Name: 通过蛛网膜下腔注射 AAV2 广泛转导小鼠新皮层神经元 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: 了解通过蛛网膜下腔注射AAV2实现小鼠新皮层神经元广泛转导的方法。该技术使感染面积扩大近四倍，并能选择性标记第五层锥体神经元，为神经活动记录与基因功能研究提供新工具。

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本工作获得了俄罗斯科学基金会资助，项目编号 20-15-00398P。

实验使用成年 C57BL/6 小鼠，年龄为 2-4 个月，雌雄均有（俄罗斯科学院谢米亚金-奥夫钦尼科夫生物有机化学研究所普希诺繁殖中心）。小鼠饲养于温度受控的动物房中（22 ˚C ± 2 ˚C，12 小时明暗循环，光照于 08:00 开启），自由摄取食物和水。ad libitum。所有实验操作均按照 ARRIVE 指南和欧盟动物实验指令 2010/63/EU 进行。研究方案经俄罗斯科学院人类神经活动研究所伦理委员会批准（2022 年 2 月 1 日第 1 号协议）。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦，并确保结果的可靠性。
1. 手术准备
<ol>
	<li>手术开始前，对所有手术器械和材料（纸片和塑料薄膜）进行灭菌处理（使用高压灭菌器或紫外灭菌器）。使用70%乙醇清洁手术区域。</li>
	<li>检查麻醉系统中的异氟烷液位，必要时进行补充。在诱导室底部放置一张干净的纸巾。</li>
	<li>将加热垫放置在立体定位仪框架上，并用一张干净的纸巾覆盖垫子。</li>
	<li>准备一个装有2%次氯酸钠溶液的瓶子，用于收集接触过病毒的微量移液器吸头、管子、棉签及其他物品。</li>
	<li>从-80 °C冰箱中取出一份AAV样品，置于冰上解冻。</li>
</ol>
2. 注射器准备
<ol>
	<li>使用33G钝头RN针清洗一支5 µL Hamilton微量注射器。吸取并排出70%乙醇，用新鲜乙醇重复此步骤3次。用蒸馏水冲洗注射器以去除残留乙醇，重复3次。</li>
	<li>取出推杆，通过法兰端用胰岛素注射器将石蜡油注入注射器筒内。确保微量注射器内无气泡。 
	注意：滞留的空气具有可压缩性，会影响注射器的准确性和精密度。</li>
	<li>将推杆重新插入微量注射器，并排出一滴油。将注射器装入立体定位注射装置，使刻度可见，以便监测所排出溶液的体积。</li>
</ol>
3. 手术前小鼠的准备
<ol>
	<li>称量小鼠。将小鼠放入与异氟烷连接的麻醉诱导室中。打开异氟烷挥发罐，设置浓度为5%，调节气流速至250 mL/min。5至7分钟内即可达到适当的麻醉深度。</li>
	<li>为验证麻醉的手术水平，需检查后肢足部受到疼痛夹捏时是否无须抖动和退缩反射，以及眼部接触时是否无眨眼反射。</li>
	<li>将蒸发器出气阀从诱导室切换至立体定位面罩。将异氟烷浓度降至1.8%-2.0%，并根据小鼠体重设定气体流量（25至35 g小鼠的流量为70-90 mL/min）。</li>
	<li>将小鼠从麻醉诱导舱中取出，置于立体定位仪上，并放置在加热垫（37 °C）上以防止手术麻醉期间发生低体温。将小鼠门齿固定于门齿杆，随后安装动物面罩。</li>
	<li>将动物小心地放置在耳杆上。在立体定位仪中，正确的头部位置应允许头部垂直移动，但不允许侧向移动。确保动物的体位不会引起不适。在整个手术过程中，密切监测麻醉深度、动物呼吸和体温。</li>
	<li>从眼睛到耳后剃除头部毛发。手术前彻底清洁并清除所有剃除的毛发。用5%碘酒溶液以环形方式擦拭剃净的头部表面进行消毒，随后使用70%乙醇再次以环形方式擦拭。&#160;重复3次。</li>
	<li>涂抹眼用凝胶以防止眼睛干燥。沿预计切口线在皮肤表面局部应用无菌4%利多卡因溶液，并在肩胛背区皮下注射地塞米松（0.02 mL，4 mg/mL）以预防手术相关疼痛并减轻可能的炎症反应。</li>
	<li>使用无菌手术刀片和剪刀，在头部中线处做一道4-5 mm长的切口以打开头皮。先在两耳之间做一小切口，再用剪刀逐步扩大切口，以避免损伤颅骨。</li>
	<li>用少量3%过氧化氢擦拭颅骨表面，以显露立体定位标志：前囟和后囟。立即用0.9% NaCl生理盐水终止反应。使用骨刮匙刮除颅骨表面的组织。</li>
	<li>将预先准备好的带有汉密尔顿注射器的电动注射装置安装到立体定位仪机械臂上。将手术光源对准暴露的颅骨，并将显微镜聚焦于前囟。</li>
	<li>通过显微镜观察，调节立体定位仪的机械臂，使针尖顶部正对前囟点中心。</li>
	<li>使用针尖将前囟和后囟调至水平位置，然后将臂移回前囟，记录坐标。利用这些前囟坐标及目标区域的图谱坐标，计算目标区域的相对坐标。</li>
	<li>将针头移至目标区域。在新的坐标位置降低针头并标记该位置。在考虑病毒扩散范围的前提下，选择靠近目标区域的位点进行病毒微量注射。 
	注意：这可以避免损伤目标区域的组织。我们使用以下坐标定位目标区域：AP -3.4，ML -2.0；病毒微量注射坐标为：AP -2.0，ML -1.4。若需感染初级视皮层神经元，上述坐标为最佳选择。</li>
	<li>尽可能避开含有大血管的区域。在手术显微镜下，利用明亮的冷光源照明，并在0.9% NaCl生理盐水浸润条件下，颅骨及脑表面的大血管应清晰可见。</li>
</ol>
4. 病毒注射
<ol>
	<li>取一个无菌牙科钻头（直径 0.5 - 0.8 mm）。在手术显微镜下观察颅骨表面，手动（徒手）或使用微型钻头手工钻出一个小颅骨开窗（颅窗）。注意不要对颅骨施加过大的压力。</li>
	<li>将机械臂移开，以防止钻颅窗时损坏微量注射针头。使用 0.9% NaCl 生理盐水浸润，并间歇性暂停操作，以避免骨组织过热并损伤硬脑膜。使用加压空气吹除骨屑。 
	注意：为获得加压空气，可使用带有内置空气过滤器（10 μm）的空气压缩机。为进一步净化空气，可使用无菌注射器滤器（0.20 µm）。以下类型的碳化钨牙科钻头适用：梨形（优先选用）、圆柱形钝头和圆形钻头。
	<ol>
		<li>使用钻头减薄骨层时，应确保整个圆周范围内的骨层减薄均匀。这有助于在不损伤硬脑膜的情况下移除骨片。为此，可先使用尖端为圆形的钻头，再使用尖端为平头的钻头。保持钻头与骨面垂直，否则一侧会比另一侧更薄。 
		注意：此外，钻头尺寸越小，所进行的颅窗直径越小，操作将越复杂。若后续将动物用于in vivo 实验，建议采用较小直径（0.5–0.6 mm）的颅窗。若计划将动物脑组织用于ex vivo 实验，则可采用较大直径的颅窗以简化操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当减薄后的骨片变得柔软且半透明时，停止钻孔。当骨面上形成足够深的凹陷后，应频繁暂停旋转并监测骨层厚度。骨面出现裂纹表明减薄已足够。</li>
	<li>用无菌生理盐水冲洗颅窗，然后用棉签吸除多余盐水。使用 27G 钩状针头和/或精细镊子去除残留的骨层。避免损伤硬脑膜。</li>
	<li>用一块经无菌生理盐水润湿的无菌纸巾覆盖颅骨表面。在纸巾上方的小鼠颅骨表面放置一片无菌透明薄膜。</li>
	<li>将立体定位臂移回，将微量注射针头正对薄膜上方定位。排出多余油液，直至剩余体积为 2 µL。 
	注意：最终油液体积可能因微量注射器容量而异。我们使用的是 5 µL 75-RN Hamilton 微量注射器。</li>
	<li>将等于注射体积 + 2 µL 的病毒液体滴加至一片透明薄膜上。</li>
	<li>通过手术显微镜观察，缓慢降低机械臂，使针尖位于病毒液滴中心。使用电动注射器将病毒吸入微量注射器中。将微量移液头和透明薄膜丢弃至含 2% 次氯酸钠的瓶子中。</li>
	<li>从颅骨表面移除浸有生理盐水的纸巾，并用棉签擦干颅骨。使用立体定位臂将针头定位至穿刺位点上方。</li>
	<li>排出一滴病毒液，以确认针头未堵塞。使用 30 G 钩状针头在硬脑膜上制作一个小切口。 
	&#8203;注意：在硬脑膜上制作的切口应尽可能小，以允许针头进入，同时避免在针头与硬脑膜之间留下缝隙，防止病毒由此泄漏。</li>
	<li>将注射器针头缓慢降至硬脑膜表面，并进行相应的深度计算。&#160;根据针尖首次接触皮层表面的位置，估算穿刺的皮层深度。</li>
	<li>将针尖缓慢插入皮层至 300 µm 深度。等待 2–3 分钟，使硬脑膜与针头粘附，然后缓慢将针头回撤至 200 µm 深度。再等待 2–3 分钟，使脑组织稳定。此操作可使针头牵拉硬脑膜向上，形成一个硬膜下空间，供病毒扩散。 
	注意：为最小化皮层损伤，建议使用 33 G 或更细的针头。需注意，针尖内径越小，组织反流堵塞针头的可能性越高。应使用钝头针头而非斜面针头，因为钝头针头可更精确地释放病毒液滴。
	<ol>
		<li>若将针头降至 150–200 µm 时未能穿透硬脑膜，反而使其弯曲，则应停止下降。提起针头，在硬脑膜上制作稍大的切口后，再次尝试降低针头。</li>
		<li>若在降低针头过程中脑脊液从切口处明显渗出，应等待渗出停止；否则难以控制针头穿过硬脑膜。用棉签吸除多余脑脊液。待液体停止流动后，提起针头并再次尝试。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>以 0.06 µL/min 的速率开始注射病毒悬液，同时监测已注射体积。共注射 1 µL 病毒。为避免破坏针头与皮层组织之间的密封，应在单一深度进行注射。
	<ol>
		<li>故障排除：注射初期可能出现病毒反流至脑表面的情况。此时应停止注射，等待 2–3 分钟后继续注射。重复上述操作，直至病毒反流停止。病毒和脑脊液会附着于针头表面，从而防止反流。</li>
		<li>另一种阻止病毒反流的方法是在皮层表面放置少量琼脂糖。这可抑制皮层搏动，并有助于密封针头。但需确保移液头未被琼脂糖堵塞。</li>
		<li>若针头下降时未能完全穿透硬脑膜，而仅部分穿透，则针头一侧可能无法与硬脑膜紧密贴合，导致病毒反流。此时应缓慢将针头从组织中撤出，再次尝试降低。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>输注完成后，将针头保留在目标位置额外 10 分钟，以使病毒从注射部位扩散。随后缓慢撤出针头，防止病毒沿针道反流溢出。</li>
	<li>完成针头撤出后，通过排出少量病毒液滴检查针头是否堵塞。使用 5-0 可吸收或不可吸收缝线缝合皮肤切口。</li>
</ol>
5. 术后护理
<ol>
	<li>缝合切口后，局部涂抹抗菌软膏。皮下注射生理盐水（5 mL/kg）和5%葡萄糖溶液（5 mL/kg），以预防脱水并促进麻醉后的恢复。肌肉注射酮洛芬（2.5 mg/kg）以减轻疼痛。</li>
	<li>将动物置于铺有加热垫的新笼子中，并持续监测直至其从麻醉中恢复。小鼠出现反应后，将其放回原饲养笼中。</li>
</ol>
6. 组织学
<ol>
	<li>在病毒注射后不少于21天，按照步骤3所述使用异氟烷对小鼠进行深度麻醉。通过夹捏后肢足部和尾巴，检查小鼠是否完全丧失胡须抖动和回缩反射，以确认其已充分麻醉。</li>
	<li>使用细剪刀沿胸部区域做一条正中切口（10–15 mm），暴露胸腔。小心分离膈肌，并用剪刀打开胸腔。</li>
	<li>将一支22G 1 1/2规格的针头插入左心室，同时用剪刀剪开右心房。先用50 mL预冷的100 mM磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注，随后用100 mL预冷的10%缓冲福尔马林灌注。</li>
	<li>小心取出整个小鼠脑组织。操作时，先用剪刀沿头皮中线做矢状切口。接着，使用平头骨钳从矢状缝与人字缝交界处开始，向前逐步移除颅骨骨片，直至鼻骨。当脑组织暴露后，剪断嗅球，用弯头刮匙轻柔取出脑组织，并将其放入含有10%缓冲福尔马林的50 mL离心管中。</li>
	<li>将脑组织固定过夜。使用组织粘合剂将脑组织固定在振动切片机的金属平台上，采用碳素钢刀片以50 µm厚度切取冠状切片。</li>
</ol>
7. 免疫染色
<ol>
	<li>第1天
	<ol>
		<li>用含0.3% Triton X-100的1× PBS（PBS-T）清洗脑切片，每次5分钟，共洗3次。室温（RT）下在PBS-T中孵育20分钟。</li>
		<li>使用封闭缓冲液（含5%正常山羊血清（NGS）和0.3% Triton X-100的1× PBS）在室温下封闭非特异性结合位点，孵育1小时。</li>
		<li>在4 °C下用针对parvalbumin或calbindin的一抗溶液（用封闭缓冲液按1:500稀释）孵育切片，过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>第2天
	<ol>
		<li>用PBS-T清洗切片3次，每次10分钟。在避光条件下，室温下用二抗（山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 546）按1:500比例用封闭缓冲液稀释后孵育2小时。</li>
		<li>用1× PBS清洗切片3次，每次5分钟。用软毛刷将脑切片转移至载玻片上。</li>
		<li>立即向每张切片加入0.1 mL抗荧光淬灭封片剂，并用22 mm × 50 mm的盖玻片封片。</li>
		<li>将共聚焦显微镜设置为20×或60×（A/1.4，油镜）放大倍数。使用488 nm和594 nm波长的激光采集目标脑区的多通道图像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

我们开发了一种新的方法，通过将AAV2病毒颗粒悬液注射到脑部蛛网膜下腔来转导小鼠新皮层神经元。该方法可实现病毒的广泛分布，感染组织体积几乎是将等量病毒直接注射入脑实质时的四倍。
通过不同途径（例如脑室内、鞘内或小脑延髓池注射）将病毒载体直接注射到脑脊液（CSF）中，是实现中枢神经系统广泛基因递送的常用策略33,34,35。然而，AAV2载体在成年大脑中通过脑室内或鞘内给药时，由于其对室管膜细胞具有高度亲和性，导致脑部转导效率有限28,33,36,37。室管膜细胞以单层形式存在，衬于第三和第四脑室以及脊髓中央管的内表面<sup class="xr...

哺乳动物的大脑由大量相互连接的抑制性、兴奋性和调节性细胞组成，这些细胞通过数万亿个突触形成神经环路1。神经科学的核心挑战之一是解析不同类型细胞在脑环路组织和功能以及行为中的作用。要在大脑内操控特定基因定义的细胞，需要引入并表达外源基因的方法。基于病毒的基因递送系统迄今为止是向中枢神经系统递送基因最有效且最简便的方法2。病毒递送系统基于具有复制能力的病毒（如腺病毒、腺相关病毒（AAVs）、慢病毒和逆转录病毒），这些病毒能够将遗传信息传递至宿主细胞2,3。
基于AAV的载体现已成为将目的转基因递送至脑内细胞的最常用工具之一，广泛应用于基础神经科学研究以及神经系统疾病基因治疗的开发。与其他病毒相比，复制缺陷型AAV具有多种优势特征，使其成为此类应用的理想载体。尤为突出的是，AAV载体能够高效转导非分裂细胞（终末分化细胞），如神经元和胶质细胞，从而实现高水平的转基因表达 体内2. 载体可轻松制备出高功能性滴度，适用于 体内 使用3,4,5重要的是，腺相关病毒介导的基因递送 体内 不会引起组织病理学改变及载体相关毒性6与腺病毒载体不同， 体内 在动物模型中，AAV 载体的给药通常不会引发针对转导细胞的宿主免疫反应，从而可在脑实质内实现外源基因的长期稳定表达2,7,8.
AAV载体广受欢迎的另一个原因是存在多种具有独特组织和细胞类型趋向性的AAV血清型9,10,11,12,13,14。不同AAV血清型表达不同的衣壳蛋白，导致其利用不同的细胞表面受体进入细胞，从而产生特异性的趋向性10,14。
AAV 的嗜性不仅由衣壳蛋白决定，还受多种其他因素影响14。研究表明，AAV 血清型 1、2、6、7、8 和 9 在原代培养中均可转导神经元和星形胶质细胞15,16，但在脑实质内注射后则表现出强烈的神经元嗜性17,18。AAV 载体的制备方法也会影响其对神经细胞的嗜性，即使针对同一血清型亦是如此。例如，经 CsCl 纯化的 AAV8 在脑实质内注射后表现出强烈的星形胶质细胞嗜性，而在相同条件下注射的碘克沙醇纯化 AAV8 则仅转导神经元19。AAV 的嗜性还可能受到注射剂量和体积的影响14。例如，高滴度的 rAAV2/1 可有效转导皮层兴奋性和抑制性神经元，而使用较低滴度时则明显偏好转导皮层抑制性神经元20。
因此，仅依靠衣壳血清型无法实现稳健的细胞类型特异性。&#160;可以使用细胞类型特异性启动子来克服腺相关病毒（AAV）衣壳广泛的天然嗜性。例如，人源突触素 I（human synapsin I）用于靶向神经元21，CaMKII 启动子可高度特异性地驱动谷氨酸能兴奋性神经元中的转基因表达20，ppHcrt 启动子可靶向侧下丘脑中表达促醒素（hypocretin, HCRT）的神经元22，PRSx8 启动子可靶向表达多巴胺β-羟化酶的去甲肾上腺素能和肾上腺素能神经元23，而 GFAP 启动子可驱动星形胶质细胞特异性表达24。 然而，某些细胞特异性启动子转录活性较弱，无法驱动足够水平的转基因表达25。此外，能够容纳于 AAV 病毒载体中的短启动子通常无法保持细胞类型特异性1,26。例如，已有研究表明 CaMKII 构建体也可转导抑制性神经元12。
除了细胞类型特异性（嗜性）外，另一个重要特征&#160;AAV转导效率的一个关键因素是不同AAV血清型具有不同的扩散特性。AAV2及其他四种病毒载体在脑实质中的扩散能力较弱，因此介导的转导范围较小17,27最广泛的神经元转导见于 AAV 血清型 1、9 和 rh.1011,17,18,19,28.
在特定脑区驱动目的转基因表达的最常用方法是将 AAV 载体直接注射到目标脑区（实质）中3在脑实质内注射后，即使是在大脑中扩散效果较好的 AAV 血清型，通常也仅转导注射部位周围的局部区域 12此外，实质内注射是一种侵入性操作，会导致目标区域周围组织损伤。因此，这种病毒注射方法不适用于某些实验任务。例如，对细胞进行广泛标记&#160;在旨在研究自由活动动物皮层神经元功能的实验中，包括使用单光子或双光子显微镜时，这一点尤为理想。29,30,31,32.
本文介绍了一种新的腺相关病毒注射技术，该技术通过蛛网膜下腔病毒灌注，实现成年小鼠新皮层神经元的广泛转导，并可保留脑组织用于后续神经元活动的光学或电生理记录。该方法不仅确保了新皮层浅层神经元的广泛转导，即使使用CAG等强非特异性启动子，也能在大量第五层锥体神经元中实现高特异性的外源基因表达。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;仪器设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 气密式进样器，型号 1701 RN（5 µL 75 RN Hamilton 微量进样器）</td><td>Hamilton Company</td><td>货号/目录号 # 7634-01，Hamilton 或货号 HAM7634-01，Merck</td><td></td></tr><tr><td>33 G RN 针头，尖端类型 3</td><td>Hamilton Company</td><td>货号/目录号 # 7803-05，Hamilton</td><td></td></tr><tr><td>双目显微镜</td><td>Nikon 或 Micromed</td><td>型号 MC-4 ZOOM</td><td></td></tr><tr><td>基于 Cerna 平台的激光扫描共聚焦显微镜</td><td>ThorLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷光源</td><td>RWD</td><td>型号 76312</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000 S 振动切片机</td><td>Leica Biosystems</td><td>76001-014</td><td></td></tr><tr><td>低流量麻醉系统（含启动套件）</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>13-005-111（型号 SomnoSuite）</td><td></td></tr><tr><td>机械移液器 0.1 &amp;ndash; 2.5 &amp;micro;L Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>3123000012</td><td></td></tr><tr><td>机械移液器 10 &amp;ndash; 100 &amp;micro;L Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>小鼠剃毛器</td><td>RWD</td><td>型号 CP-5200</td><td></td></tr><tr><td>微型钻机及钻头（0.5 mm，圆形）</td><td>RWD</td><td>78001, 78040</td><td></td></tr><tr><td>或台式数字立体定位仪、小鼠麻醉面罩、小鼠耳杆（60 度）</td><td>RWD</td><td>型号 68027, 68665, 68306</td><td></td></tr><tr><td>空气压缩机</td><td>Bambi</td><td>BB8</td><td></td></tr><tr><td>单通道手动移液器 0.5–10 &amp;micro;L</td><td>RAINN</td><td>17008649</td><td></td></tr><tr><td>小型动物立体定位仪</td><td>KOPF</td><td>型号 962</td><td></td></tr><tr><td>立体定位注射器</td><td>Stoelting</td><td>10-000-004</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;手术器械（工具）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 G 牙科针头（Ni-pro）</td><td>Biodent Co. Ltd.</td><td></td><td>用于切开硬脑膜</td></tr><tr><td>骨刮匙</td><td>Fine Science Tools</td><td>10075-16</td><td></td></tr><tr><td>骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16025-14</td><td>用于去除颅骨</td></tr><tr><td>弯头刮勺</td><td>Mozhaisk Medical Supplies Factory</td><td></td><td>用于从颅腔中取出脑组织</td></tr><tr><td>牙科磨头</td><td>DRENDEL + ZWEILING</td><td></td><td>用于开颅；形状：梨形/圆头圆柱形/圆形；尖端直径：0.55–0.8 mm</td></tr><tr><td>持针器（Halsey 微型持针器）</td><td>Fine Science Tools</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯外科缝线或 Vicryl 外科缝线（5-0，可吸收）</td><td>Walter Products (Ethicon)</td><td>S139044 (W9442)</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄（#3）配手术刀片（#11）</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12, 10011-00</td><td></td></tr><tr><td>剪刀（超窄剪刀）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>用于剪开皮肤</td></tr><tr><td>剪刀（精细剪刀）</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>用于剪断缝线</td></tr><tr><td>PROLENE 外科缝线（聚丙烯）</td><td>Ethicon (Johnson &amp;amp; Johnson)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子（#5 镊子）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>镊子（抛光不锈钢镊）</td><td>Fine Science Tools</td><td>11210-20</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;一次性耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 mL 胰岛素注射器</td><td>SITEKMED</td><td></td><td>用于将凡士林油装入微量注射器，或给药</td></tr><tr><td>细胞培养板</td><td>SPL Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>棉签</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545E</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素注射器针头（27 G）</td><td>SITEKMED</td><td></td><td>用于清除孔洞（开颅部位）中的碎屑</td></tr><tr><td>无尘擦拭布 CLEANWIPER</td><td>NetLink</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>纸巾</td><td>Luscan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>StatLab</td><td>STLPM996</td><td></td></tr><tr><td>无菌外科手套</td><td>Dermagrip</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌针式滤器（0.2 &amp;mu;m）</td><td>Corning</td><td>431229</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;药品/化学品（试剂）&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% 缓冲福尔马林或 4% 多聚甲醛</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J61899.AK</td><td></td></tr><tr><td>碘酒溶液（5%）</td><td>Renewal</td><td></td><td></td></tr><tr><td>抗生素软膏 Baneocin（杆菌肽 + 新霉素）</td><td>Sandoz</td><td></td><td>外用抗菌剂</td></tr><tr><td>Aqua Polymount 封片剂</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>羧甲基纤维素眼用凝胶 Vidisic（眼用凝胶）</td><td>BAUSCH+LOMB (Santen)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>羧基修饰红色荧光微球（FluoSphere）</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F-8801</td><td></td></tr><tr><td>地塞米松（4 mg/mL）</td><td>Ellara (KRKA)</td><td></td><td>合成糖皮质激素</td></tr><tr><td>蒸馏水 H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70%）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氟比洛芬 2.5%（酮洛芬）</td><td>VIC</td><td></td><td>非甾体抗炎药（NSAIDs）</td></tr><tr><td>葡萄糖溶液 5%</td><td>Solopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>山羊抗兔 IgG（H+L）交叉吸附，Alexa Fluor 546 标记</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Karizoo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>利多卡因溶液（2% / 4%）</td><td>Solopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清（NGS）</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Eco-servis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>兔抗小清蛋白抗体</td><td>Merck Millipore</td><td>AB15736</td><td></td></tr><tr><td>兔单克隆重组抗钙结合蛋白抗体</td><td>Abcam</td><td>ab108404</td><td></td></tr><tr><td>生理盐水（0.9% NaCl 溶于 H2O）</td><td>Solopharm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50-178-1844</td><td></td></tr><tr><td>凡士林油</td><td>Genel</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

通过蛛网膜下腔注射 aav2 实现小鼠新皮层神经元的广泛转导

Widespread Transduction of Mouse Neocortical Neurons by Subarachnoid Injection of AAV2

重组腺相关病毒是在实验生物学多个领域，特别是在神经科学中，用于递送和表达各种目的基因的灵活而强大的工具。在特定脑区驱动目的转基因表达的最常用方法是将AAV载体直接注射到脑实质中。然而，该方法无法实现某些in vivo实验所需的广泛神经元转导。本文介绍一种基于将病毒注入脑蛛网膜下腔的新型技术，可在小鼠新皮层实现广泛基因表达。这种神经元标记方法不仅能够确保成年小鼠浅层新皮层神经元的广泛转导，而且即使使用CAG等强非特异性启动子，也能在大量第五层锥体神经元中实现高特异性的转基因表达。此外，由于细胞转导发生在距离注射部位较远的位置，该方法有助于保护脑组织，便于后续进行神经元活动的光学或电生理记录。

在一系列初步实验中，我们采用传统的皮层内注射方法，使用携带快速通道视紫红质（oChIEF）基因并融合了EGFP荧光蛋白、在CaMKII启动子驱动下的AAV2病毒，转导小鼠新皮层第五层的锥体神经元。与AAV2的典型特征一致12，我们获得的感染区域相对较小，宽度不超过1 mm（图1A）。然而，在部分实验中，我们观察到AAV2异常广泛的扩散，某些情况下覆盖了超过半个大脑半球的新皮层区域（图1B）。我们推测，这种广泛的病毒分布可能发生在病毒进入蛛网膜下腔后，随脑脊液（CSF）流动而扩散至整个脑表面所致。我们注意到，这种情况通常出现在注射针插入深度较浅（&lt;200 µm），且硬脑膜上的穿刺孔直径恰好与针头直径匹配，从而阻止了病毒颗粒悬液回流时发生。为了可视化这一过程，我们在病毒颗粒注射液中添加了红色荧光纳米颗粒（n = 3只小鼠）。注射3周后，经心脏灌注10%缓冲甲醛溶液，小心地从颅骨中取出脑组织，且未损伤硬脑膜。在落射荧光双目显微镜下观察完整脑组织，发现红色...

介绍了一种利用蛛网膜下腔病毒灌注实现腺相关病毒广泛递送的新技术。该方法不仅能够确保小鼠新皮层浅层神经元的广泛转导，而且即使使用非特异性启动子，也能实现目的基因在第五层锥体神经元中的选择性表达。

通过蛛网膜下腔注射 AAV2 实现小鼠新皮层神经元的广泛转导

重组腺相关病毒是一种灵活且强大的工具，可用于在多个研究领域中递送和表达各种目的基因。

我们的研究致力于开发一种能够在小鼠新皮层大体积神经组织中实现病毒转导的方法。通常，病毒颗粒悬液被直接注射到脑实质中。在此情况下，转染区域由病毒颗粒在脑组织中的扩散范围决定，而其扩散范围有限。我们通过脑表面将AAV2病毒载体注入蛛网膜下腔。研究发现，与实质内注射相比，病毒经蛛网膜下腔给药可使感染区域增加近四倍。该新技术可实现成年小鼠新皮层神经元的广泛转导，并有助于保护脑组织，以便后续进行神经元活动的光学或电生理记录。我们的注射方法能够实现外源基因在大量第五层锥体神经元中的特异性表达，即使使用强效的非特异性启动子亦是如此。然而，这种特异性的机制尚未完全阐明。首先，将麻醉小鼠的门齿固定于门齿杆上，并安装动物面罩。将小鼠小心地固定在耳杆上。从眼睛到耳后剃除头部毛发，然后用70%乙醇擦拭剃毛区域，再用5%碘酒溶液擦拭。局部涂抹无菌的4%利多卡因溶液，并皮下注射0.02毫升地塞米松以减轻疼痛和炎症。使用无菌手术刀和剪刀，从两耳之间开始沿中线做一道4至5毫米的切口，以打开头皮。用剪刀扩大切口，避免损伤颅骨。用3%过氧化氢擦拭颅骨表面，以清晰显示前囟和人字缝。立即用0.9%氯化钠生理盐水终止反应。然后使用骨刮匙从颅骨表面去除组织。将预先准备好的带有哈密尔顿注射器的电动注射装置安装到立体定位仪机械臂上。使用手术光源照亮暴露的颅骨，并将显微镜聚焦于前囟。通过显微镜观察，调节立体定位仪臂，使针尖正对前囟上方。利用针尖将前囟与人字缝在水平方向上对齐。返回至前囟，记录坐标。将针头移至计算出的坐标位置，降低至新位置并做标记。在考虑病毒扩散范围的同时，选择靠近目标区域的病毒注射位点。现在，在显微镜下使用直径为0.5至0.8毫米的无菌牙科钻头进行小范围开颅。使用加压空气吹除骨屑。用无菌生理盐水冲洗孔洞，并用棉签吸去多余液体。然后使用带钩状尖端的27号针头或精细镊子小心清除残留的骨碎片，注意避免损伤硬脑膜。用无菌生理盐水浸湿的纸巾覆盖颅骨。然后，将一片无菌透明薄膜覆盖在颅骨表面。将立体定位仪的机械臂移回，并将微量注射器针头对准透明薄膜上方。随后排出多余的油，直至剩余两微升。用移液器将病毒注射体积的液体以及另外两微升病毒滴加到透明薄膜上。通过显微镜观察，将针尖 lowered 至病毒液滴的中心。现在使用电动注射器将病毒吸入微量注射器中。移除颅骨上湿润的纸巾，并用棉签擦干该区域。重新调整立体定位仪的机械臂和针头，使其位于注射位点上方。接着，滴加一滴病毒液以检查针头是否堵塞。使用带有钩状尖端的30号针头在硬脑膜上切开一个小切口。将注射器针头降至硬脑膜处，并根据表面接触点计算插入深度。将针头缓慢插入皮层至300微米深度，等待两到三分钟，然后回撤至200微米并再等待两到三分钟。以每分钟0.06微升的速度开始病毒注射，总量为1微升。注射完成后，将针头留在靶位点10分钟，以使病毒充分扩散。随后缓慢撤出针头，避免回流。滴加一滴病毒液以确认针头未堵塞。使用5-0可吸收或不可吸收缝线关闭头皮切口。与传统的皮层内注射相比，AAV2的蛛网膜下腔给药导致神经元感染区域显著扩大，在内外侧和前后方向上均接近四倍扩展。蛛网膜下腔病毒注射导致大脑皮层第二、第三和第五层神经元出现强烈的绿色荧光标记，而第四层和第六层未见标记的细胞体，但分别可见明显的树突和轴突。在蛛网膜下腔注射过程中，随病毒悬液加入的荧光颗粒沿脑表面分布，表明病毒通过脑脊液扩散，其覆盖范围较神经元标记更为广泛。额叶切片中绿色荧光的大范围表面分布证实了蛛网膜下腔注射后皮层的广泛感染，这与标准注射所见的局限性局部感染形成对比。在上颗粒层中，大部分被转导的神经元共表达小清蛋白或钙结合蛋白，而在第五层中未检测到共标记的中间神经元，所有被感染的细胞均 exclusively 由锥体神经元构成。

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神经科学

通过蛛网膜下腔注射 AAV2 广泛转导小鼠新皮层神经元

本文介绍了在视觉皮层中通过颅内注射腺相关病毒（AAV）载体对神经元和胶质细胞进行荧光标记的方法。...

颅内注射腺相关病毒载体

来源：Li, D., et al. 成年小鼠中重组腺相关病毒的直接鞘内注射. J. Vis. Exp.

在小鼠模型中通过鞘内递送病毒治疗中枢神经系统疾病

病毒载体可实现靶向基因操作。本文演示一种在小鼠脊髓中进行条件性基因表达或基因剔除的方法，通过立体定位注射将病毒载体注入脊髓背角，此处是初级躯体感觉传入神经与中枢神经系统神经元之间突触联系的重要部位。...

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使用双病毒载体通过联合脑部与脊柱手术靶向新生大鼠皮质脊髓束

本方案描述了在皮层缺血性脑卒中后通过病毒介导的方式异位表达 Neurod1 的方法。Neurod1 的递送分为两种情况：（1）在脑卒中后亚急性期（7 天）利用 Cre-Flex AAV 系统在野生型小鼠中进行；（2）在脑卒中后慢性期（21 天）利用单个 AAV...

用于研究缺血性脑卒中亚急性期和慢性期转导细胞中 Neurod1 异位表达的 AAV 系统与小鼠模型

了解通过蛛网膜下腔注射AAV2实现小鼠新皮层神经元广泛转导的方法。该技术使感染面积扩大近四倍，并能选择性标记第五层锥体神经元，为神经活动记录与基因功能研究提供新工具。

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