使用低温重合荧光、电子和离子束显微镜对细胞进行靶向研磨的工作流程
2025年10月17日
该工作流程能够使用低温三重合成像平台，针对小（轴向范围<1μm）和稀有（每个细胞1个拷贝）的荧光标记生物结构的薄片生产。该平台将荧光显微镜、聚焦离子束铣削和扫描电子显微镜集成在单个焦点位置，并在铣削时实现同步荧光显微镜。
我的研究开发光学显微镜方法，在聚焦离子束研磨过程中保存低温层层的细胞特征，从而通过低温电子断层扫描进行详细分析，揭示本地生物组织。光学显微镜已被集成进冷冻FIB-SEM系统，但很少与FIB在同一位置使用。这需要基于注册的指导方法来保留最终层片中荧光标记的靶标。
首先，当过渡站达到低温后，使用液氮手动冷却。将一个剪辑好的自动网格装入为低温光学显微系统设计的样品盒中。确保自动格栅位于胶合的盖片和垫片之间。
拧紧环形螺丝以关闭飞轮，然后插入传输站的插槽。将转移站连接到低温光学显微系统。使用内部腔室相机引导样品盒进入样品台。
在光学显微软件中，将样品级从加载位置移至预定的三束束位置。在FIB-SEM软件中，将放大倍率设为100倍，点击左上角窗口。在光学显微镜软件的对准标签中，点击Z键并选择播放功能，即可获取网格的SEM图谱。
找出一个有破损碳膜的方形区域，双击将其移动到该位置。返回软件界面。启动FIB并获取图像。
用左上角的下拉菜单调整放大倍率。按下播放键以显示FIB图像。然后用滑动杆设置步长。
现在点击Z和Z键，调整阶段Z位置，直到离子和电子图像中的水平线与同一特征对齐。在光学显微镜软件中选择SEM标签。使用X和Y按钮将SEM和离子图像之间的共同特征对齐。
现在打开荧光显微镜。选择FLM标签，设置反射光成像条件，然后选择播放。然后将反射光图像与扫描电子显微成像对齐。
放大图像，点击矩形选项，定义离子束的铣削图案。在显示器2中点击“开始图案化”，利用聚焦离子束铣削一个小图案。确认铣削图案在聚焦离子束和荧光显微镜的视角中都能看到。
在光学显微软件中，进入定位标签页，激活相应条件以设置荧光通道。将每个荧光团分配到独立通道，并新增一个明场通道。调整每个荧光通道的LED功率和曝光时间，以识别目标。
参数满意后，通过轴向步进获得预铣荧光Z堆栈。然后将目标标记为感兴趣区域。切换到FIB-SEM软件，在感兴趣的区域画一个层状。
进行粗铣以去除散装材料，同时保持荧光显微镜开启以监测信号变化。从终端打开基于Python的干涉仪工具包，监测层片稀释期间的荧光信号。利用清洁截面模式将投资回报率（ROI）稀释到大约两微米。
对于轴向范围超过300纳米的目标，在Python图形界面中选择荧光显微照片中的目标。软件会随着每一帧自动开始绘制亮度随时间变化。通过Python工具包监测荧光强度。
使用清洁截面模式铣削样品，去除目标区域下方残留的支撑膜。观察荧光强度的突然下降，作为切换铣削方向的信号。如果从下而上铣削时发现明显下降，应停止并从上而下开始铣削。
完成自上而下铣削后，从下而上以清洁截面模式铣削片层，直到达到所需厚度。然后拍摄片片的研磨后荧光图像。将样本转移到CryoTEM。
将研磨后多通道荧光图像和CryoTEM投影图像加载到定制的射影变换软件中，用于兴趣区域的注册。现在选择8到10对在荧光和电子显微镜图像中可见的参考点，以计算射影变换。使用叠加图像作为选择成像区域的参考。
然后根据目标结构的大小和所需分辨率，为倾斜系列选择合适的放大倍率和采集参数。标记SiR-管蛋白的分化巨噬细胞显示出一个约一微米直径的明亮荧光点，对应MTOC，并有向细胞边缘辐射的纤维状结构，符合微管网络。当样品被铣削至约800纳米厚度时，单一的荧光MTOC点分辨成两个不同的斑点，每个斑点直径约700纳米。
去除非荧光块状材料和吸收支持膜后，荧光强度增加，随后随着层层从两微米进一步变薄至低于200纳米，荧光强度急剧下降。相关的低温荧光和电子显微镜使得铣削过程中结构的精确定位成为可能。重建的断层扫描和分段模型显示，中心粒由微管三联组组成。
在最终层片中仅保留一个荧光斑点的情况下，对应的断层扫描显示单个中心粒。基于毫米磨法的荧光准确性受限于配准方法，这些方法常受衍射分辨率限制、折射率不匹配以及铣削引起的运动影响。同时光学显微镜和FIB铣削通过使用荧光显微镜的实时反馈来指导铣削过程，从而消除配准误差。
这避免了因衍射极限和折射率不匹配引起的误差，从而实现精确铣削，从而在最终片片内保留荧光标记结构，用于冷冻电子断层扫描。我们的研究使得观察此前低温外星外移难以直接观察的细胞结构成为可能，揭示了众多关键微分子机器背后的分子机制。
概述
这个工作流程能够生产针对小型且罕见的荧光标记的生物结构的低温片层。在单一焦点位置集成荧光显微镜、聚焦离子束研磨和扫描电子显微镜，允许同时进行成像和研磨。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生物物理学
- 显微镜技术
背景
- 光学显微镜方法对于在研磨过程中保留细胞特征至关重要。
- 将荧光显微镜集成到冷冻FIB-SEM系统中是罕见的。
- 基于配准的引导对于保持荧光标记的目标是必要的。
- 理解天然的生物组织对于详细分析至关重要。
研究目的
- 开发在低温片层中保留细胞特征的方法。
- 通过低温电子层析术实现详细分析。
- 提高在研磨过程中针对荧光结构的精确度。
使用的方法
- 使用液氮手动冷却转移站。
- 将荧光显微镜与FIB-SEM系统集成。
- 获取研磨前的荧光z-stacks。
- 使用Python工具包监测研磨过程中的荧光强度。
主要结果
- 移除非荧光的大体材料后，荧光强度增加。
- 相关的低温荧光和电子显微镜实现了精确的靶向。
- 重建的层析图显示了中心粒的结构。
- 在某些情况下实现了单中心粒的可视化。
结论
- 该研究展示了低温片层生产的有效方法。
- 基于荧光的靶向提高了结构分析的准确性。
- 成像技术的集成增强了对生物组织的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Simultaneous cryogenic fluorescence, electron, and ion beam microscopy enables precise, real-time targeting of rare cellular structures during lamella preparation for cryo-electron tomography. This workflow eliminates registration errors and enhances the preservation of disease-relevant subcellular features, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking. The approach supports higher predictive confidence in structural biology pipelines and facilitates risk-adjusted portfolio decisions for complex biological targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and preservation of fluorescently labeled subcellular targets during sample preparation.
- Reduces ambiguity in mechanistic studies by maintaining structural integrity of rare or small features.
- Improves predictive confidence for target validation by correlating fluorescence with ultrastructural data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lamellae for downstream high-resolution imaging and quantitative analysis.
- Supports reproducible sample preparation by integrating real-time fluorescence feedback during milling.
- Facilitates standardization of workflows for screening rare cellular events or phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural preservation with translational biomarker discovery when fluorescent labels mark disease-relevant features.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting correlative imaging strategies.
- De-risks advancement decisions by providing high-fidelity structural data on targets of interest.
Pipeline & Workflow Integration
This tri-coincident imaging workflow integrates at the interface of discovery biology and structural analysis, bridging early target validation with preclinical model characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of labeled structures during milling.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lamella preparation for downstream imaging assays.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence intensity measurements to guide and document sample processing.
- Translational Research: Maintains alignment between molecular labeling and ultrastructural readouts for biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for targeting diverse cellular structures across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of lamella preparation for high-resolution imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust structural data on rare targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct structural evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic microscopy, fluorescence imaging, and focused ion beam operation.
- Demands integrated instrumentation capable of simultaneous tri-modal imaging and milling.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and sample handling protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or labeling strategies.
- Practical limitations include fluorescence signal stability and potential milling-induced motion artifacts.
