酵母表面显示蛋白的酶修饰和流式细胞术评估
2025年5月30日
在这里，我们介绍了一种使用酵母表面显示的底物进行酶促修饰测定的方案。使用酪氨酸磷酸酶 SHP-2 对其底物之一的去磷酸化活性分析作为代表性酶修饰测定法来证明该平台。
这项研究的重点是研究决定细胞行为方式的蛋白质的化学修饰。在这种情况下，目标是了解修饰各种底物的酶的偏好和动力学。
首次证明了对酵母表面显示的底物分子进行去磷酸化的能力。这一发现为以前无法获得的酶修饰的可推广动力学图谱开辟了可能性。这项研究解决了与理解酶底物相互作用相关的挑战。通常，此类评估需要细胞裂解物或定制肽。在这里，通过使用酵母展示的底物提供了一种FasL替代品。
该协议将传统的酵母表面展示推进到分析细胞外空间中通常的细胞内酶促反应，从而能够对这些通常难以评估的相互作用进行FasL分析。
该协议能够通过高通量方法询问各种酶的底物偏好，并通过简单的读数进行动力学研究。
[导师]首先，在冰上解冻准备好的酵母细胞的等分试样。将含有酵母展示构建体的 0.5 至 1.5 微克质粒 DNA 直接添加到细胞中。然后加入 0.5 毫升转化溶液或无菌 50% 聚乙二醇和 0.1 摩尔醋酸锂溶液。通过移液彻底混合细胞、质粒DNA和转化溶液的混合物。将转化混合物在30摄氏度下静态孵育30至60分钟，并以15分钟的间隔涡旋混合物。通过以 1000G 离心收获细胞。准备一个 14 毫升的培养管，里面装有 4.5 毫升含有质粒的酵母细胞生长或 SDCAA 培养基。将含有所需质粒的细胞重新悬浮在 500 微升 SDCAA 中，并接种制备的 4.5 毫升培养基。将 50 微升 5 毫升接种培养物小心地分配到 SDCAA 板上，不要刺穿螺旋钻。在30摄氏度下静态孵育48小时，以确定转化效率。现在，将 5 毫升 SDCAA 细胞培养物在 30 摄氏度和 300 RPM 的摇动培养箱中孵育至少 18 小时。16 小时后监测 600 纳米处的光密度，20 小时后再次重复。一旦样品达到不超过六的光密度，将培养物在2500G下离心三分钟，并在不干扰酵母沉淀的情况下弃去上清液。将酵母沉淀重新悬浮在蛋白质表达的诱导中，或SRGCAA培养基，使其最终光密度小于600纳米，小于1。将酵母培养物在30摄氏度和300 RPM的摇动培养箱中孵育至少8小时，但不超过24小时。然后测量 600 纳米处的光密度以确定细胞密度。通过在 1.7 毫升小瓶中用去离子水以一比二的比例稀释 2X 工作缓冲溶液，为样品制备工作缓冲液。将回收 200 万个酵母细胞所需的适当体积的酵母培养物添加到每个样品的 1.7 毫升小瓶中。将小瓶在4500G下离心一分钟，然后使用微量移液器小心地取出上清液并将其作为生物危害废物丢弃。在重复离心和去除上清液之前，将沉淀的细胞重新悬浮在一毫升PBSA中。把它放在一边。在 20 微升总反应体积中制备终浓度为 1,000 纳摩尔的重组人 SHP-2 溶液。接下来，将 7.7 毫克 DTT 添加到 15 毫升锥形管中的 10 毫升去离子水中，制成 5 毫摩尔的 DTT 溶液。现在，取出沉淀的细胞并将它们重新悬浮在工作缓冲液中，使最终反应体积为每个样品 20 微升。向每个样品中加入两微升 5 毫摩尔 DTT 溶液，最终 DTT 浓度为 0.5 毫摩尔。将制备体积的SHP-2添加到每个样品中，以达到20微升的最终体积，并使用微量移液器轻轻混合。用封口膜包裹样品瓶盖，以防止泄漏或交叉污染。将样品在 37 摄氏度下以恒定速度在转子上孵育两个小时。从转子中取出样品后，通过向每个样品中加入一毫升 PBSA 来停止反应，然后再次离心一分钟。然后弃去上清液。将沉淀的样品重新悬浮在相应初级试剂的 20 微升混合物中，并在室温下孵育 20 分钟。20分钟后，将样品在4500G下离心一分钟，并将上清液作为生物危害废物丢弃。在再次离心细胞之前，通过将它们重新悬浮在一毫升PBSA中来洗涤细胞一次。现在，将样品重新悬浮在相应二级试剂的 20 微升混合物中，并在黑暗中孵育 15 分钟。 离心样品并弃去上清液后，用PBSA再次洗涤细胞，然后再次离心。接下来，将洗涤后的样品重新悬浮在 300 至 500 微升 PBSA 中，并将它们转移到 5 毫升聚苯乙烯管中进行流式细胞术分析。准备好细胞仪后，单击“文件”，然后单击“新实验”按钮，命名实验并单击“保存”以确保获取的数据保存在所需的文件路径中。选择上方工具栏中的点图图标，为每个样本创建两个或多个点图。对于其中一个点图，请确保 x 轴名称显示 FSCA 通道，y 轴名称显示 SSCA 通道。对于另一个图，选择 x 轴名称以显示靶向一级抗表位标签抗体的二级试剂发出荧光的通道，选择 y 轴名称以显示链霉亲和素二级试剂发出荧光的通道。通过右键单击管，选择编辑名称并输入样品名称，为样品提供描述性名称。将每个样品管放入细胞仪支架中，然后单击“运行”开始加载样品和获取数据。根据需要调整事件、时间和流速。在 SSCA 与 FSCA 图中定义健康酵母细胞周围的门。然后记录所有对照样品的荧光。在分析处理过的样品之前，为创建的图定义门控策略。在使用流式细胞术软件分析数据之前，使用细胞仪和门控策略记录去磷酸化样品的荧光。通过测量和比较其表面表达蛋白质的细胞的 y 轴中位数，以及样品和对照之间非播放细胞提供的基线磷酸化来评估磷酸化。最后，使用提供的公式计算磷酸化差异中位数百分比。下图说明了不同SHP-2磷酸酶浓度和孵育时间对酵母表面显示底物中磷酸化差异中位数磷酸化差异的影响。所有SHP-2浓度的磷酸化差异中位数百分比随时间而减小，在4小时时在1,000纳摩尔SHP-2浓度下观察到的去磷酸化最高。孵育两小时后，1,000纳摩尔SHP-2产生约48.8%的中位磷酸化差异，显著低于同一时间点的750纳摩尔条件。在500纳摩尔、750纳摩尔和1,000纳摩尔SHP-2浓度下，将孵育时间从2小时延长至3小时时，中位磷酸化差异没有观察到显著差异。
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概览
这项研究介绍了一种利用酵母表面展示的底物进行酶修饰测定的新型协议。它特别展示了酪氨酸磷酸酶SHP-2在底物上的去磷酸化活性，突出了酶修饰动力学映射的潜力。
关键研究组成部分
科学领域
- 酶修饰测定
- 蛋白质化学修饰
- 酵母展示技术
背景
- 理解酶-底物相互作用对阐明细胞行为至关重要。
- 传统方法通常需要细胞裂解物或定制肽。
- 这项研究提供了一种使用酵母展示底物的新方法。
- 去磷酸化过程是蛋白质修饰研究的一个关键焦点。
研究目的
- 探索酶在不同底物上的动力学和偏好。
- 提供评估酶修饰的替代方法。
- 增强对酶活性在简化系统中的理解。
使用的方法
- 酵母表面展示技术
- 去磷酸化的酶测定
- 酶动力学分析
- 底物修饰评估
主要结果
- 该研究成功展示了酵母展示底物上的去磷酸化。
- 这种方法允许酶修饰的动力学映射。
- 它解决了研究酶-底物相互作用的挑战。
- 研究结果表明这种方法在酶学中有更广泛的应用。
结论
- 酵母展示底物为酶测定提供了一种可行的替代方法。
- 该协议提高了酶学动力学研究的可及性。
- 这项研究为未来的酶相互作用研究铺平了道路。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-throughput enzymatic modification screening using yeast surface display enables rapid interrogation of enzyme-substrate specificity and kinetics, directly supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. Flow cytometry-based quantification of extracellular modifications provides scalable, quantitative readouts for portfolio triage and predictive confidence in discovery workflows. This approach expands the accessible reaction space for functional screening, facilitating risk-adjusted advancement decisions in biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic mapping of enzyme-substrate preferences for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying modification kinetics across substrate variants.
- Facilitates predictive confidence in target selection through quantitative, high-throughput readouts.
Screening & Assay Development
- Prepares validated yeast-displayed substrate systems for downstream enzymatic screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative flow cytometry outputs for assay development.
- Enables scalable screening of enzyme activity and substrate modification in a platform-ready format.
Translational & Preclinical Research
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by enabling kinetic studies of enzyme activity on relevant substrates.
- Supports translational biomarker alignment when substrate modifications are disease-relevant.
- Reduces biological risk by clarifying enzyme mechanism and substrate selectivity prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, supporting both mechanistic and screening workflows.
- Discovery Biology: Empowers hypothesis-driven interrogation of enzyme-substrate interactions and pathway mapping.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and quantitative flow cytometry outputs for compound or enzyme evaluation.
- Analytics: Delivers robust statistical measurements of modification levels, enabling direct comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by supporting kinetic and mechanistic studies on disease-relevant substrates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable yeast display and flow cytometry platform adaptable to diverse enzyme-substrate pairs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and scales enzymatic modification assays for reproducible, high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management by providing quantitative, comparative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of enzyme targets and substrate candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in yeast surface display, enzymology, and flow cytometry analysis.
- Depends on access to flow cytometry instrumentation and compatible analytical software.
- Necessitates cross-team standardization of gating strategies and quantitative readouts.
- Adaptable to various enzyme-substrate systems with appropriate construct and reagent design.
- Limited to modifications detectable by flow cytometry and compatible with yeast display.
