Name: 小鼠肾损伤糖尿病发病机制中全肾、髓质和皮质小管的比较蛋白质组学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 了解小鼠糖尿病肾病中全肾、皮质小管和髓质的比较蛋白质组学分析方法。该方案利用质谱技术识别疾病相关的蛋白质组变化，揭示肾脏不同区域的分子机制，为糖尿病肾病研究提供重要框架。

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本项目的工作部分得到了MTB（NIH K01DK080951）和TDC（NephCure-儿科肾脏病研究联盟NKI-2023-04）以及路易斯维尔大学肾脏疾病计划和蛋白质组学技术中心（TDC、MTB）的资金支持。

OVE26 和 FVB 小鼠的相关研究已获得路易斯维尔大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）指南的批准。转基因雌性 OVE26（糖尿病型；品系编号：005564）和 FVB（非糖尿病型；背景品系；品系编号：001800）小鼠购自杰克逊实验室（缅因州巴港）。动物饲养于 12 小时光照/12 小时黑暗循环、25 °C 环境中，并可自由获取水和食物。所有研究均使用 2 月龄小鼠进行。
1. 动物模型
<ol>
	<li>肾脏分离
	<ol>
		<li>通过腹腔注射给予小鼠80 mg/kg氯胺酮和12 mg/kg赛拉嗪以进行麻醉。</li>
		<li>使用小型手术剪在腹部正中做切口，用棉签轻轻将小鼠的肠管移至一侧，以暴露下腔静脉。</li>
		<li>在右肾上方的下腔静脉处做一个小切口。</li>
		<li>通过左心室向小鼠灌注 20 mL 冷磷酸盐缓冲盐水（PBS：pH 7.4；210 mg/L KH2PO4，9 g/L NaCl，726 mg/L Na2HPO4·7H2O）使用蠕动泵，以10 mL/min的流速进行。 
		注意：如果在后续分析中肾脏中血液蛋白和细胞的残留并非关键因素，则此步骤并非必需。</li>
		<li>使用小型手术剪取肾脏。去除肾脏外部多余的脂肪组织。称量肾脏重量，并将其置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中。</li>
		<li>去除肾包膜。</li>
		<li>将肾脏置于置于冰上的玻璃板或培养皿中。使用剃刀片对肾脏进行数次横向切割（图3以获得肾脏上极与下极之间3-4个切片。</li>
		<li>保留1-2个中间切片及两端极部（用圆圈标出的肾脏切片） 图3每个肾脏留出一部分作为 &#34;整个肾脏&#34; 样品。取部分样品放入1.5 mL离心管中，加入预冷的匀浆缓冲液（10%甘油，50 mM HEPES，100 mM KCl，2 mM EDTA，0.1% NP40，10 mM NaF，0.25 mM NaVO₃），充分混匀。3，1x HALTS蛋白酶抑制剂），用量约为每毫克组织样本10 µL（根据获取的肾脏重量估算肾片质量）。将离心管置于冰上。</li>
		<li>对于其余的中段横切片，将切片平放，然后使用刀片或手术刀小心地从每片切片上削去皮层（最外层1 mm）图3，示意图工作流程）。在进行皮质小管分离方案时（下文步骤1.3），需将皮质区域与髓质区域分开。</li>
		<li>将解剖得到的延髓组织部分放入1.5 mL离心管中，加入冰上预冷的匀浆缓冲液（同步骤1.1.8），并将离心管置于冰上。</li>
		<li>将未用于匀浆的所有剩余完整肾脏和肾髓质组织在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>或者，将分离出的整个肾脏和髓质组分冷冻，并按照步骤1.1.11所述进行保存。后续从储存中取出，按步骤1.1.8加入匀浆缓冲液。</li>
	<li>皮质小管分离
	<ol>
		<li>在玻璃板或培养皿上用剃刀将分离的皮层组织切碎成1-3 mm大小的组织块，制成糊状。</li>
		<li>在37 °C的摇动水浴中，用1 mL I型胶原酶A（1 mg/mL）消化切碎的皮层组织30分钟。</li>
		<li>将一个100 µm细胞筛置于冰上的50 mL锥形管顶部。</li>
		<li>将消化后的皮质悬液置于100 µm细胞筛网上，使用10 mL注射器的推杆轻轻压过筛网。用1 mL PBS洗涤筛网顶部，再用1 mL PBS洗涤筛网底部。</li>
		<li>将滤液通过50 mL管中的额外100 µm滤网过滤，然后用1 mL PBS冲洗滤网顶部。</li>
		<li>将滤液通过置于冰上、装有50 mL锥形管的70 µm细胞滤筛。小管将穿过该滤筛进入滤液（肾小球则保留在70 µm滤筛上）。用1 mL PBS冲洗滤筛。</li>
		<li>将最终滤液在120 × g离心 g 4 °C 下离心 2 分钟。弃去管状沉淀中的多余 PBS。</li>
		<li>在显微镜下使用10倍物镜观察皮质小管沉淀物的纯度。如果该组分中超过10%含有肾小球，则用1 mL PBS重新悬浮滤液，并通过一个新的70 µm细胞筛网过滤，无需对筛网进行额外清洗。</li>
		<li>将富集的肾小管组分分装至1.5 mL离心管中，于2000 × g 4 °C下离心2分钟。弃去上清液。</li>
		<li>将匀浆缓冲液加入肾小管沉淀物中，操作同步骤1.1.8和1.1.10中所述的全肾和髓质处理方法。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>组织匀浆/蛋白质提取
	<ol>
		<li>使用专用于1.5 mL离心管的塑料研磨棒，在1.5 mL微量离心管中对每种样品类型进行匀浆。如果匀浆后的悬浮液过于黏稠，可按需添加额外的匀浆缓冲液。</li>
		<li>将匀浆后的悬液置于冰上静置15分钟，随后在水浴超声仪中进行5分钟超声处理（仪器仅具备开关功能，无调节设置），水浴温度保持在25 °C。超声后将样品置于冰上静置10分钟。</li>
		<li>短暂涡旋振荡（1000–1500 RPM）匀浆液，然后用移液器吹打20次，冰上静置15分钟。</li>
		<li>在以13,000 × g离心前，将样品反复吹打数次 g 4 °C 下孵育 20 分钟。</li>
		<li>将澄清的蛋白质提取物转移至洁净的离心管中。</li>
		<li>分装30 µL澄清提取物用于蛋白质定量及质谱分析样品制备。其余样品储存于-80 °C。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 悬浮捕获微型离心柱消化方案
<ol>
	<li>蛋白质经蛋白酶解消化为胰蛋白酶片段用于蛋白质组学分析</li>
	<li>将约40–50 µg样品（浓度约2 µg/µL）用裂解缓冲液（含10% w/v 十二烷基硫酸钠[SDS]、100 mM 三乙基碳酸氢铵（TEA-BC）pH 8.5 和 40 mM 三(2-羧乙基)膦[TCEP]）稀释至终体积46 µL。</li>
	<li>蛋白质的还原与烷基化
	<ol>
		<li>65 °C 下孵育 30 分钟（TCEP 的终浓度为 20 mM）。</li>
		<li>加入4 µL 0.5 M碘乙酰胺（溶于液相色谱-质谱联用级水中），避光室温孵育30分钟（碘乙酰胺终浓度为40 mM）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入5 µL质量分数为12%的磷酸水溶液（通过将141 µL的85%磷酸稀释于859 µL的液相色谱-质谱级水中配制12%溶液）。
	<ol>
		<li>磷酸的替代品，若进行磷酸化肽富集，可使用三氟乙酸或甲酸18.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>加入350 µL悬浮液捕获结合缓冲液（100 mM TEA-BC，含90% v/v甲醇/10% v/v水，pH 7.55）。</li>
	<li>将样品加入悬浮液捕获柱中。在4,000 × g 在室温下，使用固定角转子以30秒离心使每个体积通过层析柱。</li>
	<li>用 400 µL 悬浮捕获结合缓冲液洗涤 4 次。4,000 x g 离心 g 在室温下，使用固定角转子离心30秒，使每次洗涤液通过层析柱。 
	注意：为帮助去除SDS，每次洗涤后将柱子在离心转子中旋转180°。</li>
	<li>在 4,000 离心 g 室温下离心1分钟，以彻底去除结合缓冲液（防止消化过程中液体滴落）。</li>
	<li>将悬浮捕获柱转移至新的收集管中。</li>
	<li>加入2.5–5 µg胰蛋白酶至125 µL的50 mM TEA-BC（pH 8.5）溶液中，溶剂为液相色谱-质谱级水（胰蛋白酶，质谱级）。胰蛋白酶与样品的最终比例为1:20至1:10。</li>
	<li>在47 °C孵育2小时（切勿拧紧管盖；建议使用转速设为0 RPM的温控混匀仪）。用针头在管盖上刺一个小孔，可防止悬滴捕集装置上腔压力积聚（压力升高会导致胰蛋白酶溶液滴入柱中）。</li>
	<li>加入80 µL用LC-MS级水配制的50 mM TEA-BC（pH 8.5）。在4,000 g 在室温下，使用固定角转子以1分钟离心，使每个消化液通过柱子。</li>
	<li>加入80 µL体积分数为0.2%的甲酸水溶液（LC-MS级水）。在4,000 ×g条件下离心 g 在室温下以固定角度转子离心1分钟，收集步骤2.11中的消化液。</li>
	<li>加入80 µL的LC-MS级水中的50% v/v乙腈。使用固定角转子，在室温下以4,000 g离心1分钟，收集步骤2.11中的消化液。</li>
	<li>将悬浮捕获物洗脱液于 -80 °C 保存。</li>
	<li>在真空浓缩仪中干燥样品。</li>
	<li>将干燥的样品在 -80 °C 下保存。</li>
</ol>
3. 使用亲水-亲脂平衡（HLB）柱进行纯化
<ol>
	<li>配制溶液 A（2% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸）和溶液 B（80% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸）。</li>
	<li>将样品溶解于 500 µL 溶液 A 中。</li>
	<li>将色谱柱置于真空装置中，并以约 1–2 mL/min 的气体压力进行处理。</li>
	<li>向 HLB 色谱柱中加入 500 µL 溶液 B，并以 1–2 mL/min 速度抽真空；重复两次。</li>
	<li>向 HLB 色谱柱中加入 750 µL 溶液 A，并以 1–2 mL/min 速度抽真空；重复两次。</li>
	<li>在 HLB 色谱柱下方放置一支洁净的 2 mL 微量离心管，将样品用 500 µL 溶液 A 溶解后上样，并施加与前述相同的气体压力；将穿流液再次通过色谱柱。</li>
	<li>将 HLB 色谱柱置于废液管上方，加入 500 µL 溶液 A，并按上述方式抽真空；重复两次。</li>
	<li>将色谱柱置于一支洁净的 2 mL 微量离心管上方，加入 500 µL 溶液 B，并按上述方式抽真空；重复两次。</li>
	<li>将洗脱液在 -80 °C 冻结，然后在真空浓缩仪中干燥。将干燥后的残留物于 -80 °C 保存。</li>
	<li>在进行质谱分析前，将残留物溶解于 20 µL 的 2% v/v 乙腈/0.1% v/v 甲酸中。使用分光光度计在 205 nm 吸光度处估算肽浓度。</li>
</ol>
4. 质谱分析
<ol>
	<li>一维反相液相色谱（LC）-质谱/质谱分析
	<ol>
		<li>将等量的肽段（约 600 ng）上样至一维纳米液相色谱系统，并在反相C18柱上进行分离。</li>
		<li>在1.8 kV喷雾电压下，将肽段直接洗脱进入质谱仪，离子传输管温度保持在250 °C。</li>
		<li>采用数据依赖性采集模式，选择前20个最强离子进行MS/MS分析，其中最强烈的MS/MS碎片离子将被暂时排除出分析队列，以提高低丰度离子的鉴定深度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 数据分析与生物信息学
<ol>
	<li>数据处理流程
	<ol>
		<li>在 PEAKS 12.0（LC-MS/MS 数据分析软件）中完成谱图指认及肽段和蛋白质鉴定后，将蛋白质列表提交至 MetaboAnalyst 6.0（代谢组学数据分析平台），采用单因素统计分析方法进行分析（https://www.metaboanalyst.ca/）。</li>
		<li>使用 LC-MS/MS 数据分析软件，以严格的假发现率（FDR）标准（1% 蛋白质和&#160;肽段）在小鼠已审阅的 FASTA 数据库中进行谱图搜索与筛选。 
		注：其他可选的常用搜索程序包括 Maxquant、Proteome Discoverer 等。</li>
		<li>指定半胱氨酸的羧氨甲基化为固定修饰，甲硫氨酸的氧化为可变修饰。</li>
		<li>将列表转换为逗号分隔值（CSV）格式，并为每一列和每一行分配组别/样本标签。该格式在代谢组学数据分析平台中具有良好的兼容性。</li>
		<li>对缺失值采用“1/5 最小值法”进行填补。</li>
		<li>使用四分位距（IQR）对数据进行过滤，排除高变异值，截断阈值设为 40% 方差。</li>
		<li>将数值归一化至中位强度，进行 log10 转换，并进行均值中心化以实现数据缩放。可采用其他归一化方法，但需注意结果可能有所不同。</li>
		<li>以非配对方式执行 T 检验，p 值截断标准为 &#60; 0.05，并在此阶段进行多重检验校正。 
		注：本研究出于数据展示目的，未对代表性数据集进行此项校正。</li>
		<li>绘制火山图，设定阈值为 1.5 倍变化（FC）且 p &#60; 0.05。</li>
		<li>生成热图，并对样本组进行偏最小二乘判别分析（PLSDA）以及统计学分析（投影重要性变量 [VIP] 分析）。</li>
		<li>后续研究的潜在候选蛋白应满足以下任一条件：变化倍数超过 1.5 倍且 p 值 &#60; 0.05，或 VIP 值 &#62; 1.0，如 PLSDA 分析所示。</li>
		<li>生成维恩图，以展示 OVE26 小鼠全肾、肾小管和肾髓质蛋白质组之间的差异。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiological+patterns+of+chronic+kidney+disease+attributed+to+type+2+diabetes+from+1990-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Epidemiological patterns of chronic kidney disease attributed to type 2 diabetes from 1990-2019.</a> Front Endocrinol. 15, 1383777(2024).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trends+in+the+burden+of+chronic+kidney+disease+attributable+to+type+2+diabetes%3A+an+age-period-cohort+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Obes+Metab%22%5BJournal%5D)">Global trends in the burden of chronic kidney disease attributable to type 2 diabetes: an age-period-cohort analysis.</a> Diabetes Obes Metab. 26 (2), 602-610 (2024).</li>
<li>Xie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+and+influencing+factors+of+chronic+kidney+disease+due+to+type+2+diabetes+in+adults+aged+20-59+years%2C+1990-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global burden and influencing factors of chronic kidney disease due to type 2 diabetes in adults aged 20-59 years, 1990-2019.</a> Sci Rep. 13 (1), 20234(2023).</li>
<li>Giunti, S., Barit, D., Cooper, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+diabetic+nephropathy%3A+role+of+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of diabetic nephropathy: role of hypertension.</a> Hypertension. 48 (4), 519-526 (2006).</li>
<li>Thomas, M. C., Burns, W. C., Cooper, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+changes+in+early+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Chronic+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubular changes in early diabetic nephropathy.</a> Adv Chronic Kidney Dis. 12 (2), 177-186 (2005).</li>
<li>Thomas, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Diabetic kidney disease.</a> Nat Rev Dis Primers. 1, 15018(2015).</li>
<li>Nath, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulointerstitial+changes+as+a+major+determinant+in+the+progression+of+renal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Kidney+Dis%22%5BJournal%5D)">Tubulointerstitial changes as a major determinant in the progression of renal damage.</a> Am J Kidney Dis. 20 (1), 1-17 (1992).</li>
<li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+we+target+tubular+damage+to+prevent+renal+function+decline+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Can we target tubular damage to prevent renal function decline in diabetes.</a> Semin Nephrol. 32 (5), 452-462 (2012).</li>
<li>Powell, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tubulointerstitial+fibrosis+in+OVE26+type+1+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron+Exp+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Renal tubulointerstitial fibrosis in OVE26 type 1 diabetic mice.</a> Nephron Exp Nephrol. 111 (1), e11-e19 (2008).</li>
<li>Cummins, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry+of+diabetic+kidney+tubules+identifies+GRAP+as+a+novel+regulator+of+TGF-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry of diabetic kidney tubules identifies GRAP as a novel regulator of TGF-beta signaling.</a> Biochim Biophys Acta. (4), 653-661 (2010).</li>
<li>Barati, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+endoplasmic+reticulumstress-response+proteins+in+different+renal+tubule+subtypes+of+OVE26+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Differential expression of endoplasmic reticulumstress-response proteins in different renal tubule subtypes of OVE26 diabetic mice.</a> Cell Stress Chaperones. 21 (1), 155-166 (2016).</li>
<li>Zheleznova, N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proteomic+analysis+reveals+deficiencies+in+oxygen+utilization+in+medullary+thick+ascending+limb+of+Henle+in+the+Dahl+salt-sensitive+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Genomics%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proteomic analysis reveals deficiencies in oxygen utilization in medullary thick ascending limb of Henle in the Dahl salt-sensitive rat.</a> Physiol Genomics. 44 (17), 829-842 (2012).</li>
<li>Nordquist, L., Palm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes-induced+alterations+in+renal+medullary+microcirculation+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Diabetes+Rev%22%5BJournal%5D)">Diabetes-induced alterations in renal medullary microcirculation and metabolism.</a> Curr Diabetes Rev. 3 (1), 53-65 (2007).</li>
<li>dos Santos, E. A., Li, L. -P., Ji, L., Prasad, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+changes+with+diabetes+in+renal+medullary+hemodynamics+as+evaluated+by+fiberoptic+probes+and+BOLD+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Radiol%22%5BJournal%5D)">Early changes with diabetes in renal medullary hemodynamics as evaluated by fiberoptic probes and BOLD magnetic resonance imaging.</a> Invest Radiol. 42 (3), 157-162 (2007).</li>
<li>Cummins, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Mass+Spectrometry+Normalization+in+UrineBiomarker+Analysis+in+Nephrotic+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Glomerular+Dis%22%5BJournal%5D)">Quantitative Mass Spectrometry Normalization in UrineBiomarker Analysis in Nephrotic Syndrome.</a> Glomerular Dis. (3), 121-131 (2022).</li>
<li>Carlson, E. C., Audette, J. L., Klevay, L. M., Nguyen, H., Epstein, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+and+functional+analyses+of+nephropathy+in+calmodulin-induced+diabetic+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural and functional analyses of nephropathy in calmodulin-induced diabetic transgenic mice.</a> Anat Rec. 247 (1), 9-19 (1997).</li>
<li>Zheng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+late-stage+diabetic+nephropathy+in+OVE26+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Development of late-stage diabetic nephropathy in OVE26 diabetic mice.</a> Diabetes. 53 (12), 3248-3257 (2004).</li>
<li>Wang, F., Veth, T., Kuipers, M., Altelaar, M., Stecker, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+suspension+trapping+method+for+phosphoproteomics+sample+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Optimized suspension trapping method for phosphoproteomics sample preparation.</a> Anal Chem. 95 (25), 9471-9479 (2023).</li>
<li>Mather, A., Pollock, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+handling+by+the+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int+Suppl%22%5BJournal%5D)">Glucose handling by the kidney.</a> Kidney Int Suppl. 120, S1-S6 (2011).</li>
<li>Ross, B. D., Espinal, J., Silva, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+metabolism+in+renal+tubular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Glucose metabolism in renal tubular function.</a> Kidney Int. 29 (1), 54-67 (1986).</li>
<li>Roger, F., Martin, P. Y., Rousselot, M., Favre, H., Féraille, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+shrinkage+triggers+the+activation+of+mitogen-activated+protein+kinases+by+hypertonicity+in+the+rat+kidney+medullary+thick+ascending+limb+of+the+Henle%27s+loop%3A+requirement+of+p38+kinase+for+the+regulatory+volume+increase+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell shrinkage triggers the activation of mitogen-activated protein kinases by hypertonicity in the rat kidney medullary thick ascending limb of the Henle's loop: requirement of p38 kinase for the regulatory volume increase response.</a> J Biol Chem. 274 (48), 34103-34110 (1999).</li>
<li>Yang, J., Lane, P. H., Pollock, J. S., Carmines, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC-dependent+superoxide+production+by+the+renal+medullary+thick+ascending+limb+from+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">PKC-dependent superoxide production by the renal medullary thick ascending limb from diabetic rats.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 297 (5), F1220-F1228 (2009).</li>
</ol>

作者无披露信息。

本技术方案中介绍的方法旨在阐述肾脏不同区域的比较蛋白质组学分析。我们采用方法分离了糖尿病（OVE26）和对照（FVB）小鼠的肾髓质和皮质小管，并进行了1维液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）及生物信息学分析，以揭示肾脏各部分以及全肾蛋白质组的基本差异。
分离肾脏结构需要仔细将皮质从髓质中解剖出来。首先对肾脏进行横向切片，可获得较薄的组织切片&#160;切片将有助于更可靠地分离皮质。采用筛分法制备皮质小管时，肾小球可能通过70 µm筛网被滤除。每次洗涤步骤后，必须在显微镜下检查小管的纯度，以确保富集效果并避免小管组织的损失。在初始筛分步骤中避免过度挤压消化后的皮质，可减少最终小管制备物中的污染。
悬浮捕获方法在溶解和蛋白质提取步骤中具有较高的灵活性，且不会在质谱洗脱步骤中产生离子干扰。第2.10步中的关键因素是胰蛋白酶与肽浓度的比例（对于大多数应用，1:20 或 1:10 的比例较为理想）。有效的蛋白质酶解同时尽量减少非特异性切割，将获得更一致的结果。如果需要进行磷酸化肽的富集，在第2.4.1步烷基化后的酸化步骤可使用甲酸或三...

慢性肾脏病（CKD）是现代医学中的一个重大问题，仅在美国，其医疗支出就超过860亿美元1。在全球范围内，随着糖尿病及其相关肾脏合并症的流行，CKD的发病率正在上升。接近14%的美国人口患有CKD&#160;（USRDS 2024年度报告）。此外，糖尿病肾病是CKD的一种形式，也是终末期肾病（ESRD）的主要原因，约60%的ESRD患者患有糖尿病1,2,3。糖尿病会影响肾脏功能单位——肾单位的所有结构和细胞类型。如图1所示，肾单位的不同部分位于肾脏的皮质和髓质区域。肾脏的大部分由肾小管组成。肾小管功能障碍和结构病变在糖尿病肾病（DN）的发生发展中起着重要作用，这些改变与肾功能下降速率密切相关4,5,6,7,8。在糖尿病早期，由于各段肾小管对葡萄糖增加以及伴随的钠离子摄取和膜转运蛋白需求上升作出反应，肾小管会发生肥大。随着糖尿病后期微血管损伤加重，肾小管出现萎缩和扩张，同时伴有间质纤维化和扩张9。本实验室先前的研究发现，糖尿病小鼠肾脏皮质小管中蛋白质组发生改变，并存在大量应激反应蛋白10,11。髓质在调节尿液浓缩方面具有重要作用，肾病期间的功能障碍与氧化应激相关；由于代谢活动耗氧量增加、膜转运蛋白活性升高以及微血管损伤，糖尿病会导致该区域肾脏氧张力降低12,13,14。
深入理解糖尿病肾病（DN）发生与进展的详细机制是一项持续进行的工作，需要采用新颖且综合的方法，包括疾病建模、信号通路的分子谱分析、细胞蛋白质动态的适应性变化，以及对慢性病变条件下受损肾细胞和组织成分进行精确定义。蛋白质组学、代谢组学和转录组学为从分析层面探究肾脏疾病的分子机制提供了可能。“组学”（Omics）是一个相对较新的领域，利用系统生物学方法以获得对生物系统的全局性认识。近几十年来，蛋白质组学已成为肾脏病学中一种强大的组学研究工具。生物标志物研究在过去20年中迅速扩展，相关出版物数量的增长即为明证，但要将这些研究成果充分应用于临床，仍需大量工作15。由于肾皮质和髓质中存在多种截然不同的肾小管细胞群体及其相应的功能角色，对整个肾脏进行蛋白质组分析可能会掩盖这些不同区域中特定结构所发生的独特变化。因此，本研究的目标是展示肾皮质与髓质的分离，以及皮质中肾小管与肾小球的分离，并随后提供从分离结构中制备蛋白质提取物的详细方案，用于先进的质谱分析和生物信息学分析。糖尿病肾病的小鼠模型在阐明疾病进展机制方面具有重要作用。在本研究中，我们采用了OVE26转基因小鼠模型，该模型会早发I型糖尿病，并表现出人类早期和晚期DN的特征，包括：1）肾小球滤过率早期升高随后下降；2）肾脏肥大；3）肾小球基底膜增厚和系膜区扩张；4）严重蛋白尿；以及5）肾小管间质纤维化9,16,17。选择2月龄小鼠旨在揭示在明显结构损伤出现之前，肾小管区室中的蛋白质组变化。如先前报道及图2所示，2月龄OVE26小鼠已出现肾小球系膜基质扩张（图2，绿色箭头）和严重蛋白尿17，但在年轻糖尿病小鼠中，近端小管尚未出现明显的组织学改变（图2，黄色箭头）。本文提出一种联合定量蛋白质组学方法，用于对全肾、髓质及皮质肾小管进行表征，以阐明并展示糖尿病状态下各区室间蛋白质组的差异。

<table><tbody><tr><td>1A型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Millipore Signal</td><td>C9891</td><td></td></tr><tr><td>Exploris 480 Orbitrap&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/BRE725539</td><td>MS</td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛，100 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>21008-950</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛，70 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Gibco PBS pH 7.4&amp;nbsp;</td><td>Thermo</td><td>1001023</td><td></td></tr><tr><td>Halt 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合液</td><td>VWR</td><td>PI78440</td><td></td></tr><tr><td>碘乙酰胺</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>MetaboAnalyst 6.0&amp;nbsp;</td><td>MetaboAnalyst 6.0&amp;nbsp;</td><td>https://www.metaboanalyst.ca/</td><td>代谢组学数据分析平台</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000&amp;nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 柱&amp;nbsp;</td><td>Waters</td><td>186002034</td><td></td></tr><tr><td>PEAKS 12.0</td><td>Bioinformatics Solutions Inc</td><td></td><td>LC-MS/MS 数据分析软件</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管研磨杵</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0782485</td><td></td></tr><tr><td>悬浮液捕获装置（S-trap）</td><td>Protifi</td><td>C02-micro-10</td><td></td></tr><tr><td>TCEP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20490</td><td></td></tr><tr><td>TEABC</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7408</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶，质谱级</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>90057</td><td></td></tr><tr><td>超声波清洗器</td><td>Cole-Parmer&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Model 0884900</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠糖尿病肾损伤发病机制中全肾、髓质及皮质肾小管的比较蛋白质组学分析

Comparative Proteomic Analysis of Whole Kidney, Medulla, and Cortical Tubules in Diabetic Pathogenesis of Kidney Injury in Mice

明确肾脏疾病中事件发生的顺序是肾病学临床实践的核心。组织蛋白质组学分析是理解肾脏病理生理学基本生理和分子过程的重要方法。本文所介绍的方法和方案将有助于对与疾病后遗症相关的各个特定区域进行肾脏的分子解剖。为了确定疾病对具有独特功能的特定肾脏区域和结构的影响，本方案的目标是联合展示简化的 小鼠肾脏分区技术以及肾皮质小管分离技术，并结合简化的无标记定量蛋白质组学工作流程。整合这些方法将有助于识别整个肾脏、髓质区室以及皮质小管结构中异常的分子模式，最终实现病理条件下单细胞蛋白质组学的目标。在几乎任何疾病模型中应用这些方法，都将有助于阐明与肾功能障碍相关的病理机制。

总体而言，每种样本类型的总蛋白质鉴定数量分别为：1）全肾（1438）、2）髓质（2145）和皮质小管（1859）。经 MetaboAnalyst 6.0 数据处理、数据过滤和缺失值填补后，最终用于分析的各肾区室蛋白质鉴定数量为：全肾（455）、髓质（997）和皮质小管（896）。 图4 展示了OVE26糖尿病小鼠肾脏中的全蛋白质组变化。非标记定量（LFQ）分析可实现深度的蛋白质组覆盖，但与报告离子标记法（TMT、iTRAQ等）相比，会引入更高的数据集变异性。为克服LFQ变异性的一种策略是增加每种条件下分析的样本数量。本研究中，我们采用PEAKS搜索算法中的基于强度的定量方法，肽段和蛋白质鉴定水平的错误发现率（FDR）控制在1%以内，从而在每种条件下配对两只动物并包含技术重复的比较中，生成可靠的数据集。 图 4A 展示以log2倍数变化（log2FC）对未校正的p值（p-value）作图 &lt; 0.05）。通常，在旨在验证稳健候选蛋白以进行正交后续实验时，p 值需针对多重比较进行校正。此处，为了展示目的，我们在火山图...

本文介绍了一种针对全肾、分离的皮质小管以及髓质蛋白质组进行蛋白质组学分析的详细方案。该研究还比较了糖尿病小鼠模型与非糖尿病小鼠的区域蛋白质组差异。

定义肾脏疾病中事件发生的顺序是肾病学家临床实践工具包中的基石。组织蛋白质组学分析是一种……

我们致力于利用质谱技术定义肾脏中的分子变化。因此，我们尤其关注与糖尿病或糖尿病肾病等疾病过程相关的分子变化。在分析整个肾脏提取物时，由于中等和低丰度蛋白质被高丰度蛋白质所掩盖，因此很难界定特定肾脏区域和细胞结构中与疾病相关的蛋白质组学变化。[Timothy] 我们致力于利用质谱蛋白质组学对深层组织进行表征，研究肾脏尤其是肾小球在疾病状态下发生的分子变化事件。我们的蛋白质组学方法能够对分离的肾脏区域和结构进行蛋白质组学分析，无需使用解剖显微镜或高超的徒手解剖技能，也无需特定的样品蛋白质提取方案。我们研究计划的下一个逻辑步骤是明确这些组织中发生的细胞事件。因此，我们将利用单细胞蛋白质组学来界定疾病环境下对肾脏不同细胞组分的影响，尤其是肾小球中的影响，以确定在这些疾病背景下细胞所发生的改变。[旁白] 首先，从麻醉的小鼠体内取出肾脏，并将肾脏置于置于冰上的玻璃板或培养皿中。使用剃须刀片在肾脏上做数个横切，以在上下极之间获得三到四个切片。保留每个肾脏的一个至两个中部切片以及两个极部，作为全肾样本。取一部分组织放入含有冰上预冷的匀浆缓冲液的1.5毫升离心管中。保持中部横切切片平整，用剃须刀片或手术刀小心剥离皮质。在皮质小管分离方案中，需将皮质与髓质区域分开保存。取一部分分离出的髓质组织放入置于冰上的1.5毫升离心管中，并加入冰上预冷的匀浆缓冲液。在玻璃板或培养皿上，用剃须刀片将分离出的皮质组织切碎成1至3毫米大小的碎片，形成糊状。将切碎的皮质组织在1毫升I型胶原酶（type IA collagenase）中于37摄氏度的摇动水浴中消化30分钟。现在，将100微米细胞滤网置于置于冰上的50毫升锥形管上。将消化后的皮质悬液转移至100微米细胞滤网上，并使用10毫升注射器的推杆轻轻压过滤网。用1毫升PBS冲洗滤网表面。将滤液依次通过100微米滤网和70微米滤网。将最终滤液在4摄氏度下以120 × g离心2分钟。弃去多余的PBS后，使用10倍物镜在显微镜下检查皮质小管沉淀的纯度。如果该组分中超过10%含有肾小球，则将沉淀用1毫升PBS重悬，并通过洁净的70微米细胞滤网，无需额外洗涤。现在，使用塑料研杵在1.5毫升微量离心管中匀浆样品。15分钟后，在25摄氏度的水浴超声仪中对样品进行5分钟的超声处理。然后将样品在冰上再放置10分钟。短暂涡旋匀浆液，并用移液器吹打20次。将样品在冰上再放置15分钟。在多次吹打后，于4摄氏度下以13,000 × g离心20分钟，并将澄清的蛋白提取物转移至洁净的离心管中。将约40至50微克样品用裂解缓冲液稀释至终体积46微升，并在65摄氏度下孵育30分钟。然后加入4微升LC/MS级水中配制的0.5摩尔碘乙酰胺，在室温避光条件下孵育30分钟。接着，加入5微升LC/MS级水中配制的12%（质量/质量）磷酸，随后加入350微升悬浮捕获结合缓冲液。将样品加入悬浮捕获柱中，并在室温下使用固定角度转子以4,000 × g离心30秒，使每份体积通过柱子。用400微升悬浮捕获结合缓冲液洗涤柱子四次。每次洗涤后均在室温下以4,000 × g在固定转子中离心30秒。然后在室温下以4,000 × g离心1分钟，彻底去除结合缓冲液。现在将悬浮捕获柱转移至洁净的收集管中，并加入125微升pH 8.5的50毫摩尔TEABC溶液中的2.5至5微克胰蛋白酶（LC/MS级水配制）。将等质量的肽段注入一维纳米液相色谱系统，并在反相C18柱上进行分离。以1.8千伏喷雾电压将肽段直接洗脱进入质谱仪，离子传输管温度维持在250摄氏度。在数据依赖离子模式下采集谱图，其中最强的串联质谱碎片将从分析队列中排除。谱图采集完成后，提交原始文件进行谱图指认及蛋白质和肽段鉴定。使用LC-MS/MS峰数据处理软件，在严格1%错误发现率（FDR）标准下，针对小鼠经审阅的FASTA数据库进行谱图搜索与过滤。设定半胱氨酸的羧氨甲基化为固定修饰，甲硫氨酸的氧化为可变修饰，并提交至峰处理软件进行谱图指认及肽段和蛋白质鉴定。将蛋白质列表转换为CSV格式，并为每列和每行分配组别或样本标签。打开MetaboAnalyst软件。提交CSV文件，并使用1/5最小值规则对缺失变量进行缺失值填补。使用四分位距（IQR）过滤数据，排除高变异性值，设定40%方差截断值。将数值归一化至中位强度，对数据进行以10为底的对数转换，并进行均值中心化以实现标准化。生成倍数变化为1.5且p值低于0.05的火山图。生成热图，并进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以及基于投影变量重要性（VIP）的样本组统计分析。根据倍数变化超过1.5且p值小于0.05，或PLS-DA分析中投影变量重要性大于1的标准，确定潜在的后续研究候选蛋白。对OVE26糖尿病小鼠肾脏的全局蛋白质组变化进行了评估。GAPDH和ALDH6A1的显著上调表明存在代谢响应，而MME和CTSA则显著下调。值得注意的是，许多蛋白质VIP在火山图分析中被发现。具有组别和特征聚类的层次聚类热图进一步揭示了OVE26与FVB小鼠肾脏在组别及单个蛋白质水平上的蛋白质组差异。皮质小管蛋白质组分析发现Txn2和Ppef2显著上调，而Lrba和Nhef2在OVE26小鼠中下调。髓质蛋白质组分析显示Phf8和Skp1在OVE26小鼠肾脏中上调，而Rhoa和Prx下调。对全肾、小管和髓质蛋白质组数据集进行维恩图比较，显示这些数据集之间重叠极少，在统计学阈值下仅有零个或两个共享候选蛋白。

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

小鼠肾损伤糖尿病发病机制中全肾、髓质和皮质小管的比较蛋白质组学分析

小鼠离体灌注肾（MIPK）是一种用于维持小鼠肾脏在离体状态下 离体...

小鼠离体灌注肾脏技术

本方案描述了应在肾小球疾病小鼠模型中进行的完整肾脏检查。这些方法可对肾小球功能进行详细的功能性、结构性和机制性分析，适用于所有肾小球疾病的小鼠模型。...

肾小球疾病小鼠模型中肾功能的评估

采用聚氨酯管建立了一种改良的双肾单夹（2K1C）Goldblatt小鼠模型，以诱发肾动脉狭窄，从而引起肾素表达升高和肾脏损伤。本文详细描述了制备套管并将其放置于肾动脉上的操作步骤，以构建可重复且稳定的2K1C小鼠模型。...

一种改良的两肾一夹小鼠模型用于研究肾动脉狭窄中的肾素调节

本文介绍了一种利用实时定量反转录聚合酶链式反应检测急性肾损伤小鼠模型肾脏中微小RNA表达水平的实验方案。该方案重点针对缺血性肾损伤小鼠模型，并强调微小RNA样本的精细提取过程。...

一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 定量检测的方法

本方案描述了一种在小鼠中诱导单侧输尿管梗阻（UUO）的方法，用于研究梗阻性肾病中组织纤维化的进展。内容包括手术操作、术后护理以及纤维化评估方法。...

单侧输尿管梗阻模型用于研究肾间质纤维化

本文介绍了一种缺血性慢性肾病模型，该模型采用单侧肾缺血再灌注损伤，并在样本采集前一日进行对侧肾切除术；该方案可在28天和42天时实现基于血清的功能评估，具有高存活率和可重复的慢性肾病病理特征，为机制研究和干预研究提供了多功能平台。...

由肾脏缺血/再灌注损伤诱导的小鼠急性至慢性肾病转化模型

本文介绍了蛋白质复合物的亲和纯化及其通过蓝色天然PAGE分离的实验方案，随后采用无标记定量质谱技术进行蛋白质相关性分析。该方法有助于将相互作用组解析为不同的蛋白质复合物。...

通过蓝色天然PAGE和蛋白质相关性分析解析亲和纯化蛋白质复合物

人类视网膜由功能和分子特征不同的区域组成，包括中央凹、黄斑和周边视网膜。本文介绍一种利用打孔活检和手工剥离人眼组织层的方法，以分离并收集这些不同的视网膜区域，用于后续的蛋白质组学分析。...

人视网膜及视网膜色素上皮-脉络膜组织的解剖用于蛋白质组学分析

本实验方案的目的是通过碱酶法水解鸡羽毛制备角蛋白水解物，并检测将角蛋白水解物添加至化妆品软膏基质中是否能够改善皮肤屏障功能（提高皮肤水合程度并减少经皮水分流失）。实验在男性和女性志愿者中进行。...

从鸡毛中制备角蛋白水解物及其在化妆品中的应用

器官供者与受者之间人类白细胞抗原（HLA）序列的不匹配是器官移植中抗体介导排斥反应的主要原因。本文介绍了基于个体供者HLA序列的定制抗原芯片，用于检测器官受者体内针对供者HLA的同种异体抗体。...

用于器官移植中HLA同种抗体检测的个性化肽阵列

了解小鼠糖尿病肾病中全肾、皮质小管和髓质的比较蛋白质组学分析方法。该方案利用质谱技术识别疾病相关的蛋白质组变化，揭示肾脏不同区域的分子机制，为糖尿病肾病研究提供重要框架。

小鼠糖尿病肾损伤发病机制中全肾、髓质及皮质肾小管的比较蛋白质组学分析

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