Name: 通过细胞分选分离含肺类视黄醇的细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 了解如何利用荧光激活细胞分选技术从小鼠肺组织中分离含视黄醇的活细胞。该方法揭示了视黄醇代谢在肺损伤保护中的关键作用，为肺部疾病的营养干预策略提供了新见解。

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本工作由美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所（NIH/NHLBI）R01 HL171112（资助对象：I.S.）提供的资助、由美国国立卫生研究院/国家环境健康科学研究所（NIH/NIEHS）P30 ES005022 资助的罗格斯大学环境暴露与疾病研究中心（Rutgers Center for Environmental Exposures &amp;#38; Disease）提供的职业发展奖（资助对象：I.S.），以及新泽西州立罗格斯大学（Rutgers, The State University of New Jersey）的启动资金（资助对象：I.S.）共同支持。作者谨此感谢罗格斯癌症研究所免疫监测与流式细胞术共享资源平台（Immune Monitoring and Flow Cytometry Shared Resource at the Rutgers Cancer Institute）的工作人员，该平台部分获得了美国国家癌症研究所癌症中心支持拨款（NCI-CCSG P30CA072770-5920）的资助，其对本文所呈报工作的贡献至关重要。

所有涉及小鼠的操作和实验均经罗格斯大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（IACUC 编号：PROTO202200111），并依照美国国家科学院编制的《实验动物照护与使用指南》中规定的要求进行55。
1. 实验的注意事项与准备工作
<ol>
	<li>动物饲养与操作 
	注意：可使用三个月大（10–12 周龄）的雄性和雌性小鼠进行研究。卵磷脂：视黄醇酰基转移酶缺陷型小鼠（Lrat-缺陷的， Lrat-/- 小鼠56) 在 C57BL/6J 遗传背景下的同窝年龄匹配小鼠（野生型， Lrat+/+ 小鼠被用于所述实验。通过将携带tdTomato报告基因盒（B6.Cg-Gt(ROSA)26Sor）的小鼠与特异性在成纤维细胞中表达tdTomato基因的小鼠（F-tdT小鼠）杂交，获得F-tdT小鼠模型。tm14(CAG-tdTomato)Hze/J，杰克逊实验室品系#007914）与Col1a2-CreER小鼠（B6.Cg-Tg(Col1a2-Cre/ERT,-ALPP)7Cpd/2J，杰克逊实验室品系#029567）杂交。
	<ol>
		<li>使用表达Cre的转基因小鼠模型，这是标记目标细胞群体的多种可选方法之一 体内. 
		注意：根据靶细胞的选择、Cre 表达水平、Cre 介导重组的效率以及细胞特异性，研究人员可选用任何可靠的表达 Cre 的小鼠模型。</li>
		<li>利用 tdTomato 转基因表达（通过如下所述的他莫昔芬处理）进行标记 Col1a2+ 成纤维细胞，随后通过以下所述方法从消化后的肺组织单细胞悬液中分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cre介导的重组与转基因激活 体内
	<ol>
		<li>通过腹腔注射（IP）给予F-tdT小鼠他莫昔芬，每次2 mg，每24小时一次，连续5天。</li>
		<li>注射前用70%乙醇对注射部位进行消毒。末次他莫昔芬注射后1个月，将小鼠用于实验。</li>
		<li>在分选实验前检测Cre重组的有效性。通过使用抗tdTomato抗体分离经他莫昔芬处理的F-tdT小鼠肺成纤维细胞靶细胞群，验证Cre重组的有效性及tdTomato的表达情况。Pdgfrα 磁珠和磁激活细胞分选（MACS）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶液、塑料器皿和玻璃器皿的准备 
	注意：以下所述操作步骤应遵循无菌技术。溶液配制、组织消化和细胞分离等操作均应在超净工作台内进行。溶液需使用0.2 µm滤器过滤除菌；手术器械及实验耗材应通过高压灭菌进行消毒。
	<ol>
		<li>在超净工作台内，配制不含钙、镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS without Ca²⁺, Mg²⁺）。2+/毫克2+，含有 5.3 mM KCl、0.4 mM KH2PO4，4.2 mM NaHCO₃3，137.9 mM NaCl，0.3 mM Na2HPO4，5.6 mM D-葡萄糖）用于肺灌注（每只小鼠5 mL）。使用0.2 µm滤器过滤溶液以灭菌，并将溶液注入注射器中。</li>
		<li>在超净工作台内，配制不含钙和镁的汉克斯平衡盐溶液（HBSS without Ca2+/毫克2+，含有 1.3 mM CaCl2，0.5 MgCl2·6H2O，0.4 mM MgSO₄4·7H2O，5.3 mM KCl，0.4 mM KH2PO4，4.2 mM NaHCO₃3，137.9 mM NaCl，0.3 mM Na2HPO4，含5.6 mM D-葡萄糖、0.3 mg/mL IV型胶原酶和1 mg/mL dispase，用于肺灌注（每只小鼠10 mL）。使用0.2 µm滤器过滤灭菌后，将溶液装入注射器中。</li>
		<li>在超净工作台内，用含钙的HBSS进行配制2+/毫克2+，含0.3 mg/mL IV型胶原酶、1 mg/mL分散酶和5 mg/mL DNase I，用于肺组织消化（每只小鼠10 mL）。使用0.2 µm滤器过滤除菌，并将溶液装入注射器中。</li>
		<li>在超净工作台内，向细胞培养皿（35 mm × 10 mm，每只小鼠取材的肺组织使用一个培养皿）中加入 2 mL 含钙的无菌 HBSS2+/毫克2+将含有 Ca 的 HBSS 的培养皿放置好2+/毫克2+ 置于冰上。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 肺脏灌注、消化及单细胞悬液的收集
<ol>
	<li>通过腹腔注射给予小鼠麻醉混合剂，剂量为每千克体重100 mg氯胺酮和每千克体重10 mg赛拉嗪，以麻醉小鼠。 
	注意：以下技术需要在麻醉条件下使用活体动物，以防止肺微血管内形成血凝块，否则可能限制酶对肺泡区域的进入，从而显著影响目标细胞群的后续分离。</li>
	<li>通过脚趾夹捏反应确认小鼠是否处于深度无意识状态。无反应表明动物已充分麻醉，可进行后续操作。清除手术部位的浮毛及可见的污物或碎屑，并用70%酒精擦拭手术区域以消毒。</li>
	<li>使用无菌外科器械打开腹腔和胸腔。剪开肋骨和膈肌以暴露肺和心脏。 
	注意：开胸术将确保动物死亡，因为自主呼吸可能不再发生；若操作得当，从手术开始至完成开胸术需时约3分钟，随后动物将很快死亡。</li>
	<li>剪断下腔静脉，并用吸收垫吸收流出的血液。</li>
	<li>灌注肺脏 原位 通过右心室使用带有25 G × 1针头的10 mL注射器&#34; 不含钙的无菌HBSS填充的针管，容量为5 mL2+/毫克2+如果灌注成功，肺组织会变为白色。</li>
	<li>灌注肺脏 原位 使用带有25 G × 1的10 mL注射器&#34; 含有10 mL无菌HBSS（含Ca）的注射器2+/毫克2+，含有 IV 型胶原酶（0.3 mg/mL）和分散酶（1 mg/mL）。</li>
	<li>取出肺组织，转移至含有2 mL含钙的无菌HBSS的细胞培养皿（35 mm × 10 mm）中2+/毫克2+.</li>
	<li>在超净工作台中，用无菌手术刀片（#20，适配#4刀柄）冲洗肺组织并将其切碎成小块。加入5 mL含钙HBSS，将切碎的肺组织转移至15 mL离心管中2+/毫克2+ 加入含有 0.3 mg/mL IV 型胶原酶、1 mg/mL dispase 和 5 mg/mL DNase I 的溶液至剪碎的组织中，并用 10 mL 血清移液管转移。用剩余的 5 mL 含 Ca²⁺ 的 HBSS 冲洗细胞培养皿，收集并转移残留的组织碎片2+/毫克2+ 含 0.3 mg/mL IV 型胶原酶、1 mg/mL dispase 和 5 mg/mL DNase I。</li>
	<li>将剪碎的肺组织在含 Ca 的 HBSS 中孵育2+/毫克2+ 在37 °C下，于含有0.3 mg/mL IV型胶原酶、1 mg/mL dispase和5 mg/mL DNase I的溶液中，在旋转摇床上孵育45分钟。每隔15分钟，在超净台内将剪碎的组织通过10 mL血清移液管吹打10次，以促进细胞更好地解离。</li>
	<li>将所得的细胞悬液通过100 µm细胞筛，收集单细胞至含有20 mL冷的活细胞成像溶液（含20 mM HEPES、pH 7.4的生理盐水）的50 mL离心管中，该溶液中胎牛血清（FBS）含量低于5%。在500 × g条件下离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于1 mL红细胞裂解缓冲液中，室温（RT）孵育5分钟以去除红细胞。加入20 mL含少于5% FBS的冷的活细胞成像溶液。在500 × g条件下离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 20 mL 含少于 5% FBS 的冷活细胞成像溶液中。将所得细胞悬液通过 40 µm 滤网，收集单细胞至含有 20 mL 含少于 5% FBS 的冷活细胞成像溶液的 50 mL 管中。在 500 ×g 离心收集细胞 g 4 °C 下离心 10 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 含有低于 5% FBS 的冷活细胞成像溶液中。计数细胞，并将细胞浓度调整至约 5–10 × 10⁶ 个/mL。6 细胞/毫升</li>
</ol>
3. 使用荧光激活细胞分选（FACS）分离含视黄醇的肺细胞
<ol>
	<li>取一份细胞悬液，留作未染色的设门对照。向剩余的细胞悬液中加入活死染料SYTOX Green（1:1000稀释，终浓度为30 nM）。</li>
	<li>将细胞悬液通过连接在聚苯乙烯5 mL（12 x 75 mm）收集管上的滤器。</li>
	<li>通过荧光激活细胞分选（FACS）进行细胞分离，根据细胞在455 nm处的发射光信号，分选含有类视黄醇的活单细胞。使用前向散射光（前向散射光高度/FSC-H 对比前向散射光面积/FSC-A）图进行单细胞判别。根据侧向散射光特征及SYTOX Green染色排除死细胞。</li>
	<li>在350 nm激发光下，依据455 nm发射光信号设门、分选并收集单个活的含类视黄醇细胞。 
	注：采用所述方法，可从一只小鼠肺组织中收集约5·105个含类视黄醇的肺细胞。</li>
	<li>使用流式细胞术分析软件进行FACS数据分析。</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

早在20世纪40年代，已有研究首次报道了利用荧光显微镜检测人和动物组织中维生素A的能力及其组织学可视化方法。59,60随后，视黄醇自体荧光现象被成功应用于旨在定位组织中高浓度维生素A的研究。 体外61 以及动物胚胎组织形态发生的表征62 利用荧光显微镜观察。后续通过实验观察并证实，细胞内视黄醇类物质具有独特的自发荧光特性（在 λ = 350 nm 处激发，于 λ = 455 nm 处产生特征性的蓝绿色发射光），且该特性与特定细胞类型相关，因此可用于分离和鉴定此类细胞63,64,65.
已有发表的研究利用类维生素A自发荧光来确定含类维生素A细胞的身份和/或定量肝脏<sup...

类维生素A（维生素A及其代谢物）是肺泡微环境的重要脂质成分，特定细胞类型的类维生素A代谢和信号传导对于维持发育中及成年肺脏的功能健康至关重要1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。肺细胞利用特定通路，能够高效地从血液中摄取饮食来源的循环类维生素A，即视黄醇（ROH）15,16,17,18,19，随后在细胞内逐步将ROH转化为具有转录活性的类维生素A分子——全反式视黄酸（ATRA）20。ATRA介导的（或类维生素A介导的）信号传导通过ATRA与其三种特异性核激素受体——视黄酸受体（RARα、RARβ和RARγ21,22）——相互作用而实现，在调控肺泡化23,24,25,26,27,28,29、表面活性物质生成30,31,32,33,34,35、血管生成36、通透性37以及免疫反应38,39,40等方面发挥关键作用。尤为重要的是，某些特定肺细胞（尤其是肺成纤维细胞）能够以视黄酯（RE）的形式储存类维生素A，这些储存的RE可在需要时被动员转化为ROH，并转移至邻近细胞1。
视黄醇代谢与信号传导的复杂性以及肺部细胞的复杂性，使得旨在探索肺中视黄醇代谢的研究具有挑战性 体内 具有挑战性。我们已制定了一种简单且可靠的方案，用于分离含视黄醇类物质的细胞（图1利用特定的类维生素A自体荧光（在350 nm激发下于455 nm发射）并结合荧光激活细胞分选（FACS），可从高度异质性的肺细胞群体中分离出储存类维生素A的细胞。该方案无需额外的细胞标记，仅在研究目标为基于类维生素A储存能力分离和表征原代活肺细胞时，需进行活细胞染色。这显著缩短了细胞分选前的制备时间，避免了额外染色步骤，并可获得高产量的活原代细胞。然而，若研究目标为分离和表征特定的肺细胞亚群（如成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞或免疫细胞），可在使用细胞特异性抗体标记已分选的含类维生素A细胞后，进一步进行额外的细胞分选。
视黄醇自体荧光已在已发表的研究中用于确定含视黄醇细胞的身份和/或定量肝脏中这些细胞的丰度41,42,43,44，胰腺45,46肾脏41,47和肺41此外，多个研究团队报道了利用类视黄醇荧光通过FACS分离并研究来自活体组织（包括肝脏）的原代含类视黄醇细胞。44,48,49,50,51,52,53 和肺1在本实验方案中，我们展示了如何对特定细胞群体进行标记 体内 在使用tdTomato（红色荧光蛋白）分离含视黄醇的细胞之前。tdTomato的光谱特性（在554 nm激发时，发射波长为581 nm）54）和亮度不会干扰类视黄醇的自发荧光，因此在分选过程中便于实现细胞特异性。鉴于类视黄醇代谢及其信号传导在正常肺泡微环境中具有关键作用1, 所述的肺细胞分离技术是在肺部健康与疾病动物模型研究中一种有用的工具，可用于深入理解肺内视黄醇代谢的细胞机制及脂质介导的细胞间通讯 体内.

<table><tbody><tr><td>10 mL 血清移液管</td><td>Avantor/VWR</td><td>76452-284</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;m 细胞筛&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;micro;m 细胞筛&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 离心管</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养皿，35 mm &amp;acute; 10 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>细胞分选培养基</td><td>Gibco</td><td>A59688DJ</td><td></td></tr><tr><td>IV 型胶原酶&amp;nbsp;</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS004188&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cytek Aurora 细胞分选系统&amp;nbsp;</td><td>Cytek Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 品牌 5 mL 聚丙烯圆底管，12 mm &amp;acute; 75 mm</td><td>Corning</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 品牌 5 mL 聚苯乙烯圆底管，带细胞筛帽，12 mm &amp;acute; 75 mm</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 软件&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>流式细胞术软件</td></tr><tr><td>含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 HBSS</td><td>Gibco</td><td>14925-092</td><td></td></tr><tr><td>不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 的 HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 一次性无菌瓶顶过滤器</td><td>ThermoFisher</td><td>595-3320</td><td></td></tr><tr><td>红细胞裂解缓冲液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>SpectroFlo CS 软件&amp;nbsp;</td><td>Cytek Biosciences</td><td>Version 1.3.0&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Design Royaltek 不锈钢手术刀片</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-683</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX Green 死细胞染料</td><td>Invitrogen</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>他莫昔芬</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2859</td><td></td></tr></tbody></table>

通过细胞分选分离肺部含视黄醇细胞

Isolation of Lung Retinoid-Containing Cells by Cell Sorting

类视黄醇（维生素A及其代谢物）是肺泡微环境中的重要脂质成分，特定细胞类型的类视黄醇代谢对于维持发育中及成年肺脏的功能健康至关重要。肺部细胞利用特定通路，高效摄取血液中以视黄醇（ROH）形式循环的类视黄醇，并在细胞内逐步将其转化为具有转录活性的类视黄醇分子——全反式维甲酸（all-转-视黄酸（ATRA）。ATRA介导的（或类视黄醇介导的）信号通路对于调控肺泡化、表面活性物质生成、血管生成、通透性及免疫功能至关重要。重要的是，某些特定肺细胞（包括成纤维细胞）能够以视黄酯（RE）的形式积累类视黄醇，并将其储存，或在需要时进一步转化为视黄醇（ROH），转移至邻近细胞。含有类视黄醇的肺细胞可通过消化肺组织获得的单细胞悬液，利用类视黄醇的自发荧光（在350 nm激发下于455 nm发射）结合荧光激活细胞分选（FACS）进行分离与收集。此外，基于细胞特异性 体内 用红色荧光蛋白标记肺细胞，可实现对特定含视黄醇的肺细胞群体进行分离和收集。所获得的细胞可直接用于分析，或进行培养以进一步研究细胞形态、基因表达以及对药物干预的响应。该分离与应用技术对于肺部健康和肺损伤动物模型研究具有重要意义，有助于深入理解肺组织中视黄醇代谢的细胞机制以及脂质介导的细胞间通讯。

肺部含视黄醇细胞的分离 
小鼠肺组织（来自 Lrat+/+ 和 Lrat-/-) 小鼠组织经酶消化处理，制备单细胞悬液，并按照上述方案进行流式细胞术分析。细胞分选和数据采集使用配备 SpectroFlo CS 软件（版本 1.3.0）的 Cytek Aurora™ 细胞分选系统完成，采用 100 µm 喷嘴和15 psi压力。首先，通过前向散射（前向散射高度/FSC-H 对 前向散射面积/FSC-A）图进行单细胞（单细胞群体）的选取和设门，随后利用侧向散射和SYTOX Green染色区分死细胞（图2最后，为了分选含有视黄醇的目标细胞群体，选择了一群在 λ = 455 nm 处具有强自发荧光的活单细胞群体（图2A). 为验证所采用的设门策略及整体方法的特异性，使用肺组织单细胞悬液 Lrat-/-</...

以下方案通过利用特定的类维生素A自体荧光并结合荧光激活细胞分选技术，提供了一种从高度异质性的肺细胞群体中分离含类维生素A细胞的简单而有效的方法。

视黄醇类物质（维生素A及其代谢物）是肺泡微环境中的重要脂质成分，且细胞类型特异性的视黄醇代谢是……

我们的研究重点是了解维生素A及其代谢物（统称为类视黄醇）在维持成人肺部功能健康中的生理作用。由于肺部具有高度特化且异质性的细胞组成，研究视黄醇介导的肺部健康与疾病中的细胞间通讯，必须依赖单细胞技术，例如特定细胞标记、分选和测序。我们的研究揭示了成年肺脏中类视黄醇代谢与信号传导此前未被认知的复杂性，及其在肺损伤过程中发挥保护作用的关键角色。本方案能够基于内源性类视黄醇的自发荧光实现特定肺细胞群体的分离，并可轻松与荧光染料标记的抗体染色结合，适用于所有荧光蛋白的表达分析。我们的研究范式改变了人们对维生素A代谢机制及其作用的理解。这些研究的结果将影响当前的策略，包括旨在缓解肺部疾病的营养干预措施。[Presenter] 首先，对麻醉小鼠进行脚趾夹捏测试，以检查其无意识程度。清除手术部位的松散毛发和可见污物。然后，用70%酒精擦拭该区域以进行消毒。使用无菌外科器械打开腹腔和胸腔。剪开肋骨和膈肌以暴露肺和心脏。随后剪断下腔静脉。使用吸水垫吸收流出的血液。通过心脏右心室原位灌注5毫升无钙和镁的无菌HBSS溶液至肺部。通过观察肺组织变白来确认灌注成功。再使用另一支装有含酶、钙和镁的无菌HBSS溶液的10毫升注射器对肺部进行第二次灌注。现在取出肺组织，并将其转移至含有2毫升含钙和镁的无菌HBSS溶液的细胞培养皿中。在超净工作台内，用无菌手术刀片冲洗肺组织并将其切碎成小块。向切碎的肺组织中加入5毫升含钙和镁的酶解HBSS溶液。然后，使用10毫升血清移液管将悬液转移至15毫升离心管中。用额外的5毫升含酶HBSS溶液冲洗细胞培养皿，并将洗涤液转移至15毫升离心管中。将切碎的肺组织在含酶的HBSS溶液中于37摄氏度旋转摇床上孵育45分钟。每隔15分钟，在超净工作台内用10毫升血清移液管将组织悬液吹打10次，以促进组织解离。重复此操作三次。将所得细胞悬液通过100微米细胞筛滤入含有20毫升冷的活细胞成像溶液（含少于5% FBS）的50毫升离心管中。在4摄氏度下以500 × g离心10分钟。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于1毫升红细胞裂解缓冲液中并进行孵育。当红细胞完全裂解后，向悬液中加入20毫升冷的活细胞成像溶液，再次离心。吸除上清液后，将细胞沉淀重悬于20毫升冷的活细胞成像溶液中。将所得细胞悬液通过40微米细胞筛滤入另一含有20毫升冷的活细胞成像溶液的50毫升离心管中。按前述条件离心收集细胞。最后，吸除上清液，将细胞沉淀重悬于10毫升冷的活细胞成像溶液中。使用血细胞计数板在显微镜下计数细胞，并将浓度调整至约每毫升500万至1000万个细胞。取一部分制备好的细胞悬液作为未染色的设门对照并保留。向剩余细胞悬液中加入终浓度为30纳摩尔的活性染料Cytoscreen（稀释比例为1:1000）。接下来，将滤器安装至聚苯乙烯5毫升收集管上。将细胞悬液通过滤器过滤。利用荧光激活细胞分选技术，根据细胞在455纳米处的发射光信号分离出活的单个含视黄醇类物质的细胞。通过前向散射高度与前向散射面积图进行连续的单细胞判别。根据散射特征及Cytoscreen染色排除死细胞。基于350纳米激发光下455纳米发射光信号，设门、分选并收集单个活的含视黄醇类物质的细胞。最后，使用流式细胞术分析软件进行FACS数据分析。在野生型小鼠肺细胞悬液中检测到一群具有高自发荧光（455纳米）的活单细胞亚群。而在Lrat基因敲除小鼠的肺细胞悬液中未见该自发荧光细胞群。利用Cre诱导型标记系统成功分离出tdTomato阳性成纤维细胞亚群，从而可进一步基于自发荧光特性从该细胞群中分离含视黄醇类物质的细胞。通过荧光显微镜观察到红色标记细胞，证实了tdTomato阳性肺成纤维细胞的存在。通过HPLC验证了分选后成纤维细胞中视黄醇类物质的存在，鉴定出视黄醇和视黄醇酯。在含视黄醇类物质的成纤维细胞中检测到脂滴。

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科研

JoVE Journal

Biology

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