使用骨内注射壳聚糖纳米颗粒包封的腺嘌呤碱基编辑器质粒增强基因递送和表达
2025年5月16日
在这里，我们提出了一种基因治疗方法，该方法通过骨内注射将 ABE 包被的壳聚糖直接输送到骨髓。
我们提出了一种基因治疗方法，通过骨内注射将基于腺嘌呤的编辑器壳聚糖直接输送到骨髓。外源质粒转染到实验动物体内的效率相对较低，长期基因表达的质粒引入可能受到免疫系统的影响。我们使用壳聚糖封装基于腺嘌呤的编辑器质粒，并通过骨内注射将复合物直接递送至小鼠骨髓，使其适用于破骨细胞功能异常引起的疾病。
我们的方案具有高转染效率、小生物损伤和高基因表达效率。我们的新策略不仅适用于破骨细胞功能异常引起的疾病，而且在推动基因治疗领域发展方面具有巨大潜力。首先，将安乐死的老鼠放在工作台上。
使用手术剪刀和镊子，取出胫骨并剥离周围的所有肌肉组织。将清洁后的胫骨浸泡在PBS中并清洗，直到只剩下骨头。将一毫升PBS吸入注射器中，从胫骨的一端冲洗骨髓细胞，直到骨头完全变白。
接下来，将细胞悬液收集在管中。在4摄氏度下以800 G离心五分钟。移出上清液后，向沉淀中加入 500 微升红细胞裂解缓冲液。
一分钟后，加入一毫升分离缓冲液以终止裂解。在4摄氏度下再次以800G离心悬浮液五分钟。除去上清液并将所得细胞沉淀放在冰上以备后用。
对于壳聚糖转染，将 4 毫克壳聚糖溶解在 20 毫升乙酸溶液中。使用 10 摩尔氢氧化钠将 pH 值调节至 5.5。然后将 500 微升壳聚糖溶液分配到单独的微型离心管中。
现在将两微克、三微克、四微克和五微克 ABE 质粒加入到单独的试管中。将质粒溶解在 500 微升 30 毫摩尔硫酸钠中。然后在相应的试管中将 500 微升质粒溶液与 500 微升壳聚糖溶液混合。
将试管在 50 至 55 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟。涡旋每个试管 15 到 30 秒，让它们不受干扰地静置 30 分钟。为了表征，使用动态光散射分析壳聚糖的直径和zeta电位。
将双蒸水中壳聚糖的浓度保持在每毫升 0.1 毫克。接下来，将每毫升 0.1 毫克壳聚糖样品浇铸到硅芯片上。将 20 微升重悬样品添加到 200 个网格网格上并孵育。
将骨髓细胞悬液在 800 G 下在 4 摄氏度下离心 5 分钟。弃去上清液，然后加入 500 微升红细胞裂解物。一分钟后，加入一毫升分离缓冲液以停止反应。
然后用细胞计数器计算细胞数。接下来，将 100 万个细胞转移到新的微型离心管中。再次离心后，移出上清液并将细胞重悬于 500 微升 PBS 中。
将重悬的细胞转移到流式细胞术管中，并使用流式细胞术测量转染效率。对于骨髓腔注射，将麻醉的小鼠固定在手术台上的仰卧位。使用胶带将前肢固定到位。
使用酒精棉签对胫骨后部进行消毒。然后将质粒溶液加载到装有 26 号针头的 1 毫升注射器中。清除所有气泡并保持注射器准备好注射。
接下来，用手指触摸并稳定鼠标的胫骨。将注射针定位为从膝关节附近的胫骨平台进入胫骨干。现在将针头平行于胫骨旋转，插入骨髓腔并在三秒钟内缓慢注射。
注射后，在三秒钟内慢慢拔出针头。立即使用酒精棉签对穿刺部位进行消毒以止血。将鼠标置于37摄氏度的温暖环境中，以促进其恢复。
由ABE和GRNA质粒形成的纳米颗粒具有均匀的球形形貌和较窄的尺寸分布，平均尺寸为202.9纳米。zeta 电位为 2.77 毫伏，多色散指数为 0.22。壳聚糖包埋的ABE质粒显著增强了骨髓细胞中的荧光信号，表明与对照组相比转染效率更高。
流式细胞术证实，壳聚糖编码的ABE质粒在骨髓细胞中实现了高转染效率。在4 μg剂量下观察到51.2%的峰值效率，而3 μg提供了47.2%的高效率平衡Sanger测序和骨髓细胞基因组DNA的PCR显示，在靶位点A1的体内基因编辑效率为14.27%，在A2位点的有效率为10.69%。
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概述
本研究提出了一种新型基因治疗方法，利用壳聚糖通过骨内注射直接将腺嘌呤编辑质粒送达骨髓。该方法旨在提高转染效率和基因表达，同时最大限度地减少生物学损伤。
关键研究组成部分
科学领域
- 基因治疗
- 骨髓递送
- 质粒转染
背景
- 基因治疗面临低转染效率的挑战。
- 免疫反应可能会阻碍长期基因表达。
- 壳聚糖是一种适合药物递送的生物相容材料。
- 异常破骨细胞功能与各种疾病相关。
研究目的
- 改善质粒递送至骨髓的效果。
- 提高目标细胞中的基因表达效率。
- 开发一种适合治疗与破骨细胞相关疾病的方法。
使用的方法
- 将腺嘌呤编辑质粒包裹在壳聚糖中。
- 将其通过骨内注射注入小鼠的骨髓中。
- 评估转染效率和生物学影响。
- 评估随时间推移的基因表达水平。
主要结果
- 实现了高转染效率，并且生物学损伤最小。
- 在骨髓中观察到显著的基因表达。
- 该方法对于由异常破骨细胞功能引起的疾病有效。
- 该策略显示出在基因治疗中更广泛应用的潜力。
结论
- 基于壳聚糖的递送系统是基因治疗的一种有前景的方法。
- 骨内注射为靶向骨髓提供了直接的方法。
- 本研究为治疗各种遗传疾病开辟了新的途径。
常见问题
Executive Industry Relevance
Efficient gene delivery to bone marrow remains a bottleneck in preclinical gene therapy and disease modeling, limiting predictive confidence in target validation and mechanistic studies. The use of chitosan nanoparticles for intraosseous delivery of adenine base editor plasmids directly addresses transfection efficiency and immune evasion challenges. This approach enables robust in vivo gene editing, supporting translational continuity and risk-adjusted advancement in bone and osteoclast-related disease research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in bone marrow cells for mechanistic de-risking.
- Supports functional validation of osteoclast-related targets through efficient in vivo editing.
- Improves predictive confidence in disease-relevant gene modulation studies.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated bone marrow cell systems for downstream screening workflows.
- Delivers reproducible and quantifiable transfection efficiency, supporting assay standardization.
- Enables reliable evaluation of gene editing outcomes via flow cytometry and sequencing readouts.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for osteoclast dysfunction and bone pathology studies.
- Provides continuity from gene editing in discovery to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Reduces biological ambiguity in translational biomarker development for bone-targeted therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This intraosseous chitosan nanoparticle delivery method integrates at the interface of early discovery and preclinical model development, enabling direct gene editing in bone marrow for target validation and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in bone and osteoclast biology.
- Screening: Provides reproducible, quantitative transfection and editing metrics for assay readiness.
- Analytics: Enables flow cytometry and sequencing-based measurement of editing efficiency and gene expression.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical validation in disease-relevant bone models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene delivery and editing in bone marrow research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in bone-targeted gene studies.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible gene delivery to bone marrow cells.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency in osteoclast and bone disease portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene therapy and disease model programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nanoparticle formulation and intraosseous injection techniques.
- Needs access to flow cytometry, dynamic light scattering, and sequencing infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible transfection and editing assessment.
- Adaptation may be needed for different animal models or target tissues.
- Efficiency and immune response considerations must be evaluated for translational scalability.
