在整个胚胎后发育过程中的延时成像。

高分辨率秀丽隐杆线虫（C. elegans）在所有幼虫阶段的成像

秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）已成为生物学中研究最广泛且理解最深入的动物模型之一。有三个特征对C. elegans的……

在实验室中，我们致力于研究各种发育生物学问题。我个人更侧重于技术层面，致力于开发新的方法，以利用成像技术更有效地解答这些问题。秀丽隐杆线虫（C. elegans）研究领域已成功采用多种技术，从CRISPR基因编辑、转录组学和蛋白质组学，到超分辨率显微镜技术，范围广泛。C. elegans 是一种卓越的模式生物，但在高分辨率活体观察的背景下仍面临挑战，通常需要对样本进行固定以获得最佳分辨率，而这反过来又限制了动物的存活能力。本实验方案提出了一种可用于长期观察 C. elegans 的成像方法，使研究人员能够在自身实验室中采用该技术，直接在活体内研究多种动态发育过程。在本实验室中，该方法已实现对器官形成的精细观察，例如在形态发生过程中，或从体细胞分裂直至成体发育的连续过程。此后，该方法已被众多实验室广泛采用，用于研究多种多样的发育过程。[Presenter] 首先，将装置连接至支撑架，并将其安装在直立显微镜上。用去离子水填充一支注射器，然后连接一根23号针头和一段长约1英寸×16英寸的软管，软管末端接一个中空弯曲的钢针。用注射器中的去离子水充满软管，并将钢针插入阀门入口的穿孔中以连接软管。在将软管连接到芯片外电磁阀之前，取下注射器和针头。使用成像软件打开电磁阀，并对装置加压数分钟，以排出阀门中的所有空气。通过肉眼观察，若气液界面变暗并消失于PDMS材料中，则表明排气完成。使用成像软件关闭电磁阀。接下来，用过滤后的细菌溶液填充一支1毫升注射器，并在针头上连接一根30号针头和一段长约1英寸×32英寸的软管。推动推杆，使针头及相连的软管完全充满细菌溶液。然后使用镊子将1英寸×32英寸的软管直接插入微流控装置的食物入口，并将注射器放置于注射泵上。通过后部的拇指螺丝推动注射器推杆，使液体充满装置。用密封的钢针封闭线虫入口和出口，并利用调节螺丝施加额外压力，以去除装置中残留的空气。随后移除出口处的封闭钢针，并将废液容器连接至出口。推动注射器，确保废液容器连接正确且系统中无堵塞。从入口移除第二个封闭钢针，并推动注射器，直至线虫入口处出现少量液滴。然后使用一根23号针头，将一段长约15至20厘米的1英寸×16英寸软管连接至装有S-碱性缓冲液的1毫升注射器。在软管另一端连接一根直型23号钢针。用注射器中的S-碱性缓冲液充满针头和软管。接着，将软管末端的钢针插入含有线虫的管中，推动少量液体通过软管，确保其中无空气残留。将线虫吸入软管，但不要吸入注射器内。然后推动连接线虫的注射器，直至钢针末端出现少量液滴，再将钢针插入微流控装置的线虫入口。将装置置于低倍显微镜（5x或10x）或解剖显微镜下。调整装置位置，使入口位于视野一侧，而捕获通道入口的背面位于视野另一侧。轻轻推动线虫注射器的推杆。接着，将线虫推向通道阵列。当某一线虫正对通道时，将其推入通道，并对其他线虫重复此操作。在捕获足够数量的线虫后，将仍连接在线虫入口的注射器放置于显微镜载物台上，并在整个实验过程中保持该位置。若加载操作是在解剖显微镜下完成的，则将装置转移至成像显微镜。现在启动注射泵，以每小时1微升的预设速率运行0.5微升。编程设定注射泵：先以每小时1微升的流速运行0.5微升，随后流速增加至每小时100微升并运行0.5微升，该流动模式在整个实验过程中重复进行。将装置放置于显微镜载物台上，并确保其固定牢固。切换至所需的成像放大倍数。在捕获通道阵列中识别目标线虫及感兴趣区域，并设置所需的成像条件。在设定的成像条件下进行成像，在图像采集前10秒通过电磁阀激活芯片上的阀门，使线虫固定在原位。由于采用了170微米厚的盖玻片，该微流控装置在多种显微成像模式下均保持了高成像质量，包括明场、落射荧光、转盘共聚焦以及超分辨率成像方法。从早期L1至中期L2幼虫阶段，秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）上皮细胞的发育过程得以清晰观察。从晚期L1至早期L4幼虫阶段，初级退化型阴门前体细胞的诱导及其后续分裂过程明显可见。阴门形成的各个阶段从早期L3持续至成虫期。通过图像去卷积和图像配准技术对获取的图像进行增强处理，显著提高了视觉清晰度。所有线虫中观察到的细胞分裂均以一致且准时的方式发生，所有分裂均在典型的幼虫阶段持续时间内完成。在L2和L3阶段，性腺长度稳定增长，且由于线虫呈直线排列，实现了可重复的精确测量。

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所有幼虫阶段的高分辨率 秀丽隐杆线 虫成像

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