Name: 从 Wolbachia 感染的 黑腹果蝇 JW18 细胞系生成单克隆培养物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 了解从Wolbachia感染的黑腹果蝇JW18细胞系生成单克隆培养物的方法。该方案成本低、操作简便，可减少细胞应激并提高实验可重复性，适用于研究共生菌表型及宿主基因组进化。

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我们感谢美国加利福尼亚大学圣克鲁兹分校的 William Sullivan、美国佛罗里达国际大学的 Laura Serbus 以及葡萄牙里斯本天主教大学的 Luis Teixeira 提供 JW18 细胞系以及关于如何使用该细胞系的宝贵建议。我们感谢波兰克拉科夫雅盖隆大学的 Nidhi Krishna Shrivastava 对实验方案提出的有益建议。我们感谢波兰克拉科夫雅盖隆大学的 Yuliya Chykunova 对稿件进行校对。
图1 使用 BioRender 创建（Chrostek, E. (2024) https://BioRender.com/o69b306）。
本工作由授予 EC 的欧洲研究理事会（ERC）启动资助（资助协议编号：101040311）以及授予 NF 的精确与自然科学博士学校（雅盖隆大学）博士奖学金资助。然而，文中表达的观点和意见仅为作者自身观点，不一定反映欧盟或欧洲研究理事会执行机构的观点和意见。欧盟或资助机构均不对这些观点承担任何责任。

注意：所有涉及活细胞及其培养基的操作必须在生物安全柜中进行，以避免污染。
1. 培养基制备
<ol>
	<li>通过在Shield和Sang昆虫培养基中添加10%胎牛血清（FBS），配制新鲜的培养基。</li>
	<li>使用过的和条件培养基
	<ol>
		<li>在含有添加10% FBS的新鲜Shield和Sang昆虫培养基的25 cm2培养瓶中培养JW18细胞，于25 °C孵育，直至细胞达到汇合状态（约1周）。</li>
		<li>对培养细胞所用的1周龄使用过的细胞培养基进行过滤，以去除Wolbachia、细胞碎片及其他污染物：使用5 µm无菌滤膜，再用安装在50 mL注射器上的0.2 µm无菌滤膜过滤。</li>
		<li>通过在新鲜培养基中加入20%使用过的培养基来制备条件培养基。为一个96孔板准备足够的条件培养基（约30 mL）；用移液管将6 mL过滤后的使用过的培养基与24 mL添加10% FBS的新鲜Shield和Sang昆虫培养基混合。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 96孔板的准备
<ol>
	<li>制备 JW18 细胞悬液
	<ol>
		<li>使用细胞刮从融合生长、培养一周的培养瓶中刮取细胞，并用血清移液管重悬细胞。</li>
		<li>使用血球计数板对细胞进行计数，并用条件培养基稀释，使最终浓度达到 2 ×&#160;103 个细胞/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向培养板中加入条件培养基
	<ol>
		<li>将制备好的条件培养基转移至试剂储液槽中。</li>
		<li>使用多通道移液器，除 A1 孔外，向 96 孔板的每个孔中加入 100 µL 条件培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞悬液的梯度稀释
	<ol>
		<li>向 A1 孔中加入 200 µL 细胞悬液。</li>
		<li>使用单通道移液器，从 A1 孔转移 100 µL 至 B1 孔，并轻轻混匀（避免产生气泡），如 图 1A 所示。</li>
		<li>沿第 1 列依次进行梯度稀释，从最后一孔弃去最终的 100 µL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在培养板上进行横向稀释
	<ol>
		<li>向第一列的每个孔中加入 100 µL 条件培养基，使总体积达到 200 µL。轻轻混匀。</li>
		<li>使用多通道移液器，从第一列向第二列转移 100 µL。轻轻混匀。</li>
		<li>按此操作依次完成所有列（1–12）的转移（见 图 1A）。</li>
		<li>重悬后，从最后一列弃去 100 µL。此时，每个孔中含有 100 µL 细胞悬液。</li>
		<li>向所有孔中额外加入 100 µL 培养基，使每孔的最终体积为 200 µL。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 单细胞鉴定
<ol>
	<li>用封板膜覆盖培养板，用Parafilm密封，并做好适当标记。</li>
	<li>在显微镜下观察培养板，仔细检查每个孔中是否存在单个细胞（图1B）。务必全面扫描各孔及其边缘，确认每个孔中仅含有一个细胞。 
	注意：这是本实验方案中最关键的步骤之一。</li>
	<li>将含有单个细胞的孔位编号记录在一张96孔板图谱（纸质）上。 
	注意：单个细胞更可能出现在培养板右侧和底部的孔中。</li>
	<li>确定并标记单细胞孔后，将培养板置于25 °C培养箱中保存。每隔2天观察一次细胞生长情况。</li>
</ol>
4. 细胞的传代与维持
<ol>
	<li>细胞监测 
	注意：JW18 细胞通常需要 3 天时间才能从单个细胞开始分裂，且克隆群体的生长速度可能不同（图 2）。
	<ol>
		<li>每 2–3 天观察一次孔板，检查是否存在细菌污染，并确保培养基未干涸。若发现孔板有干涸迹象，应根据需要补充新鲜培养基。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞扩增
	<ol>
		<li>当细胞在 96 孔板中达到汇合状态时，将其转移至 24 孔板（图 1D）。</li>
		<li>随后将细胞转移至 6 孔板，最终转移至培养瓶（图 1E、F）。 
		注意：这种逐步扩增的方式可提高建立连续克隆细胞系的可能性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞冻存
	<ol>
		<li>一旦克隆培养物建立，应冻存部分细胞以备将来使用。
		<ol>
			<li>使用细胞刮刀从培养瓶中刮下细胞，并转移至 15&#8239;mL 离心管中。在 4 °C 条件下，以 250 ×&#160;g 离心 5 分钟。</li>
			<li>配制 2 倍冻存液（Shield 和 Sang 昆虫培养基，添加 20% 胎牛血清和 10% 二甲基亚砜）。</li>
			<li>离心后弃去部分上清液，保留最终所需体积的一半。向剩余上清液中加入等体积的 2 倍冻存液，用移液器轻轻重悬沉淀。</li>
			<li>将 1&#8239;mL 悬液分装至每个 1.5&#8239;mL 冻存管中，置于冰上。将冻存管于 −80 °C 保存过夜，次日转移至液氮罐中进行长期保存。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. PCR 鉴定 Wolbachia 感染状态
<ol>
	<li>采用苯酚-氯仿法从单克隆培养样品中提取DNA39。
	<ol>
		<li>取1 mL汇合度较高的刮取并重悬于培养基中的细胞，加入1.5 mL微量离心管中，在4 °C条件下以290 ×&#160;g离心5 min。弃去上清液（细胞培养基），将离心管置于冰上。</li>
		<li>加入250 µL溶液A（含0.1 M Tris HCl（pH 9.0）、0.1 M EDTA和1% SDS）。重悬细胞后，在加热块中70 °C孵育30 min。</li>
		<li>孵育结束后，加入35 µL 8 M乙酸钾，轻轻振荡混匀（避免涡旋），再于冰上孵育30 min。</li>
		<li>在4 °C下以13,000 rpm离心15 min，将上清液转移至新离心管中，加入等体积的苯酚-氯仿溶液。充分振荡后再次离心，重复此步骤一次。</li>
		<li>将上清液转移至新的离心管中，加入150 µL异丙醇，振荡混匀后以10,000 rpm离心5 min。小心弃去上清液，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，再以13,000 rpm离心。</li>
		<li>将沉淀在室温下干燥10 min后，用100 µL TE缓冲液重悬。定量DNA后于-20 °C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用DreamTaq Green PCR预混液对从单克隆培养样品中提取的DNA进行常规PCR扩增，以检测Wolbachia。&#160;采用wsp 81F和wsp 691R&#160;引物40扩增Wolbachia，同时使用Drosophila rpl32引物41进行DNA质量控制。
	<ol>
		<li>在反应体系中加入7.5 µL预混液、各0.5 µL浓度为10 µM的引物、1 µL稀释50倍的DNA模板以及5.5 µL分子生物学级水，总体积为15 µL。</li>
		<li>采用以下PCR程序：94 °C预变性4 min，30个循环×&#160;（94 °C变性40 sec，55 °C退火40 sec，72 °C延伸30 sec），最后72 °C延伸10 min。PCR结束后，将样品保存于4 °C。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将获得的PCR产物在含TAE缓冲液的2%琼脂糖凝胶中以90 V进行琼脂糖凝胶电泳，以观察条带。同时加入DNA分子量标记物，用于识别wsp（632 bp）和rpl32（194 bp）的扩增条带。</li>
</ol>
6. 荧光原位杂交染色以观察细胞系中的Wolbachia感染
<ol>
	<li>进行荧光检测 原位 杂交（FISH），按照Stellaris FISH贴壁细胞染色实验方案进行 Wolbachia 使用 Quasar 670 标记的 16S rRNA FISH 探针组进行染色。用 Hoechst 33342 染色核酸。 
	注意：该探针组的设计基于 wMel 16S rDNA 序列与 Schneider 等人发表的探针组相匹配。42 （参见 补充表 S1).
	<ol>
		<li>按照制造商说明书配制试剂（固定缓冲液、杂交缓冲液、洗涤缓冲液A和B、重悬的定制探针组）43.</li>
		<li>在经70%乙醇灭菌的18&#8239;将直径为毫米的圆形盖玻片置于24孔培养板中。待细胞达到所需汇合度后，吸除生长培养基，并用1毫升预温PBS洗涤细胞&#8239;毫升 1× PBS。加入 1&#8239;mL固定缓冲液，室温孵育10分钟。用1 mL洗涤液洗涤细胞两次&#8239;毫升 1× PBS</li>
		<li>通过将带有细胞的盖玻片浸入 1 中进行透化处理&#8239;70% 乙醇中，4 °C 过夜孵育；杂交前可在该温度下于乙醇中保存最多1周。吸除乙醇，加入1 mL&#8239;1 mL 洗涤缓冲液 A；室温孵育 2–5 分钟。</li>
		<li>通过在150 mm培养皿中放置浸透水的纸巾和一层Parafilm，制备一个加湿培养环境&#8239;将100 µL杂交缓冲液（含1 µL 12.5 µM探针原液）移液至Parafilm上。轻柔翻转盖玻片，使细胞面朝下覆盖于杂交缓冲液液滴上。用Parafilm封严反应腔室，避光条件下37 °C孵育至少4 h（必要时可延长至16 h）。</li>
		<li>杂交后，小心地将盖玻片细胞面朝上转移至含有1的新鲜孔中&#8239;加入1 mL洗涤缓冲液A，37 °C孵育30分钟。吸去缓冲液，将0.5 µL 20 mM Hoechst储存液加入700 µL洗涤缓冲液A中，避光条件下37 °C孵育30分钟。</li>
		<li>移除 Hoechst 溶液，加入 1&#8239;加入1 mL洗涤缓冲液B；室温孵育2-5分钟。最后，在载玻片上滴加少量封片剂（10 µL），将盖玻片细胞面朝下覆于液滴上。用滤纸轻轻吸去多余的封片剂，并用透明指甲油密封盖玻片边缘。</li>
		<li>将载玻片置于4 °C保存，并尽快进行成像。</li>
		<li>使用 ImageJ 处理图像44根据需要拆分通道并更改颜色调色板。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

本文概述了一种从 JW18 D.melanogaster 细胞系中生成单细胞克隆的标准化方法，该方法也可应用于其他 Drosophila 及昆虫细胞系。本实验方案通过将制备好的细胞悬液在96孔板中进行连续稀释，以分离单个细胞。随后在最佳条件下培养这些细胞，以建立持续增殖的细胞系。本方案还包括添加20%的条件培养基，以促进细胞存活及单细胞分裂45,46。
在方案中，一个关键步骤是在连续稀释后验证每个孔中是否存在单个细胞。此步骤需要格外仔细，因为这对于整个方案的成功至关重要。为了便于后续确认细胞的单细胞来源，建议从多个角度拍摄所选孔的图像。
另一个关键步骤是在培养皿之间转移细胞。为了成功建立连续培养，只有当细胞达到汇合状态时才能进行转移。如果细胞生长停滞超过两周，更换培养基可促进进一步生长。在细胞达到汇合之前过早转移可能导致细胞死亡。
尽管该方案比其他常用方法（如荧光激活细胞分选，FACS）38,46 更耗时且劳动强度更大，但它具有多项优势，包括成本效益高、对细胞损伤风险极小、无需使用荧光标记物、昂贵仪器以及优化时间。总体而言，该方案非常适合从连续细胞系中获得均一的昆虫细胞群体。
单克隆培养物的特性
我们的结果表明，单克隆培养物在建立速度方面存在差异 Wolbachia 感染状态（图2, 图4，以及 图5). Wolbachia无载体克隆JW18-C7在我们的单细胞分离实验方案中是最快达到汇合的。 Wolbachia 可能是一直未存在于该细胞系中，也可能是由于无法跟上宿主细胞的分裂速度而丢失。此外，也可能由于我们克隆方案中初始细胞密度较低而导致其丢失。然而，由于其他克隆细胞系并未出现这种情况，我们认为这种可能性较小。对JW18-C7进行实验性感染时 Wolbachia （与其他经四环素处理的克隆并列）可回答该细胞系是否对共生菌具有易感性。
细胞异质性并非JW18细胞系所独有，此前已有报道指出其他感染Wolbachia的细胞系也存在类似现象32,47,48,49,50,51,52。此前曾有研究尝试通过将Wolbachia从D. simulans卵或Aa23细胞转移至C7-10型A. albopictus细胞系来改善这一问题53。然而，C7-10细胞系在Wolbachia转移发生多年之前就已经被克隆54,55，且这些转移操作并不构成我们拟研究的自然感染状态。
Wolbachia 感染状态以及单克隆培养建立时间（反映细胞分裂速率的差异）在不同 JW18 克隆个体间的差异，可能对以往将 Wolbachia 滴度与昆虫细胞生长速率关联起来的研究产生深远影响。处理后观察到的细胞数量变化、共生体密度改变或基因表达变化，可能是由于筛选出具有特定特性的细胞类型所致，而非混合细胞群体中所有细胞状态的普遍改变。因此，在关键特征存在变异的情况下，对混合细胞群体施加处理可能导致结果出现偏差且不可重复。

Drosophila melanogaster 细胞被广泛用于遗传学研究、疾病研究以及作为高通量药物筛选的平台1。它们也有助于研究地球上最普遍的胞内微生物之一：Wolbachia。Wolbachia 是一种革兰氏阴性专性胞内细菌，存在于 40–70% 的昆虫物种中2,3,4，可通过母系遗传并在宿主体内诱导生殖调控5,6,7,8。Wolbachia 还可为感染宿主提供抗病毒保护作用9,10,11,12,13,14,15，这些特性与生殖调控机制共同被用于控制蚊媒向人类传播节肢动物病毒16,17。在多种生物系统中，Wolbachia 已被证明能够调控细胞凋亡18、提供必需营养物质19，并改变基因和蛋白质的表达水平20,21,22,23,24,25。
细胞系因其简单的生物学特性、操作便利以及能够大量扩增，已成为研究Wolbachia的模型系统。细胞系已被证明在使Wolbachia预先适应与新宿主建立共生关系26&#160;以及促进Wolbachia积累突变27,28方面具有重要作用。它们还被用于筛选抗Wolbachia化合物，这些化合物在治疗丝虫病方面具有潜在应用价值29&#160;，并可用于研究Wolbachia与宿主之间的翻译相互作用30。尽管细胞系在Wolbachia共生研究中不可或缺29,30,31，但大多数Wolbachia表型背后的分子机制仍不清楚。这表明细胞培养模型系统仍有改进空间。
Wolbachia-感染的昆虫细胞系源自昆虫胚胎和幼虫。Aa23 来源于 白纹伊蚊 胚胎，是首个稳定的 Wolbachia感染细胞系32，随后被用于多项相关研究 Wolbachia 共生33,34,35JW18细胞系是最早被发现的天然 Wolbachia-由感染株系生成的 D. melanogaster29,36该品系源自1小时至15小时的胚胎， w感染了 Mel 的果蝇也已被用作来源 Wolbachia 用于其他 果蝇 细胞系：1182-4H 和 S2R+37由于胚胎含有较高比例的多能细胞，这些细胞在适应塑料表面生长的过程中可能获得新的特性，且不同细胞谱系间有时表现出差异。这或许可以解释细胞形态的异质性 Wolbachia 在任何特定时间点及多代过程中观察到的这些细胞的感染频率29.
JW18 细胞系中的细胞多样性引发关注，因为对蚊子细胞系（如 Aag2）的研究表明，由于细胞特性存在差异，单克隆细胞系与其亲本细胞系对处理的反应可能不同38。因此，对混合细胞群体施加处理可能导致结果产生误导。为了研究均一细胞群体对处理的反应（而非针对特定细胞类型的筛选），&#160;我们从亲本 JW18 细胞系中建立了单克隆细胞系。此前尚无从这些细胞中建立单克隆细胞系的尝试。该方案包括从亲本 JW18 细胞系中分离单个细胞，随后进行培养并转移至培养瓶，以建立可连续传代的克隆细胞系。我们检测了各单克隆细胞系的 Wolbachia 感染状态，结果显示它们在这一关键特征上存在差异。均一的细胞培养体系对于确保未来实验的准确性与可重复性至关重要。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m 注射器滤器&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>TPP</td><td>99722</td><td>无菌</td></tr><tr><td>10倍磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>70011044</td><td>无菌</td></tr><tr><td>12 或 18 mm 圆形盖玻片&amp;nbsp;</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon 管</td><td>Genoplast</td><td>601052</td><td>无菌</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7524</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>5 &amp;micro;m 注射器滤膜</td><td>Whatman</td><td>10462000</td><td>无菌</td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7506</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>CytoOne</td><td>CC7682-7596</td><td>组织培养处理</td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>J66501.30</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养瓶，25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3103</td><td>无菌</td></tr><tr><td>细胞刮刀&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>391-3010</td><td>无菌</td></tr><tr><td>透明指甲油&amp;nbsp;</td><td>任意品牌</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPure 冻存管</td><td>Sarstedt</td><td>72.379</td><td>无菌</td></tr><tr><td>DMSO，细胞培养级</td><td>Merck</td><td>D2650-100ML</td><td>无菌</td></tr><tr><td>DreamTaq PCR 主混合液</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>324503-100GM</td><td>无菌</td></tr><tr><td>电泳电源</td><td>Merck</td><td>PS 251-2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;nbsp;Concentrator Plus</td><td>Merck</td><td>EP5305000509</td><td>可使用任意品牌的真空浓缩仪替代。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Merck</td><td>1009861000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M5000 成像系统</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AMF5000</td><td>可使用任意品牌的倒置显微镜监测克隆生长情况。观察FISH需使用荧光显微镜。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Merck</td><td>F9665</td><td>热灭活</td></tr><tr><td>甲醛&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>047377.9L</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>F7503-100ML</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳槽</td><td>Cleaver Scientific</td><td>MSMIDI</td><td></td></tr><tr><td>凝胶成像仪</td><td>BioRad</td><td>12009077</td><td>GelDoc Go 凝胶成像系统</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA 标准品</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>加热金属块</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88870005</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe 2025 II 级生物安全柜</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51033314</td><td>只要能维持内部无菌环境，可使用任意品牌的生物安全柜。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液（20 mM）5 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62249</td><td>避光保存。</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Merck</td><td>258148-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&amp;nbsp;PIPETBOY acu 2 移液辅助器</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0085686</td><td>可使用任意品牌的移液控制器。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>异丙醇</td><td>Merck</td><td>I9516-1L</td><td></td></tr><tr><td>实验室冰箱</td><td>&amp;nbsp;Liebherr&amp;nbsp;</td><td>LGUex 1500 MediLine</td><td>任何能够维持恒定温度的冰箱均可使用。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>液氮罐</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>CY50985</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Merck</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>分子级水</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Eppendorf</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Peqlab</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer 血细胞计数板</td><td>Merck</td><td>BR717810-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&amp;nbsp;M 封口膜</td><td>Merck</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>帕尔贴控温培养箱</td><td>Memmert</td><td>IPP55plus</td><td>任何能够维持恒定 25?C 的培养箱均可使用。JW18 细胞系或其克隆无需 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 控制。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>苯酚/氯仿/异戊醇（25:24:1）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>327115000</td><td></td></tr><tr><td>移液器套装</td><td>Eppendorf</td><td>EP2231300008</td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Merck</td><td>P1190-500G</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Quasar&amp;nbsp;670 标记的 16S rRNA FISH 探针组&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td></td><td>定制合成，探针序列见表1。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>制冷微量离心机</td><td>Labnet</td><td>C2500-R</td><td></td></tr><tr><td>rpl32 正向引物 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'</td><td>Eurofins genomics</td><td></td><td>根据文中引用的参考文献定制合成</td></tr><tr><td>rpl32 反向引物 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'</td><td>Eurofins genomics</td><td></td><td>根据文中引用的参考文献定制合成</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9823</td><td>无菌</td></tr><tr><td>血清移液管</td><td>Corning</td><td>357771</td><td></td></tr><tr><td>Shields 和 Sang M3 昆虫培养基</td><td>Merck</td><td>S8398</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH 杂交缓冲液&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>SMF-HB1-10</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH 洗涤缓冲液 A&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>SMF-WA1-60</td><td>无菌</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH 洗涤缓冲液 B&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Biosearch Technologies</td><td>SMF-WB1-20</td><td>无菌</td></tr><tr><td>无菌试剂储液槽&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8094</td><td>无菌</td></tr><tr><td>TAE 缓冲液</td><td>Merck</td><td>1061741000</td><td>1x&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TE 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>93283</td><td>无菌</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>Syngen Biotech</td><td>Thermoblock 96</td><td>可使用任意品牌的 PCR 仪替代。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td>无菌</td></tr><tr><td>超低温冰箱</td><td>PHC corporation&amp;nbsp;</td><td>MDF-DU502VH-PE</td><td>任何可维持 -80 ?C 的实验室冰箱均可使用。</td></tr><tr><td>Vectashield 封片剂&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>wsp 正向引物 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'</td><td>Eurofins genomics</td><td></td><td>根据文中引用的参考文献定制合成</td></tr><tr><td>wsp 反向引物 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'</td><td>Eurofins genomics</td><td></td><td>根据文中引用的参考文献定制合成</td></tr></tbody></table>

从单克隆培养物的生成 wolbachia-感染的 黑腹果蝇 jw18 细胞系

Generation of Monoclonal Cultures from Wolbachia-infected Drosophila melanogaster JW18 Cell Line

细胞系是生物学研究中广泛使用的模型，尤其适用于那些在宿主生物体外难以有效增殖的胞内细菌的研究。Wolbachia 是多种无脊椎动物的胞内共生菌，可在其昆虫宿主中诱导强烈的生殖调控和抗病毒效应。感染 Wolbachia 的昆虫细胞已被广泛用于研究 Wolbachia 的表型特征。然而，这些细胞系通常由混合细胞群体组成，其表型及对实验处理的反应可能存在差异。特别是，已有报道指出，携带 Wolbachia 的细胞系在连续传代过程中表现出不稳定的生长速率和波动的 Wolbachia 感染率。为解决这一问题，我们从源自黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）且感染 Wolbachia 的 JW18 细胞系中建立了单克隆细胞系。这些克隆系在不同时间点建立，表现出不同的 Wolbachia 感染状态。这种变异性提示，对亲代 JW18 群体施加的任何处理都可能导致特定亚群被选择性富集，而非均一地影响整个培养物的生理状态。本文中，我们提供了一种从感染 Wolbachia 的昆虫细胞中获得单细胞克隆并建立持续克隆培养物的实验方案，从而实现更精确、可重复的实验研究。

我们通过光学显微镜观察了从单细胞悬液制备和铺板（第0天）到建立稳定细胞系（第45天或第77天，图2）的单克隆培养建立过程。首次观察到细胞分裂是在第3天（即铺板后第4天，铺板操作在第0天进行），此时每个孔中已有四个细胞（图2）。第14天时，克隆以单层形式（JW18-B9、C7 和 E5）或球状结构（JW18-G4）生长，后者在传代过程中被破坏。第28天时，不同细胞系之间的生长差异最为明显。JW18-C7 培养物在第45天达到汇合，而其余单克隆培养物直到第77天才建立成功。我们还对建立后经过30次传代的四个不同培养物进行了观察，以记录其细胞形态上的差异（图3）。
为了确定单克隆培养物中Wolbachia的感染状态，我们进行了PCR（图4）和FISH（图5）。观察结果显示，除一个克隆（JW18-C7）外，其余克隆均扩增出wsp基因条带，表明存在Wolbachia感染。FISH结果进一步验证了PCR结果：克隆JW18-B9、JW18-E5和JW18-G4保留了Wolbachia感染，而克隆JW18-C7未检测到Wolbachia。总体而言，从混合的JW18细胞群体中，我们成功建立了四个克隆系，其中三个保留了原始的Wolbachia感染。原始数据可通过Figshare获取：https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9。
<img alt="连续稀释法示意图，包含细胞悬液及稀释步骤，是科研实验中的关键方法。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1：单克隆细胞系建立的工作流程。（A）在96孔板中进行的一级和二级稀释。（B）连续稀释后获得的单个细胞。（C-E）细胞增殖过程及从96孔板依次转移至24孔板和6孔板。（F）在25 cm2 细胞培养瓶中建立的持续培养细胞系。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="细胞随时间的生长情况；显微镜图像；细胞增殖；JW18细胞系；0至77天；比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：JW18克隆细胞系从单个细胞到多细胞培养的发育过程。 克隆细胞系从第0天（铺板日）至第77天的明场图像，此时所有细胞系均已在25 cm2细胞培养瓶中成功建立。比例尺 = 25 µm（第0天）、50 µm（第3天）、150 µm（第14天）、300 µm（第28、45、77天）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞形态比较，显微镜图像，50µm比例尺，四个样本标记为JW18 B9/E5/C7/G4。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：JW18单克隆细胞系的形态学特征。 显示各单克隆细胞系在建系后第30代的细胞形态的明场图像。比例尺 = 50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="凝胶电泳结果；Wolbachia wsp 和果蝇 rpl32 条带；DNA 分离分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图 4：通过 PCR 检测克隆培养物的Wolbachia状态。 对 JW18 亲本细胞系及克隆株 JW18-B9、JW18-C7、JW18-E5 和 JW18-G4 在建系后第 11 代进行Wolbachia 的 PCR 检测。Wolbachia wsp 条带表明Wolbachia的存在，而Drosophila rpl32 条带用于 DNA 质量控制 PCR。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="DNA 和 16s 探针荧光显微镜图像，Wolbachia 检测，合并图像，25µm 比例尺。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 5"> 
图 5: Wolbachia克隆培养物的 FISH 检测状态。JW18 亲本细胞系及克隆 JW18-B9、JW18-C7、JW18-E5、JW18-G4 在建系后第 13 代通过 FISH 染色观察。Wolbachia 使用 Quasar 670 标记的 16s rRNA Stellaris FISH 探针组染成紫红色，核酸使用 Hoechst 33342 染成青色。比例尺 = 25 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充表 S1：针对 Wolbachia wMel 16S rDNA 设计的寡核苷酸探针及其与 Schneider 等人发表的探针的比较42。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/Table%20S1.%20Stellaris%20probe%20set%20_16052025.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

细胞系在研究无法在宿主细胞外培养的胞内寄生生物时具有重要应用价值。尽管 Wolbachia感染的细胞系已促成许多重要发现，但这些细胞系内部的异质性可能导致实验结果的不一致。本文介绍一种从单细胞克隆建立连续培养物的实验方案 Wolbachia感染的JW18细胞。

从单克隆培养物的生成 Wolbachia-感染的 黑腹果蝇 JW18 细胞系

细胞系是生物学研究中广泛使用的模型，尤其适用于那些无法高效培养的胞内细菌的研究。

我们的目标是建立单克隆JW18细胞系，以在同质细胞群体中研究沃尔巴克氏体（Wolbachia）的表型。这些细胞系应具有稳定的特性，相比混合细胞群体可显著降低实验变异性。本方案成本相对较低，无需使用专用设备，可最大限度减少细胞应激，并能够可重复地生成克隆昆虫细胞培养物。我们将能够追踪沃尔巴克氏体细菌在单克隆细胞培养中的进化过程，并估算果蝇基因组在细胞培养中的进化速率。[旁白] 首先，通过在Shield和Sang昆虫培养基中添加10%胎牛血清（FBS），配制新鲜培养基。使用25平方厘米的培养瓶，在25摄氏度条件下，将JW18细胞培养于含FBS的新鲜Shield和Sang昆虫培养基中。随后用细胞刮刀从培养瓶中刮下细胞，重悬于新鲜培养基中，将细胞接种至新的培养瓶并做好标记。将培养瓶孵育约一周，直至细胞达到汇合状态。接着，将培养瓶中的细胞培养基转移至50毫升离心管中。先用5微米无菌滤膜过滤一周使用过的旧培养基，再用装在50毫升注射器上的0.2微米无菌滤膜进行二次过滤，以去除沃尔巴克氏体（Wolbachia）、细胞碎片及其他污染物。然后，使用刻度移液管吸取6毫升过滤后的旧培养基和24毫升新鲜培养基，混合配制条件培养基。在制备JW18细胞悬液时，使用细胞刮刀从已汇合的一周龄培养瓶中刮取细胞，并用刻度移液管将其重悬。使用血球计数板（Neubauer计数室）对细胞进行计数。用条件培养基将细胞悬液稀释至终浓度为每毫升2,000个细胞。将条件培养基转移至试剂储液槽中，然后使用多通道移液器向96孔板的每个孔中加入100微升条件培养基，A-1孔除外。接着，向A-1孔中加入200微升细胞悬液。使用单通道移液器，从A-1孔转移100微升至B-1孔，并轻轻混匀，避免产生气泡。从最后一孔中弃去100微升液体。接下来，向第一列的每个孔中再加入100微升条件培养基，使每孔总体积达到200微升，并轻轻混匀。使用多通道移液器，将第一列各孔中的100微升液体转移至第二列，并轻轻混匀。在整块96孔板上，依次从第一列到第十二列重复进行梯度稀释操作。混匀后，从最后一列各孔中弃去100微升液体，使每孔最终体积为100微升。再向每孔加入100微升培养基，使每孔终体积达到200微升。盖上盖子，用封口膜密封，并正确标记。随后，在显微镜下观察96孔板，逐孔扫描每个孔及其边缘，确认是否存在单个细胞。将每个含有单细胞的孔编号记录在纸质的96孔板图谱上。在确认单细胞后，将96孔板置于设定为25摄氏度的培养箱中孵育。每隔两到三天检查各孔，观察是否有细菌污染，并确保培养基未干涸。必要时补充新鲜培养基。当细胞在96孔板中达到汇合状态后，将其转移至24孔板。随后依次转移至6孔板，最终转移至培养瓶中。在第3天可观察到细胞分裂的最初迹象，此时各孔中约含有4个细胞。到第14天，在JW18-G4克隆中观察到克隆性生长，表现为单层或球状结构。到第28天，各克隆之间的生长速率差异最为明显。JW18-C7克隆在第45天达到汇合，而其余克隆直到第77天才实现持续生长。到第30代传代时，四个已建立的克隆表现出不同的细胞形态。PCR分析显示，除JW18-C7外，所有克隆均检测到沃尔巴克氏体wsp基因，表明JW18-C7已丢失感染。FISH分析进一步证实，JW18-B9、JW18-E5和JW18-G4中存在沃尔巴克氏体，而JW18-C7中未检测到。

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科研

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Biology

生物学

从 Wolbachia 感染的 黑腹果蝇 JW18 细胞系生成单克隆培养物

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从单克隆培养物的生成 Wolbachia-感染的黑腹果蝇 JW18 细胞系

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从单克隆培养物的生成 Wolbachia-感染的 黑腹果蝇 JW18 细胞系

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