Name: 开发基于微流体的方法，用于研究微管聚合物力学 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: 了解微流体技术如何用于研究微管聚合物力学。本方法通过PDMS模具制造和计算建模，实现了高通量检测并解决了气泡问题，为细胞骨架动力学研究提供了新工具。

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我们感谢范德堡纳米科学与工程研究所（VINSE）提供的支持和资源，本研究的部分工作在此完成。本研究部分由美国国立卫生研究院普通医学科学研究所（NIH NIGMS）向 M. Zanic 提供的资助（R35 GM1192552）以及美国国家科学基金会（NSF）ID 2018661 资助项目支持。M. Rogers 获得了 NIH T32 GM08320 资助项目和 VINSE 先导基金资助项目的支持。L. Richardson 受美国国家科学基金会研究生研究基金（NSF GRFP）资助（资助号：1937963）。作者还感谢 Alice Leach 博士、David Schaffer、Christina McGahan 博士以及整个&#160;Zanic 实验室成员提供的帮助与支持。

作者声明无利益冲突。作者披露在文本修改和校对过程中使用了 OpenAI 的 ChatGPT-4o。

本实验方案的主要目标是设计并制备一种适用于微管力学研究的微流控装置 体外该设计旨在利用基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置的固有优势，同时整合多种特性，以实现稳定且可定制的高通量实验。
这一目标已成功实现，形成了可作为未来用户使用该系统基础的制备方案和通用指南。设备中冗余气泡捕获结构的引入降低了因存在气泡而导致蛋白质变性的可能性。尽管目前在实验过程中仍需对管路进行部分插拔操作，但这些气泡捕获结构显著减少了实验失败的概率。未来对微流控系统的进一步改进有望进一步减少实验过程中所需的手动管路操作。此外，将微流控装置与自动流体控制软件集成，可在显著定制化实验条件的同时，降低人为操作误差的可能性。我们通过制备该装置，并在其中利用自动、控制器调控的流体实现微管蛋白突起的生长、稳定与弯曲，验证了装置的成功运行。进一步地，通过在同一装置内建立不同荧光标记微管蛋白溶液的浓度梯度，我们证明了可在单个装置中同时运行多种实验条件。结合计算建模与分析技术，本系统能够探测并确定微管的生物力学特性，例如弯曲刚度52,56,57,58,59。
未来的潜在改进将有助于实现更稳健的系统及相关的实验分析。首先，光刻胶的沉积、曝光和烘烤是表现出一定变异性的关键参数。由于表面等离子体共振（SPR）光刻胶的特征尺寸相对较高，需要非常缓慢地升温和降温，以防止热裂，否则可能损坏器件。尽管曾尝试制备更薄的器件，但我们发现操作这些更小特征尺寸时存在困难。在使用SPR光刻胶复制此类厚度器件时，细致入微的关注和耐心至关重要。根据不同条件下的可获得性，也可选用其他类型的光刻胶来解决这一问题。
综上所述，本文所述的微流控装置与实验方案可支持多种实验设置，相较于以往的流动池检测方法，具有更可靠的高通量测试能力47此外，可通过使用流量控制器来自动生成精确的流速分布或浓度梯度，从而降低人工操作带来的实验变异性。该实验装置未来的潜在应用包括研究微管相关蛋白对微管弯曲刚度、动态行为、晶格损伤与修复的影响，以及微管与肌动蛋白丝之间的生物力学相互作用。54,60,61,62,63,64,65,66,67,68,69,70微加工技术、自动流体控制以及计算建模与分析技术的整合，构建了一个适用于研究细胞骨架的多功能系统 体外.

微流控技术通过精心设计和制造流体通道，能够精确控制微量流体体积（通常小于一微升）1,2。微流控装置的小尺度引发了独特的工程现象。具体而言，雷诺数——表征流体流动中惯性力与粘性力之比的无量纲参数——在微流控中通常很小，一般为O(10)或更低，这凸显了粘性力在微流控装置中的主导作用。此外，佩克莱特数（Péclet number）用于比较对流输运与扩散输运，其数值表明在微流控中对流输运通常可忽略不计3,4,5。微流控中这种以扩散为主导的层流状态具有优势，因其可通过维持精确的流体浓度梯度，实现在单一装置上并行开展多个实验。
光刻技术仍是制造微流控器件的主要方法6,7,8。简而言之，该过程包括创建微流控设计的蚀刻模板“母版”（图1）。首先制备一种光敏基底，并使用微流控设计的光掩模选择性地将光刻胶区域暴露于紫外辐射下。随后通过蚀刻工艺处理基底，形成设计的浮雕结构。聚二甲基硅氧烷（PDMS）通常被浇铸并固化在母版上。固化后的PDMS复制了设计的负形结构，随后从母版上剥离，并键合到玻璃盖玻片上。整个制造过程通常需要1–2天，可实现快速的设计迭代以及多个器件的批量制备。有关软光刻及微加工工艺的详细综述可参见其他文献1,2,3,10,11,12,13。
<img alt="光刻工艺示意图：紫外曝光、光刻胶显影、PDMS模具制备步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：传统光刻工艺与微加工工艺的概述。（A）传统光刻工艺和（B）微加工工艺。根据应用需求及所需光刻胶特性，可选用负性或正性光刻胶，尽管两者均可获得相同的设计母版。所需的特征高度或光刻胶熔点等特性有助于确定合适的光刻胶类型。本图经Rogers（2022）14许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
微流控技术的应用已拓展至众多研究领域，其中对生物科学的影响尤为显著。由于其微小的尺度，微流控系统能够对有限且珍贵的资源（如细胞或蛋白质）进行精确操控。更为重要的是，微流控系统可调以模拟生理条件，例如基底刚度的改变、对样本施加力学力，甚至整合电流刺激。此外，微流控技术还具备并行操控多种试剂的能力，并可快速进行系统设计的原型构建与迭代优化。这些特性使得将整个实验室工作流程微型化并集成于单一装置成为可能，该装置通常被称为“芯片实验室”1,6,9,15,16,17,18,19。
微流控技术在细胞生物学中的一项应用是研究微管聚合物。微管是细胞骨架的重要组成部分，在细胞分裂和细胞内物质运输等过程中发挥着关键作用20,21。作为细胞骨架中最刚性的结构元件，微管的弹性模量与有机玻璃（Plexiglass）相当22,23。其优异的力学性能对于多种细胞功能至关重要，例如心肌细胞的收缩过程，在心脏的收缩期和舒张期中微管会周期性地弯曲和松弛24。此前，研究人员已采用微流控装置在体外（in vitro）研究微管及其高级结构的特性。事实上，微流控技术已被用于探究微管的聚合动力学、微管与微管之间的相互作用，以及微管相关蛋白对微管力学性能的影响25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41。
尽管微流控技术的引入为微管研究领域带来了许多令人振奋的发现，但这些装置在微管研究中的应用仍有改进空间。在本研究中，我们针对微流控装置中研究微管时仍存在的两个具体局限性进行了探讨：一是装置内可能产生气泡，通常由对微流控装置的手动操作引入；二是高通量分析方法的利用不足。首先，诸如插拔管路等手动操作可能将气泡引入通道中。流动池内形成气泡是灾难性的，因为气泡可导致蛋白质变性、剪切微管聚合物，并对细胞培养产生不利影响42,43。此外，装置中的尖锐拐角和斜角会导致表面润湿不均，从而增加夹带空气的可能性。目前已开发出多种技术以减少气泡的形成、存留及其影响；然而，气泡抑制方法的应用尚未普及42,43,44,45,46。此外，尽管微流控技术的主要优势之一是能够实现高通量实验，但该技术尚未被用于扩大微管研究的规模。微流控装置可被设计为在同一装置上并行测试多种实验条件。例如，可通过流体梯度引导不同的微管相关蛋白或药物流动，从而实现将其靶向递送至同一装置内分区微管的特定区域。
在此，我们通过迭代设计了一种微流控装置，以解决上述局限性。我们提供了该装置制备的逐步操作方案，从而使更广泛的科研人员能够在微管研究中应用微流控技术。该装置设计集成了气泡捕获结构，并采用自动流体控制系统，以减少人工干预，同时可在装置内形成溶液浓度梯度，实现高通量分析。总之，该微流控装置的设计将有助于推动对微管力学性质的更广泛研究与理解，并为整个微管研究领域的实验设计提供有价值的改进。

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 微量离心管（透明）</td><td>任意品牌</td><td></td><td>推荐使用低吸附型</td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管（透明）</td><td>任意品牌</td><td></td><td>推荐使用低吸附型</td></tr><tr><td>1.5 mm 标准活检打孔器</td><td>Integra LifeSciences</td><td>33-31A-P/25</td><td></td></tr><tr><td>100x/1.49 数值孔径 TIRF 物镜</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 × 22 mm 玻璃盖玻片</td><td>ThorLabs</td><td>CG15CH</td><td></td></tr><tr><td>3&quot; 单面抛光硅片</td><td>University Wafer</td><td>447</td><td></td></tr><tr><td>4&quot; 培养皿</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>450 &amp;micro;L 开顶超透明薄壁管</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>345843</td><td>在实验方案中称为“airfuge 管”</td></tr><tr><td>488 nm、561 nm 和 640 nm 固态激光器</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>A-95 固定角转子</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347595</td><td></td></tr><tr><td>丙酮</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Airfuge 气动超速离心机</td><td>Beckman Coulter, Inc.</td><td>347854</td><td>在实验方案中称为“airfuge”</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 微量蛋白质标记试剂盒</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A30006</td><td></td></tr><tr><td>铝箔</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor iXon Ultra EM-CCD</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Andor NEO sCMOS</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD</td><td>Autodesk</td><td></td><td>可使用通用版本</td></tr><tr><td>牛脑未标记微管蛋白（纯化）</td><td>N/A</td><td></td><td>可自行制备，也可购买</td></tr><tr><td>酪蛋白</td><td>MilliporeSigma</td><td>C7078</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>洁净干燥空气（CDA，加压气体）</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>压缩空气供应装置</td><td>任意品牌</td><td></td><td>连接至微流控流速控制器</td></tr><tr><td>COMSOL Multiphysics 软件</td><td>COMSOL, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>定制黄铜载物台适配器</td><td>N/A</td><td></td><td>自行制备，用于将 22 mm × 22 mm 盖玻片安装至显微镜</td></tr><tr><td>去离子水</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>干燥器</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>MilliporeSigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>MilliporeSigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MilliporeSigma</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Elveflow Smart Interface（ESI）软件</td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无法兰 PFA 接头，ETFE &amp;frac14;&amp;rdquo;-28 转 1/16&amp;rdquo; 外径卡套&amp;nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-XP-245X</td><td>用于通过加压储液架将微管源瓶的管路连接至流速传感器</td></tr><tr><td>Fluiwell 4 通道 2 mL 低压储液架</td><td>Fluigent</td><td>14002001</td><td>用于连接流控系统与微管，也称为“加压储液架”</td></tr><tr><td>通风橱</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖氧化酶</td><td>MilliporeSigma</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td></td></tr><tr><td>鸟苷三磷酸（GTP）</td><td>MilliporeSigma</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>加热板</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HS-625 高速发射滤光轮</td><td>Finger Lakes Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ 软件</td><td>N/A</td><td></td><td>开放获取</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Karl Suss MA-6 掩模对准器</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>MilliporeSigma</td><td>1.05833</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB 软件</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEGAPOSIT SPR 220 7.0 光刻胶</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微流控接头 6-40 转 1/4&quot;-28 适配器套件</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-08</td><td>用于通过加压储液架（Fluiwell 架）将微管源瓶的管路连接至流速传感器</td></tr><tr><td>微流控接头 雌性鲁尔锁紧适配器套件</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>LVF-KFI-04</td><td>用于将注射器连接至管路</td></tr><tr><td>微流控流速控制器</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3+</td><td></td></tr><tr><td>微流控流速传感器</td><td>Elveflow</td><td>MFS3</td><td>该流速传感器量程为 0–80 &amp;mu;L&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>MICROPOSIT MF-319 显影液</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements 软件</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氮气（加压气体）</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td>Tokai Hit</td><td></td><td></td></tr><tr><td>一体式手指拧紧 10-32 锥形接头，用于 1/16&quot; 外径管路&amp;nbsp;</td><td>Darwin Microfluidics</td><td>CIL-F-120X</td><td>用于将注射器连接至管路</td></tr><tr><td>紫杉醇（Taxol）</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1097</td><td></td></tr><tr><td>光刻掩模</td><td>N/A</td><td></td><td>由外部单位根据我们的设计制作</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>172615000</td><td></td></tr><tr><td>等离子清洗仪</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G</td><td></td></tr><tr><td>等离子流量计系统</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-FMG</td><td>与等离子清洗仪集成，用于控制加压气体的流量</td></tr><tr><td>塑料洗耳球移液管</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>MilliporeSigma</td><td>P2443</td><td>在实验方案中称为“泊洛沙姆 407”</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Research Products International</td><td>P41000</td><td></td></tr><tr><td>Saint Gobain Performance Plastics&amp;nbsp;Tube Tygon .020 内径管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50-206-8921</td><td>在实验方案中称为“1.5 mm 管”和“管”</td></tr><tr><td>手术刀</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>旋涂仪</td><td>Cost Effective Equipment, LLC.</td><td>200x</td><td>该型号可能已停产</td></tr><tr><td>标准移液器及吸头套装</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>标准塑料注射器</td><td>任意品牌</td><td></td><td>我们使用了 10 mL 鲁尔滑动式注射器</td></tr><tr><td>Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒</td><td>Dow, Inc.</td><td></td><td>在实验方案中称为“PDMS”和“固化剂”</td></tr><tr><td>T339 带唇密封和平头螺帽的微管</td><td>Medline Industried, LP.</td><td>T339</td><td>在实验方案中称为“源瓶”。我们使用了 0.5 mL 和 1.5 mL 两种规格</td></tr><tr><td>TAMRA, SE；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明琥珀酰亚胺酯</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td>在实验方案中称为“TTR”</td></tr><tr><td>三氯(1H,1H,2H,2H-全氟辛基)硅烷</td><td>MilliporeSigma</td><td>448931</td><td></td></tr><tr><td>Trion Phantom RIE ICP&amp;nbsp;</td><td>Trion Technology, Inc.</td><td></td><td>该等离子清洗仪仅在实验方案的步骤 1.1 中使用。也可使用其他等离子清洗仪（如用于 PDMS 键合的设备）替代；但我们更偏好该系统所能达到的更低真空度，以清洁硅片</td></tr><tr><td>TRITC 多克隆抗体</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A6397</td><td>在实验方案中称为“抗罗丹明抗体”</td></tr><tr><td>镊子</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>真空泵</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

基于微流控技术的微管聚合力学研究方法的开发

Development of a Microfluidics-Based Approach for Investigating Microtubule Polymer Mechanics

在本方案中，我们描述了一种用于研究微管聚合物力学特性的微流控装置的设计与制备方法。该设计利用了基于聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane, PDMS）的微流控装置的固有优势，并引入了多项功能，以实现稳定且可定制的高通量实验方法。所开发的装置具备多重气泡捕获能力，可防止有害气泡的产生。此外，该装置可与自动化流体控制系统连接，减少人工干预，实现高通量分析。本研究采用商业仿真软件，以更深入地优化并理解该系统中的流体输运行为。最后，我们通过在装置的不同区域生长带有不同荧光标记的微管延伸结构，展示了在同一装置内同时进行多个实验的能力。总体而言，该微流控流动系统可用于探究微管聚合物的力学特性，并为更广泛的微管体外（in vitro）研究提供了实验设计上的改进。微细加工、自动化流控与计算建模方法的结合，构建了一个灵活的系统，非常适合用于体外（in vitro）研究细胞骨架的力学行为。

微流控装置设计原理 
本研究中微流控装置的设计基于若干关键特性（图2），在传统简易流动池设计的基础上进行了构建与改进。值得注意的是，该微流控装置的内部体积约为 ~160 nL，显著小于传统流动池的约 ~10 µL 体积47，从而能够更精确地控制可能较为珍贵的试剂（如纯化蛋白组分）的使用。由于微流控流速控制器包含两条调节通道，因此本装置的设计假设在任意时刻仅有两个进/出口端口具有压力控制。如有需要，也可实现更多受压力控制的通道。
<img alt="用于芯片实验室系统中流体隔离的带气泡捕获结构的微流控装置示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：微流控装置设计示意图。 周边的矩形标记用于辅助观察通道边缘。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
中央的矩形装置腔室作为主要成像区域，用于固定微管成核点，并使微管从这些成核点上发生聚合延伸。腔室两侧与流体通道相交，沿x轴方向的直线通道作为进样口和出样口，以实现反应溶液的快速更换。微管进样通道也用于将微管成核点引入腔室，通过层流作用使成核点沿流动方向结合到玻璃表面。在垂直方向（y轴），流体通道向腔室一侧分支为多个更细的通道，类似于此前的一些设计25,28,36,39。这种分支结构特别适用于研究微管的力学特性。从垂直于微管成核点取向的方向向中央腔室注入溶液，可在接近垂直的角度施加由流动引起的弯曲力。此外，多个细小流体通道组成的分支结构有助于在中央腔室较大区域内实现更均匀的力分布，而这是简单的单通道流体结构所无法实现的。因此，尽管分支结构看似更为复杂，但它能够降低确定作用于微管上受力大小的整体复杂性（图3）。该设计还具有多条对称轴，便于操作，并可从多个方向评估弯曲行为（例如，顶部与底部对比）。
<img alt="流体动力学模拟示意图；颜色梯度和速度矢量显示流动模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig03.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：引入分支结构可产生较大范围的相似流动区域。 两种装置设计在稳态流动下的模拟结果：一种无分支通道（A），另一种具有分支通道（B）。箭头表示局部流动方向，其长度与流速大小成正比。表面颜色表示中心线处的流速。右侧图像显示了装置的局部放大区域，在该区域中微管（未显示）沿x轴取向将受到从顶部入口流入、底部出口流出的流体所产生的弯曲力作用。引入分支通道可增大受到相似速度场作用的相对面积，同时不增加所需试剂体积。本图经Rogers（2022）14许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig03large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
值得注意的是，该装置还在入口和出口流道中设置了一系列气泡捕获结构，以防止气泡进入中央成像室。具体而言，我们在流道路径中设计了微柱阵列，利用表面张力阻止气泡通过（图2）46。此外，为了防止空气卷入，我们将装置内部的边缘设计为平滑曲线，而非倾斜角度。综上所述，这些设计特征降低了气泡产生的可能性，提高了装置的稳定性。
微流控器件的制备 
确定用于制备器件母版的合适参数需要进行一些优化。如先前观察到的，该光刻胶对光刻步骤中的关键操作参数（如环境光照以及加热和冷却速率）非常敏感50。例如，若母版在加热后冷却过快，则光刻胶中可能产生热裂纹。这是不可取的，因为裂纹会破坏通道的完整性。虽然可通过将光刻胶重新加热至接近其相变温度（约115 °C）来消除裂纹，但我们发现，让母版在热板上自然冷却至室温是防止开裂最可靠的方法。此外，过强的环境光可能导致光刻胶意外曝光，从而削弱其结构，使得器件特征结构本身（在显影后应保留在晶圆上）在显影过程中发生部分剥离。因此，我们建议在曝光后烘烤及室温下过夜冷却的次日再进行显影步骤。此外，当器件母版不使用时，建议将其储存在避光环境中或用铝箔包裹，以防止随时间推移发生降解。一旦确定了这些参数，光刻工艺便具有高度的可重复性（图4）。
制作好模具后，将液态PDMS浇注在模具表面，使其固化，从而形成模具结构的负模。我们发现，将PDMS浇注至2-3 mm厚度时，便于后续对器件的操作；相比之下，若采用旋涂法获得同等厚度，则 µm 在该范围内，PDMS 容易撕裂或发生自粘，导致操作困难。此外，较厚的 PDMS 层更便于插入导管，因为导管可稳固地置于进样/出样端口，无需使用密封剂或夹具。
最后，尽管这些生物应用的传统流动池实验通常使用经Piranha溶液（过氧化氢和硫酸）预清洗并硅烷化处理的玻璃盖玻片，但我们发现经过长时间等离子清洗和异丙醇（IPA）洗涤处理的盖玻片已能满足我们的实验需求47。其他应用，例如单分子成像，可能需要更复杂的盖玻片处理方法。
<img alt="OB1 系统中的微流控装置、显微镜设置、实验分析的试剂流控。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig04.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：光刻工艺。（A）具有理想设计图案的掩膜版（由镀铬玻璃蚀刻制成）。（B）由于热应力导致硅晶圆上的光刻胶出现轻微裂纹（箭头标示出部分裂纹）。这些裂纹通常贯穿整个晶圆。（C）显影后的模具母版。（D）显微镜下的微流控装置。各个组件以绿色标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
微管的生长、稳定与弯曲 
GMPCPP诱导生长的微管种子可作为微管延伸的成核位点，其自身在室温下数小时内均能保持稳定，不易发生去聚合。这些微管种子通过抗罗丹明抗体固定于微流控通道中的玻璃盖玻片上47。随后，在可溶性微管蛋白（荧光标记但未偶联罗丹明）和GTP存在条件下，诱导动态微管延伸的聚合。通过这种方式，微管种子的成核位点被固定在玻璃盖玻片上，而延伸部分则未被固定。在15分钟的延伸生长期间，微管延伸部分发生随机的聚合与去聚合行为，这是其固有的动态不稳定性所致49。生长阶段结束后，使用10 µM紫杉醇进行洗脱，以清除溶液中残留的微管蛋白，并稳定已形成的微管延伸结构。此稳定步骤至关重要，否则在微管蛋白耗尽后，微管延伸部分将发生去聚合。除了结合并稳定微管聚合物外，已有研究表明紫杉醇还会影响微管聚合物的力学性质，并可能诱导原本呈线性结构的微管延伸部分产生弯曲51,52,53,54。本文展示的结果反映了这些现象；然而，微管延伸部分的卷曲是不理想的，因其在弯曲过程中会导致晶格受力不均。因此，仅选取在稳定后仍保持相对笔直的微管用于弯曲分析。另一种方法是，在初始生长阶段之后，采用含有微管蛋白和GMPCPP（而非初始使用的GTP）的溶液进行第二轮生长，从而在微管晶格的生长末端形成稳定的“帽”结构，防止去聚合55。
随后，通过压力控制系统将缓冲溶液流入，使微管发生弯曲，以保持上游压力恒定（图5，补充视频1）。通过这种方式，我们可以近似估算微管所经历的局部流动情况。液体从顶部流入，并从底部装置端口流出，从而使流动方向与微管的接种方向垂直。
<img alt="在流动条件下可视化GMPCPP种子中微管的顺序生长；显微镜延时成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig05.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：微流控装置可用于弯曲已稳定的微管。经紫杉醇稳定后处于静息状态的微管在脉冲流作用下发生弯曲。上游恒定压力为 30 mbar，驱动液体流动（箭头表示流动方向）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig05large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
微流控装置中流体剖面的测定 
微流控通道中的中心线流速可通过 COMSOL 软件进行计算模拟（模拟软件，图 6A）。然而，微管在表面附近约 100 nm 范围内附着于玻璃盖玻片，以用于全内反射荧光显微镜（TIRF）观察。因此，微管所经历的流速与二维模拟所预测的流速并不相同。为了估算微管所经历的局部流场，我们采用了一维不可压缩流体流动的通用纳维-斯托克斯方程：
<img alt="流体动力学方程 \(v_y(z) = v_c(1-(z/h)^2)\)，用于说明速度分布。" src="/files/ftp_upload/68185/68185eq02.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 2">
其中，z 为装置内微管的高度，h 为装置的总高度，vc 为装置内的中心线流速。根据系统定义，z 轴原点位于装置中心（图 6B）。采用该定义及 13 µm 的通道高度，微管的高度近似为 z = -6.4 µm。求解该方程可得到微管所经历的局部流体流速的估计值：
<img alt="速度计算 \(v_y(6.4) = 92 \mu m/s\)，用于物理分析的方程。" src="/files/ftp_upload/68185/68185eq03.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="方程 3">
<img alt="微通道流速场的流体动力学示意图，包含方向箭头和颜色梯度。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig06.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图6"> 
图6：定义流体从顶部入口进入、底部出口流出（端口未示出）的流动系统分析模型。（A）中心线速度场的缩放模拟结果，如图3B所示。星号表示B图中关注区域。（B）装置的横截面示意图。充分发展流的流动方向为y方向，在z = 0处的中心线速度为vc，壁面处满足无滑移边界条件。注意：本图中的箭头相对于A图中实际速度场未按比例绘制。本图经Rogers（2022）14许可修改。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
除了模拟之外，还可以使用基于体积流量而非恒定压力的流量控制器来调节流体速度。此外，通过加入荧光微球并监测其移动速度，可直接测定每个装置内的局部流速，从而消除样品间的差异性。
计算模拟与浓度梯度演示 
最后，我们结合计算模拟与实验，验证了利用该装置进行高通量实验的可行性。计算结果表明，得益于装置的对称性，微管可在多个方向上发生弯曲，同时装置能够维持精确的浓度梯度，从而实现在同一装置内同时研究多种实验条件（图7A）。初步实验（方法未明确列入本出版物）通过在溶液中使用荧光染料，验证了实验结果与计算预测的一致性（图7B）。此外，我们通过同时生长带有不同荧光标记的微管延伸结构，成功展示了不同蛋白质在装置不同区域内的分区行为（图8）。据我们所知，这是首次将高通量微流控技术应用于微管研究。该装置的这一特性可用于减少实验所需时间和试剂用量，同时提高实验的稳健性。例如，可在单个装置内同时研究不同蛋白质或同一蛋白质在不同浓度下对微管力学与动态行为的影响。
<img alt="微流控装置扩散、浓度梯度示意图及荧光显微镜图像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig07.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图7"> 
图7：浓度梯度形成。（A）两种溶液在相同入口压力（50 mbar）和浓度（15 µM）下进入装置时的梯度模拟。每种溶液的入口端口以彩色箭头标示（一种溶液从顶部端口进入，另一种溶液从右侧端口进入），其余两个端口作为出口。热图显示了顶部溶液的浓度分布。在 t = 5 s 时达到稳态。（B）通过在顶部端口使用荧光染料溶液、右侧端口使用缓冲液，实验生成类似的梯度。图像由多个视野（80 µm × 80 µm）拼接而成的栅格层构成，以完整呈现整个装置区域。本图经 Rogers（2022）许可修改自原文14。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用 A647 和 A488 标记的微管蛋白聚合荧光显微图像，显示流动方向。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68185/68185fig08.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 8"> 
图 8：微流控装置中蛋白浓度梯度的展示。将 AlexaFluor647 标记的微管蛋白（品红色）从入口 1 注入，同时以相同浓度和流速将 AlexaFluor488 标记的微管蛋白（绿色）从入口 2 注入。通过每 90 秒交替开启和关闭流体，使微管蛋白在稳定的 GMPCPP 种子（红色）上发生聚合，同时抑制混合。（A）通过拼接多个视野（80×80 µm）生成的大范围光栅图像，以完整呈现装置全长。字母表示后续各图中单个视野的相对位置。比例尺在 X 和 Y 方向均为 50 µm。（B）靠近装置入口 1 的视野，此处的微管延伸主要由 A647 标记的微管蛋白构成。（C）位于装置中部附近的视野，此处的微管延伸由两种标记的微管蛋白混合组成，符合预期。（D）靠近装置底部的视野，此处的微管延伸主要由 A488 标记的微管蛋白构成。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/68185fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
显微镜上微流控实验装置的流程图见补充图1。
补充图1：显微镜下微流控实验装置的流程图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充视频 1. 微流控装置可用于弯曲稳定的微管。经紫杉醇稳定后的微管在静息状态下于脉动流中发生弯曲。上游恒定压力为 30 mbar，驱动液体流动。视频播放速率为 10 fps。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/Supplementary%20Video1.avi" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件1：微流控掩模设计的CAD文件。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68185/Supplementary%20File1.dwg" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

本方案详细介绍了适用于研究微管聚合力学的微流控装置的设计与制备方法。通过结合微加工技术、自动流体控制和计算建模技术，构建了一个灵活的系统，特别适用于细胞骨架的力学特性探究。 体外.

在本方案中，我们描述了一种用于研究微管聚合力学的微流控装置的设计与制备方法。该……

微管是细胞骨架聚合物，在细胞分裂和细胞内运输中发挥着关键作用。在本研究中，我们采用微流控技术在体外研究微管的力学特性。本工作解决了在微流控装置中研究微管的两个具体局限性：一是存在气泡的可能性，气泡可能导致蛋白质变性；二是缺乏高通量检测方法的应用。我们的微流控装置和实验方案支持多种实验设置，相较于先前的流动池检测方法，具备更可靠的高通量测试能力。[讲师] 首先，在真空条件下使用氧气或洁净干燥空气等离子体对一片三英寸硅片进行等离子清洗，持续五分钟。确保真空压力低于5×10⁻⁵托。将清洗后的硅片居中放置于旋涂仪上，用于光刻胶沉积，并在硅片中心滴加1至2毫升SPR 227.0光刻胶。以1000转/分钟的转速旋涂30秒，形成厚度为13微米的光刻胶层。在尽量避免接触涂覆表面的前提下，将硅片转移至设定为70摄氏度的加热板上。将硅片在加热板上孵育，每3至5分钟升高温度10摄氏度，直至温度达到115摄氏度。随后关闭加热板，使硅片冷却至温度低于65摄氏度。使用镊子将冷却后的硅片转移至掩模对准仪中。根据制造商或现场特定规程，将硅片和相应的光掩模装入对准仪，然后以约400毫焦耳/平方厘米的能量对硅片进行紫外光曝光。使用公式计算所需的曝光时间。在重新水化和热处理后，将硅片浸入适当的显影液中。随后用去离子水轻轻冲洗硅片两面30秒。使用氮气干燥显影后的硅片，然后将其转移至干燥器中。在干燥器内放置一个小的铝制容器，并向其中加入一滴硅烷。在干燥完成后，将混合并脱气的聚二甲基硅氧烷（PDMS）倒入培养皿内的母模中。将培养皿在65摄氏度下孵育过夜，使PDMS完全固化。围绕器件结构特征，使用手术刀或剃刀片从母模层上切割出矩形PDMS块。确保每块PDMS具有足够的侧翼空间以实现良好的键合接触，并能适配22×22毫米的玻璃盖玻片。将PDMS放置在备用的牺牲性PDMS层上，避免接触硬质表面。然后使用洁净的1.5毫米打孔器在每块PDMS上打出进样口和出样口孔洞。取出一片22×22毫米的玻璃盖玻片，用浸有异丙醇的擦拭纸清洁。随后在真空条件下使用洁净干燥空气等离子体对玻璃盖玻片进行五分钟的等离子清洗。在放置前，先用浸有异丙醇的擦拭纸分别擦拭玻璃盖玻片和PDMS的功能面，然后将两者一同放入等离子清洗仪中，在真空条件下使用洁净干燥空气等离子体同时清洗30秒。清洗完成后，将PDMS翻转，使其功能面朝下。将PDMS放置在玻璃盖玻片上，并轻轻按压以促进键合。通过使缓冲液溶液垂直于微管延伸的生长方向流动，实现了对稳定微管延伸的弯曲，展示了该器件施加定向力的能力。基于纳维-斯托克斯方程的模拟与解析建模计算得出，微管所经历的近表面流速为92微米/秒。计算模拟表明器件内形成了稳定的梯度，这一结果通过荧光染料实验得到验证，显示出可预测的浓度分布模式。双标记微管延伸实验确认了基于梯度的空间分区现象，不同荧光蛋白在器件的不同空间区域占据主导地位。

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生物工程

开发基于微流体的方法，用于研究微管聚合物力学

我们介绍一种在带有金微电极的硅基底上形成聚乙二醇自组装单分子层（PEG-SAM）的方法。该PEG-SAM通过一步法形成，可防止硅和金表面的生物污染。随后利用电泳技术实现生物分子在纳米尺度上的图案化。...

用于图案化生物分子的微电极上防污自组装单分子层

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微管是本质上不稳定的多聚体，其在生长与缩短之间的转换具有随机性且难以控制。本文描述了使用带有可光解稳定帽的节段化微管的实验方案。通过高时间和空间分辨率触发节段化微管的去聚合，从而有助于分析由微管解聚末端所驱动的运动过程。...

制备分段微管以研究由微管末端解聚驱动的运动

芽殖酵母是研究微管动态的有利模型 体内 由于其强大的遗传学特性和微管细胞骨架的简单性。以下实验方案描述了如何转化和培养酵母细胞，获取共聚焦显微镜图像，以及在活体酵母细胞中对微管动态进行定量分析。...

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利用转盘显微镜测量单极有丝分裂纺锤体中微管的动力学

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我们介绍一种实验方案，可同时实现干涉反射显微镜与全内反射荧光显微镜，用于动态微管及荧光标记的微管相关蛋白的同步成像。...

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基于微流控技术的微管聚合力学研究方法的开发

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