所有幼虫阶段的高分辨率 秀丽隐杆线 虫成像

该协议描述了整个胚胎后发育过程中基于微流体的 秀丽隐 杆线虫延时成像。

在实验室里，我们研究各种发育生物学问题。我自己更多地在技术方面工作，开发使用成像技术更好地解决这些问题的方法。秀丽隐杆线虫领域已经成功地采用了多种方法，从 CRISPR 基因编辑、转录组学和蛋白质组学一直到超分辨率显微镜。秀丽隐杆线虫是一个了不起的模型，然而，在高分辨率的体内观察背景下，它也面临着挑战，需要固定才能获得最佳分辨率，这反过来又限制了动物的生存能力。该协议为长期秀丽隐杆线虫成像提供了一种可能的解决方案，允许研究人员在自己的实验室中采用该方法，并直接在体内研究各种动态发育过程。在实验室内，该方法可以详细观察器官形成，例如，在形态发生的背景下或体细胞分裂到成年期之后。此后，该方法已被许多研究各种发育过程的实验室采用。

[主持人]首先，将设备连接到支撑框架并将其安装在正置显微镜上。用去离子水填充注射器，然后用空心弯曲的钢销连接一根 23 号针头和一根 1 x 16 英寸的长管。用注射器中的去离子水填充管道，然后将钢销插入阀门入口的冲孔中以连接管道。在将管子连接到片外螺线管之前，请取出注射器和针头。使用成像软件，打开电磁阀并对设备加压几分钟，以排出阀门中的所有空气。通过目视检查空气水界面是否变暗并消失在 PDMS 材料中来验证完成情况。使用成像软件关闭电磁阀。接下来，用过滤后的细菌溶液填充一毫升注射器，并将一根 30 号针头和一根 1 x 32 英寸的长管连接到针头上。按下柱塞，用细菌溶液填充针头和连接的管子。然后使用镊子将 32 英寸的管子直接插入微流体装置的食物入口，并将注射器放在注射泵上。使用背面的指旋螺钉按压注射器柱塞，使设备充满液体。用密封的钢销堵住蜗杆入口和出口，并使用固定螺钉施加额外的压力以去除设备中残留的空气。然后取下出口处堵塞的钢销，并将废物容器连接到出口上。推动注射器以确保废物容器正确连接并且系统中不存在堵塞。从入口中取出第二个堵塞的钢销并推动注射器，直到蜗杆入口处出现一小滴液体。然后使用23号针头，将一根尺寸约为15至20厘米的1 x 16英寸管子连接到装有S-基础缓冲液的一毫升注射器上。将一个直的 23 号钢销连接到管道的另一端。用注射器中的 S 基础缓冲液填充针头和管子。现在，将管子末端的钢销插入装有蜗杆的管子中，并将少量液体推过管子以确保没有空气残留。将蠕虫拉入管道，不要将它们拉入注射器。然后推动连接到蜗杆的注射器，直到钢针上出现一小滴液体，将钢针插入微流控装置的蜗杆入口。将设备放在低放大倍率（5 倍或 10 倍）的显微镜上，或放在解剖显微镜上。放置设备，使入口在视野的一侧可见，而陷阱通道入口的背面在另一侧可见。轻轻推动蜗杆注射器的柱塞。接下来，将动物推向通道阵列。一旦动物面对通道，将其推入通道并对其他动物重复上述步骤。捕获足够多的动物后，将注射器放在显微镜载物台上，该注射器仍附着在蠕虫入口上，在整个实验过程中保持不变。如果在解剖显微镜上进行加载，请将设备转移到成像显微镜上。现在，打开注射泵并以每小时 1 微升的预设速率运行 0.5 微升。对注射泵进行编程，使其以每小时 1 微升的速度运行 0.5 微升，然后将流速每小时增加 100 微升，达到 0.5 微升，并在整个实验过程中重复流速模式。将设备放在显微镜载物台上，并确保其牢固固定。切换到所需的成像放大倍率。识别陷阱通道阵列中的动物和感兴趣区域，并设置所需的成像条件。在所需的成像条件下成像，在图像采集前 10 秒通过电磁阀驱动片上阀，以便将动物固定到位。 由于使用了 170 微米厚的盖板玻璃，该微流控设备在各种显微镜模式下保持了高成像质量，包括明场、落射荧光、旋转盘共聚焦和超分辨率方法。秀丽隐杆线虫上皮细胞的发育从 L1 早期到 L2 幼虫中期可见。原代褪色外阴前体细胞的诱导及其随后从 L1 晚期到 L4 幼虫期的分裂是显而易见的。外阴形成阶段从早期 L3 到成年期。通过图像反卷积和配准增强采集的图像，提高视觉清晰度所有动物的细胞分裂都以一致和及时的方式发生，所有分裂都在典型的幼虫阶段持续时间内完成。性腺长度在 L2 和 L3 阶段稳步增加，动物的直线方向使测量结果一致。