经验证的免疫化学检测试剂盒，用于全面测定从细胞中释放并结合到细胞的人表皮生长因子受体 2
2025年5月9日
我们提出了一种使用新型抗 HER2 单克隆抗体的经过验证的夹心 ELISA 测定法。该检测试剂盒能够对 体外 培养细胞和其他样品（包括血液和组织）中细胞结合和释放的 HER2 蛋白进行精确定量。
我们提出了一种经过验证的三明治 ELISA，它使用新型单克隆抗体，能够精确定量体外培养细胞和患者样本的 HER2 蛋白的细胞结合和释放的细胞外结构域。
该协议满足了对准确和经过验证的测定的需求，以将循环 HER2 蛋白的浓度与诊断和研究中的疾病临床表现相关联。
检测的广泛工作范围、多种样品类型和结果的可靠性可能为在体外和体内模型中全面分析受体状态开辟新的机会。
开发的 ELISA 将用于定量从癌症组织释放到不同人体排泄物（如血液、腹膜液或粘液）中的 HER2。
[导师]开始在细胞达到80%汇合度后使用胰蛋白酶分离细胞，并将它们收集到单独的15毫升锥形管中。使用自动细胞计数器对细胞进行计数后，在含有一毫升生长培养基的 12 孔板中接种 3 次方 10 倍，每孔 5 个细胞的幂。将培养物在37摄氏度下在含有5%二氧化碳的加湿气氛中孵育。从24小时培养中，将培养基从每个细胞系的一个孔中收集到1.5毫升管中。将收集的样品在4摄氏度下以10,000 G离心10分钟，并将上清液转移到新管中，在零下20摄氏度下储存。用一毫升冷PBS洗涤每个孔中的剩余细胞，轻轻吸出并丢弃PBS。然后，向每个孔中加入 200 微升补充 1% 蛋白酶抑制剂的 RIPA 缓冲液并孵育 5 分钟。现在，用细胞刮刀刮擦细胞，并通过移液数次混合裂解物以使其均质化。将裂解的细胞收集到一个新管中，然后慢慢地将样品吸入装有0.8 x 40毫米的21号针头的两毫升注射器中。吸出5至10次后，将收集的样品在4摄氏度下以10,000 G离心10分钟，并将上清液转移到新管中，在零下20摄氏度下储存。在编码缓冲液中将抗HER2捕获抗体稀释至每毫升1微克。使用多通道移液器，将 100 微升捕获抗体溶液添加到 96 孔 ELISA 板的每个孔中。用密封膜覆盖板。将板在四摄氏度下孵育过夜。孵育过夜后，将板在室温下置于水平微孔板振荡器上一小时。使用微孔板清洗机，吸出包被溶液，并用 300 微升 PBST 洗涤每个孔 3 次。然后，使用多通道移液器，将 100 微升含有 5% 脱脂奶粉的 PBS 封闭缓冲液添加到每个包被孔中，以封闭非特异性结合位点。现在，准备校准曲线和阳性对照。将两微升每毫升一毫克的HER2储备溶液加入1,998微升PBS中，制成每毫升1000纳克的工作标准溶液。对于标准二，将 500 微升标准一添加到 500 微升 PBS 中并充分混合以达到 50 纳克/毫升浓度。制备连续稀释液以生成标准品三到七。接下来，使用PBS细胞裂解物和加标已知HER2浓度的培养基制备基质样品。用2.5微升裂解物和5毫升PBS稀释细胞裂解物1至2000，以获得低于检测限的HER2水平。要制备每毫升 2 纳克的溶液，请将 8 微升标准 1 添加到 392 微升 PBS 培养基或细胞裂解物中并充分混合。使用单通道移液器，将 100 微升标准品 PBS 空白和测试样品一式三份加入包被和封闭的 ELISA 板的各自孔中。在湿度室中以 37 摄氏度放置一小时后，使用微孔板清洗机清洗板。要检测抗体结合，请将 PBS 中的生物素化检测抗体稀释至每毫升 1 微克的工作浓度。然后，使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 微升这种检测抗体溶液。接下来，在 40 毫升 PBST 中将 AVID 和 HRP 偶联物 1 稀释至 40,000。使用多通道移液器，向每个孔中加入 100 微升稀释的偶联物。孵育和洗涤板后，使用多通道移液器向每个孔中加入100微升3,3 5,5四甲基联苯胺底物，以引发色度反应。然后，用密封膜盖住板子。 将板在37摄氏度下孵育一到五分钟，在监测颜色显色的同时保护其避光。当达到所需的颜色强度时，向每个孔中加入 100 微升终止溶液以终止反应。最后，使用酶标仪测量450纳米处的吸光度。使用四参数校准曲线，根据曲线方程计算样品浓度。开发的三明治 ELISA 展示了 HER2 蛋白的工作范围，从 1.56 到 100 纳克/毫升，决定系数为 1，表明匹配性极佳。对于所有测试的细胞系，培养基中的 HER2 浓度随着时间的推移而增加，在 72 小时时值最高。在培养基中，SK-OV-3 和 SK-BR-3 细胞的 HER2 浓度分别比培养基中的 MDA-MB-231 细胞高出约 10 倍和 50 倍。同样，SK-OV-3和SK-BR-3裂解物中的HER2水平分别高出约3倍和5倍。有趣的是，与全细胞裂解物中发现的膜结合蛋白相比，细胞培养基所含的测试抗原浓度低 1000 倍。
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概述
本文介绍了一种利用新型抗HER2单克隆抗体的经过验证的夹心ELISA检测方法。该检测方法允许精确定量体外培养细胞和各种样本（包括血液和组织）中的细胞结合和释放的HER2蛋白。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物化学
- 诊断学
背景
- HER2是一种在癌症生物学中起关键作用的蛋白质。
- 准确测量HER2水平对诊断和治疗监测至关重要。
- 现有的检测方法可能缺乏验证或精确度。
- 本研究解决了测量HER2浓度可靠检测方法的需求。
研究目的
- 开发一个经过验证的检测方法来定量HER2蛋白水平。
- 将循环HER2蛋白浓度与疾病的临床表现相关联。
- 为诊断和研究应用提供一个工具。
所用方法
- 开发夹心ELISA检测方法。
- 使用新型抗HER2单克隆抗体。
- 使用体外培养细胞和患者样本进行测试。
- 验证检测方法的性能和准确度。
主要结果
- 该检测方法在定量HER2蛋白方面表现出高精确度。
- 它有效地测量了细胞结合和释放的HER2水平。
- 结果与患者样本的临床数据相关良好。
- 该检测方法适用于研究和临床诊断。
结论
- 经过验证的夹心ELISA检测方法是一种可靠的HER2定量工具。
- 该检测方法可以提高诊断准确性和治疗监测。
- 未来的应用可能包括对HER2相关疾病的更广泛的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Validated quantification of both cell-bound and released HER2 using a sandwich ELISA directly addresses the need for robust biomarker measurement in oncology discovery and translational research. This capability enhances predictive confidence in target engagement and supports risk-adjusted decisions at key inflection points in the oncology pipeline. Reliable HER2 quantification across diverse sample types enables portfolio-wide standardization and cross-study comparability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of HER2 biology by quantifying both membrane-bound and soluble forms.
- Supports functional target validation and mechanistic de-risking in disease-relevant models.
- Facilitates predictive confidence in HER2 as a therapeutic or diagnostic target.
Screening & Assay Development
- Provides a validated, reproducible assay platform for HER2 measurement in cell lines, serum, and tissues.
- Delivers quantitative outputs suitable for assay standardization and downstream screening workflows.
- Enables reliable evaluation of compound effects on HER2 expression and shedding.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro HER2 quantification with translational biomarker strategies for oncology programs.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling HER2 measurement in both cell-based and patient-derived samples.
- Reduces biological risk by providing robust, cross-sample HER2 data for translational decision-making.
Pipeline & Workflow Integration
This validated ELISA method integrates from early discovery through translational research, supporting lead identification and preclinical evaluation in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification for HER2-driven mechanisms.
- Screening: Provides assay readiness and reproducibility for compound screening and biomarker studies.
- Analytics: Delivers quantitative HER2 measurements and statistical outputs for condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro and in vivo HER2 quantification for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, validated assay adaptable across multiple oncology programs and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in HER2-targeted research.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable HER2 quantification across sample matrices.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust biomarker-driven advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and cross-program comparability in oncology pipelines.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunochemical assay development and validation.
- Needs access to ELISA instrumentation and analytical infrastructure for quantitative readouts.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptable to various biological matrices, including cell lysates, culture media, serum, and tissue extracts.
- Assay sensitivity and precision must be maintained across different sample types and experimental conditions.
