Name: 复合巨型单层囊泡的合成：一种有核细胞的仿生模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学习复合巨型单层囊泡的合成方法，利用电形成和渗透冲击技术构建囊泡中囊泡结构，模拟有核细胞。该方法结合荧光显微镜与纳秒脉冲电场处理，为研究细胞电穿孔和电变形提供重要的生物物理模型。

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Rupesh Kumar 感谢印度政府人力资源发展部（MHRD）提供的 PMRF 研究金及应急资助。我们衷心感谢印度理工学院孟买分校 IRCC 中央设施提供的共聚焦激光扫描显微镜。

1. 脂质混合溶液的制备
<ol>
	<li>配制1 mL的DMPC和胆固醇溶液，摩尔比为63:37，终浓度为5 mg/mL。&#160;具体操作为：&#160;加入149 µL DMPC（25 mg/mL的氯仿储备液），252 µL胆固醇（5 mg/mL&#160;的胆固醇氯仿溶液），以及599 µL氯仿。</li>
	<li>另配制1 mL的DMPC:胆固醇溶液，摩尔比为57:43，浓度为5 mg/mL，混合139.8 µL DMPC（25 mg/mL的氯仿储备液），301 µL胆固醇（5 mg/mL，由粉末溶于氯仿制备&#160;而成），以及559.2 µL氯仿。</li>
	<li>为染色脂双层，向1 mL摩尔比为63:37的DMPC和胆固醇脂质混合物（如步骤1.1和1.2所述）中加入100 µL Nile Red（来自5 mM的储备液）。或者，向1 mL已制备的脂质混合物（如步骤1.1和1.2所述）中加入30 µL Liss Rhod-PE（1 mg/mL的Liss Rhod-PE储备液）。 
	注意：由于溶剂（氯仿）具有高挥发性，在多次开启瓶装储备液（25 mg/mL DMPC）使用后，其浓度可能升高&#160;，从而改变溶液组成。</li>
</ol>
2. 合成简单巨大单层囊泡（sGUVs）的电形成方案
<ol>
	<li>用洗洁精溶液彻底清洗镀有氧化铟锡（ITO）的载玻片，并用去离子水（0.055 µS/cm）冲洗。再用100%乙醇溶液清洗载玻片，再次用去离子水冲洗，然后在85 °C的烘箱中干燥。</li>
	<li>使用钳形电流表确定ITO镀膜载玻片的导电面。将清洗后的ITO镀膜载玻片固定在旋涂仪载物台上，利用真空吸附，使导电面朝上。</li>
	<li>取25 µL脂质溶液（按步骤1.1制备），在ITO载玻片的导电面上滴加四滴。另取一片ITO载玻片，同样在其导电面上滴加四滴25 µL的脂质溶液（按步骤1.2制备）。</li>
	<li>将两片涂有脂质的载玻片置于避光的干燥器中真空干燥至少2小时。 
	注意：避光可防止脂质发生可能的化学变化。</li>
	<li>将一片涂有脂质的ITO载玻片（使用步骤1.1制备的脂质）与另一片洁净的ITO载玻片平行放置，使导电面相对，中间夹入厚度为3 mm的硅橡胶垫片。用夹具密封组装件，形成一个稳固的电形成腔室。</li>
	<li>对使用步骤1.2制备的脂质溶液涂覆的ITO载玻片，按照步骤2.5所述相同程序构建电形成腔室。</li>
	<li>将两个腔室置于温度维持在38–40 °C的培养箱中，使用2 mL注射器向腔室内注入100 mM蔗糖溶液。利用双通道函数发生器施加5 Vpp、频率10 Hz的交流电场，持续4小时。 
	注意：确保ITO载玻片的导电面正确夹接到连接函数发生器的鳄鱼夹上。</li>
	<li>断开电形成腔室与函数发生器的连接。将腔室从培养箱中取出，静置冷却至室温。使用注射器分别从两个腔室中收集合成的sGUVs，并转移至两个2 mL微量离心管中，在室温（25–27 °C）下孵育1小时，随后进行渗透冲击处理。</li>
</ol>
3. 渗透休克中的形态转变（sGUV 转 Stomatocyte 再转 cGUV）
<ol>
	<li>将200 µL悬浮于含100 mM蔗糖溶液的水合介质中的sGUVs转移至观察室。</li>
	<li>向观察室中含200 µL 100 mM蔗糖的sGUVs悬浮液中加入125 µL葡萄糖溶液（300 mM），以诱导渗透冲击，启动sGUVs的形态转变。 
	注意：对于由步骤1.1和1.2中给出的脂质组成合成sGUVs以进行渗透冲击驱动的形态转变，请遵循步骤3中所述的相同程序。</li>
	<li>将经历渗透冲击的sGUVs置于显微镜载物台上的观察室内静置1小时。</li>
	<li>为进行并观察sGUVs的形态转变，将&#160;观察室（电融合室、培养皿、凹面载玻片或任何可用于显微观察的腔室）放置在倒置显微镜的载物台上，并让囊泡沉降。</li>
	<li>监测观察室内发生的形态转变。使用微分干涉差（DIC）显微镜和落射荧光显微镜，配备Plan fluor ELWD 20x/0.45和Plan fluor ELWD 40x/0.60物镜，观察sGUVs的形态变化。</li>
	<li>观察转变过程中口形囊泡的形成。随时间推移持续监测观察室，较大的囊泡首先沉降至底部，随后出现数量增多的小型囊泡。</li>
</ol>
4. 改变cGUVs内层、环形及外层区域的导电性
<ol>
	<li>通过在不同区域（内腔、环形区域和外侧）的cGUVs中加入适量（µL）的7.5 mM储备盐溶液，调节各区域溶液的电导率&#160;对sGUVs施加渗透冲击。
	<ol>
		<li>例如，为了使外层和内层的导电性高于环形区域，将200 µL蔗糖溶液转移至电融合室中，再向室内加入20 µL 7.5 mM盐溶液。通过加入125 µL 300 mM葡萄糖溶液以诱导渗透冲击。</li>
		<li>让经渗透休克处理的sGUVs静置3-4小时。&#160;在此情况下，cGUVs 的外侧和内侧区域的电导率高于末端环形区域。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用函数发生器在含有间距为500 µm导线电极的电融合室中施加7.5 Vpp、100 kHz的交流电场，对cGUVs进行电致变形。</li>
	<li>施加交流电场后，以每秒10帧的速度采集视频，观察到外层囊泡呈扁球形形变，内层囊泡呈长球形形变，表明在cGUV结构域中，外层和内层区域的电导率高于环形区域。</li>
</ol>
5. cGUVs 的显微镜分析
<ol>
	<li>倒置显微镜成像：使用倒置显微镜结合单色相机进行微分干涉差（DIC）和落射荧光显微镜观察。采用平场萤石、超长工作距离（ELWD）20倍/0.45和40倍/0.60物镜，观察sGUVs的形态转变。在落射荧光研究中，对尼罗红染色的双分子层使用绿色滤光片（激发波长510-560 nm，二向色镜575 nm，吸收波长590 nm）。
	 
	注意：DIC图像可提供连接颈状态的重要信息，确认其是否保持完整或已融合形成cGUVs。</li>
	<li>使用ImageJ软件插入比例尺并对显微图像进行裁剪。添加比例尺时，依次选择 分析 | 设置比例尺 对图像进行校准，然后选择 分析 | 工具 | 比例尺 插入比例尺。</li>
	<li>共聚焦显微镜用于形态学观察：为更清晰地了解cGUVs的形态结构，&#160;采用激光扫描共聚焦显微镜进行z轴扫描，步长为1 µm。共聚焦显微成像：使用配备平场复消色差40倍/1.3油镜DIC物镜的激光扫描共聚焦显微镜对cGUVs进行成像。采用红色单通道模式对尼罗红或罗丹明-PE染色的cGUVs进行成像，激发波长为561 nm，发射波长范围为561-695 nm。</li>
	<li>在显微镜配套软件中修改并导出图像的.czi文件，插入比例尺等图形，并启用 2D、3D视图，然后进入 处理 | 方法 | 参数，点击 应用 以获得JPG格式图像。</li>
	<li>共聚焦显微镜样品准备：将含有cGUVs的水溶液注入经改装的定制样品腔（底部玻璃替换为盖玻片），用于共聚焦成像。静置样品10-15分钟，使cGUVs充分沉降；将cGUVs混合液加入凹面载玻片腔室，并用盖玻片密封，以固定cGUVs的运动。随后，通过共聚焦显微镜进行z轴扫描（间隔1 µm）分析cGUVs。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

脂质的组成和类型在很大程度上决定了构成大单层囊泡（GUV）的双层膜的力学性质。由DMPC/Chol组成的双层膜在受到渗透冲击时会表现出独特的形态转变。在强烈的高渗渗透冲击下，小GUV（sGUV）内部的水相液体被排出，导致GUV双层膜发生形变。所观察到的形态转变主要受水分外流速率和双层膜弯曲刚性的共同影响。这些形变可呈现多种形式，包括星形和哑铃形，具体形态取决于渗透冲击的强度以及双层膜的脂质组成。
有趣的是，DMPC-胆固醇双分子层的固有特性有利于在室温下诱导sGUV转变为口形体（stomatocyte）形态。在此转变过程中，颈部区域的收缩导致形成囊泡中囊泡（VIV）结构。在最终的VIV结构中，内层囊泡与外层囊泡完全分离。先前的研究报道，当使用纯水制备囊泡并利用葡萄糖诱导渗透冲击时，对于DMPC/Chol摩尔比为70:30的双分子层组成，内层囊泡可在约30秒内实现完全分离15。相比之下，我们采用67:37 DMPC:Chol摩尔比的组分，在蔗糖溶液中合成sGUV，并通过在外层悬浮液中添加葡萄糖以产生密度差异，使囊泡沉降至观察腔底部，便于...

仿生模型已被广泛用于研究细胞膜复杂的生物物理现象。这些最简单的仿生模型通过最大限度减少生物细胞中众多变量的干扰，提供了有价值的研究视角。巨大单层囊泡（Giant Unilamellar Vesicles, GUVs）是研究膜生物物理学的基础性仿生体系1,2。GUVs 已被公认为细胞膜的代表性模型，其结构由单层球形脂质双分子层构成，直径为 10–30 µm，并被包裹悬浮于水溶液中。本文将此类囊泡称为 sGUVs。这些体系采用自下而上的构建方法，将脂质、蛋白质和催化剂等基本细胞组分组装在一起，以模拟生物膜的结构与功能3,4。
尽管简单的sGUV（仅包含内部水相核心）被广泛使用，但已开发出更先进的模型以模拟生物细胞的特定特征。例如，由肌动蛋白支撑的GUV可模拟细胞骨架5,6,7，而高盐环境则用于模拟生理条件。高盐环境虽能更好地模拟生理状态，但在GUV中难以实现，因为传统方法（如电形成法8,9）通常不适合在该条件下合成微米级GUV。较新的方法（如凝胶辅助法）通过使用聚合物或淀粉凝胶在水合过程中促进双层膜膨胀，从而克服了这些限制10,11。类似地，sGUV的形态变化也已被研究12。封闭或开放的纤维结构（如包封的肌动蛋白、微管及其他细胞骨架组分）具有不同的刚性，其内部渗透压应力条件会影响这些因渗透作用而收缩、但初始呈准球形囊泡的形态转变。理论分析揭示了多种形态转变，包括管状、球状、拍子状、樱桃状及液滴状结构，与实验观察结果高度一致12。这些发现对于理解细胞和囊泡内纤维、微管及纳米环的组织方式具有重要意义。其他研究综述了蛋白质包封的方法，并探讨了包封的肌动蛋白、微管及细胞骨架组分如何调控渗透性收缩囊泡的形状12,13。
此外，受真核细胞结构的启发，研究人员开发了基于GUV的复杂模型，旨在构建模拟真核细胞分裂与细胞分裂、繁殖能力、多区室特征、自复制细胞14,15,16,17以及多区室细胞的人工模型。除了在结构上的应用外，GUV也是研究细胞电穿孔的理想模型——该过程指施加的电场因麦克斯韦应力而在脂质膜上诱导形成孔道。GUV的尺寸与生物细胞相当，在电场作用下可表现出电致变形和电穿孔现象。对GUV的此类研究有助于理解膜电容和弯曲刚度等机电特性18，以及电穿孔的机制2,19,20。然而在实际应用中，这些研究最能代表无核细胞，例如红细胞（RBCs）。
为弥合这一差距，我们提出将复合型巨大单层囊泡（cGUVs）作为一种新型的模拟有核真核细胞的生物仿生模型21,22。这些囊泡具有囊泡内套囊泡的结构，其中内层双分子层模拟细胞核膜，外层双分子层代表细胞质膜。此外，我们展示了如何在无需微操作仪或微注射器等复杂仪器的情况下，调控内层、环形区域及外层区域的电导率。这种简化合成cGUVs的方法为推进有核细胞的生物物理研究提供了一个有前景的平台。

<table><tbody><tr><td>胆固醇（Sigma 级，99%）</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>C8667</td><td>用于 sGUV 合成</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Merck Life Science Pvt. Ltd.</td><td>DA2P711602</td><td>用于配制脂质储备液的溶剂</td></tr><tr><td>DMPC</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850345C</td><td>用于 sGUV 合成</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Hayman</td><td>F204325</td><td>用于清洁 ITO 载玻片</td></tr><tr><td>荧光素标记葡聚糖（4 Kda 分子量）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>466994</td><td>用于包封在 cGUV 内囊泡中</td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7021</td><td>用于配制葡萄糖溶液，对悬浮于蔗糖溶液中的 sGUV 进行渗透冲击</td></tr><tr><td>Liss Rhod PE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>810150C-1MG</td><td>用于染色脂质分子</td></tr><tr><td>尼罗红</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72485</td><td>用于染色 cGUV 和 sGUV 膜</td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1936060521</td><td>用于配制盐储备液，以改变 cGUV 腔室的电导率&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td>用作电形成腔室的水合介质的蔗糖溶液</td></tr><tr><td>仪器设备</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>Blue star</td><td></td><td>用于显微镜观察 cGUV 悬液</td></tr><tr><td>cMOS pco.edge 4.2 相机</td><td>Excelitas</td><td>61009524</td><td>用于获取荧光单色&amp;nbsp;图像和微分干涉相差（DIC）图像</td></tr><tr><td>盖玻片（22 × 60 mm）</td><td>Blue star</td><td></td><td>用于覆盖凹面载玻片</td></tr><tr><td>Eppendorf 电融合腔室</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>将 sGUV 悬液置于腔室内进行渗透和显微观察，也可使用其他简易腔室</td></tr><tr><td>函数发生器（双通道）</td><td>Tektronix</td><td>AFG3022C</td><td>用于向电形成&amp;nbsp;腔室施加交流电场</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>本地定制</td><td></td><td>将电形成腔室置于 40?</td></tr><tr><td>ITO 载玻片</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>576352-10PAK</td><td>电形成法中使用的 ITO 载玻片</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse 倒置显微镜</td><td>Nikon</td><td>TE2000-U</td><td>用于观察 sGUV 和 cGUV</td></tr><tr><td>硅胶垫片（3 mm&amp;nbsp; 厚度）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF49463141</td><td>用于电形成腔室中的间隔</td></tr><tr><td>注射器（2 mL）</td><td>Becton Dickinson India Pvt Ltd.</td><td>300844</td><td>用于注入水合介质以及从电形成腔室中收集 sGUV</td></tr><tr><td>蔡司共聚焦显微镜系统</td><td>印度理工学院孟买分校中心设施</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

合成复合型巨大单层囊泡：一种模拟有核细胞的生物仿生模型

Synthesis of Compound Giant Unilamellar Vesicles: A Biomimetic Model of Nucleate Cells

简单的巨大单层囊泡（sGUV）是一种微米尺度的球形囊泡，由脂双层构成，内部包裹着水溶液，并悬浮于另一种水性介质中。作为生物细胞的仿生模型，sGUV 已被广泛用于生物物理研究。然而，sGUV 主要模拟无核细胞，限制了其作为有核细胞模型的应用。我们提出复合型巨大单层囊泡（cGUV）作为更合适的有核细胞仿生模型。cGUV 是一种囊泡中包含囊泡的结构，其外层和内层囊泡的脂双层可分别模拟细胞的细胞膜和细胞核膜。

本研究中，我们描述了一种合成cGUV的简单方法。简言之，通过电形成法，在蔗糖介质中使用DMPC和胆固醇作为脂质成分，并将胆固醇摩尔分数控制在37–43%范围内，制备出sGUV。随后，通过引入高渗葡萄糖溶液对这些sGUV施加渗透冲击，诱导其迅速转变为类体细胞形态。该过程形成一种中间状态，其中外层囊泡与内层囊泡仍通过一个颈部结构相连，最终形成囊泡中囊泡结构，即cGUV。
此外，已知在双分子层中胆固醇含量较高的GUVs表现出降低的离子通透性。该特性可通过调节水合介质的电导率，来调控cGUV环形溶液中的电导率。&#160;通过高渗葡萄糖调节内液，通过调节外液&#160;稀释或添加导电介质，从而在外层、环形层和内层区域获得可控电导率的cGUV，适用于电场研究。我们提出这一高效且简便的复合囊泡合成方法，可作为真核有核细胞的仿生模型，推动其在生物物理研究中的应用。

使用电形成法（如图1所示）合成了sGUVs，并用注射器从腔室中收集。收集后的sGUVs首先在倒置显微镜下观察，并施加渗透冲击以诱导其转变为口形体形态。经过进一步的膜重塑后，该口形体转化为一种称为复合型巨大单层囊泡（cGUV）的囊泡中囊泡结构（图1）。进一步通过共聚焦显微镜对cGUVs进行分析（图2），采用微分干涉差（DIC）和荧光成像技术。通过以1 µm为间隔进行z轴扫描，构建了cGUVs的三维重建图像。三维图像清晰显示，内层囊泡完全与外层囊泡分离，并位于较高的z平面。内层囊泡的这一位置归因于内层囊泡溶液（蔗糖+葡萄糖）的密度低于环形区域溶液（蔗糖）的密度。
在中间状态，当sGUV转变为凹形体（stomatocyte）形状时，外部溶液被包裹并成为内层囊泡内部溶液的一部分。然而，内层和外层囊泡仍通过一个狭窄的连接颈保持连通（图3 和 <strong...

本文介绍了一种制备具有囊泡内嵌囊泡结构的复合型巨大单层囊泡（cGUVs）的方法，可定制其内层、环形间隙及外层区域的电导率。通过电形成法合成简单的GUVs，再经渗透冲击将其转化为口形体和cGUVs，为研究有核细胞的生物物理特性提供了有价值的模型。

一种简单的巨大单层囊泡（sGUV）是一种微米级的球形囊泡，由包裹水溶液的脂质双层构成……

我们对复合型巨大单层囊泡的合成及其电液动力学特性进行了深入研究，旨在将其确立为真核细胞的生物磁性等效模型。该研究有助于理解涉及对生物细胞施加电场的技术，例如细胞电穿孔和细胞电变形。结合荧光显微镜与光学显微镜、纳秒脉冲电处理技术、示波器与电源装置，以及创新的合成方法，推动了该领域的研究进展。合成形态良好的复合GUVs所面临的主要挑战在于方法对温度、脂质类型及所用组分的敏感性。本研究以DMPC与胆固醇体系为例进行了演示，但其普适性仍具挑战性。文献中已有模拟无核细胞的简单GUVs的合成报道。我们合成的复合巨型囊泡可模拟具有阀门防御结构的有核细胞，其内部包裹一个大小约为外层囊泡一半的内囊泡。我们将重点研究微秒和纳秒脉冲对内囊泡的影响，内囊泡在电穿孔背景下是生物细胞细胞核的模拟物。[旁白] 首先，使用洗洁精溶液彻底清洗氧化铟锡（ITO）镀膜载玻片，并用去离子水冲洗，去离子水的电导率为 0.055 微西门子/厘米。然后使用 100% 乙醇溶液再次清洁载玻片，并用去离子水冲洗。将载玻片置于设定为 85 摄氏度的烘箱中干燥。使用钳形表确定每片 ITO 镀膜载玻片的导电面。通过真空将清洁的载玻片固定在旋涂仪载物台上，确保导电面朝上。在一片 ITO 载玻片的导电面上滴加 25 微升脂质溶液一，共四滴。取另一片载玻片，以相同方式在其导电面上滴加 25 微升脂质溶液二。将两片涂有脂质的载玻片置于避光的干燥器中真空干燥，至少两小时。然后将一片涂有脂质一的 ITO 载玻片与一片清洁载玻片平行放置，确保两者的导电面相对，并在两者之间插入一个厚度为三毫米的硅橡胶垫片。用夹具密封装置，形成电形成室。现在使用 2 毫升注射器向腔室内注入 100 毫摩尔/升的蔗糖溶液。将函数发生器的输出电缆连接至 ITO 镀膜载玻片上的函数发生器。将两个电形成室置于温度维持在 38 至 40 摄氏度的培养箱中。使用双通道函数发生器施加峰峰值为 5 伏、频率为 10 赫兹的交流电场，持续四小时。孵育结束后，将电形成室从函数发生器上断开。从培养箱中取出，并使其冷却至室温。使用注射器从每个腔室中收集合成的巨型单层囊泡（GUVs），并分别转移至两个 2 毫升的微量离心管中。在进行渗透冲击前，将离心管在室温（25 至 27 摄氏度）下孵育一小时。将 200 微升悬浮于含 100 毫摩尔/升蔗糖溶液水合介质中的简单巨型单层囊泡（sGUVs）转移至观察室，并加入 125 微升 300 毫摩尔/升葡萄糖溶液以诱导渗透冲击并启动形态转变。将正在经历渗透冲击的 sGUVs 置于显微镜载物台上的观察室内静置一小时。使用配备单色相机的倒置显微镜进行微分干涉差（DIC）和落射荧光显微镜观察。使用 Plan Fluor 超长工作距离物镜（20X，0.45 数值孔径；40X，0.60 数值孔径）观察 sGUVs 的形态转变。进行落射荧光观察时，使用绿色滤光片组：激发光波长为 510 至 560 纳米，二向色镜波长为 575 纳米，阻挡滤光片波长为 590 纳米，用于观察 Niall Red 染色的双分子层。使用配备 Plan Fluor 物镜的微分干涉差和落射荧光显微镜，在观察室内监测 sGUVs 的形态转变。观察随着形态转变的进行，口形囊泡（stomatocytic vesicles）的形成过程。监测较大囊泡先沉降，随后较小囊泡数量随时间逐渐增加的现象。接下来，在诱导渗透冲击前，加入盐溶液以调节 cGUVs 不同区域的电导率。例如，为使外层和内层区域的电导率高于环状区域，向电融合室中转移 200 微升蔗糖溶液。向腔室内加入 20 微升 7.5 毫摩尔/升的盐溶液，并加入 125 微升 300 毫摩尔/升葡萄糖溶液以诱导渗透冲击。让经历渗透冲击的 sGUVs 在腔室内静置三至四小时。确认所形成的 cGUVs 外层和内层区域的电导率高于环状区域。对 cGUVs 进行电致变形时，将导线电极间距设置为 500 微米，并使用函数发生器施加峰峰值为 7.5 伏、频率为 100 千赫兹的交流电势。施加电场后，以每秒 10 帧的速度采集视频，观察外层囊泡的扁球形变形和内层囊泡的长球形变形。然后将 cGUV 混合物加载至凹面载玻片中，并用盖玻片密封以防止移动。使用激光扫描共聚焦显微镜通过 Z 轴扫描（步长为 1 微米）分析 cGUV 的形态。成像时采用 Plan Apochromat 40X，1.3 数值孔径油镜 DIC 物镜。使用红色单通道模式，激发波长为 561 纳米，发射波长范围为 561 至 695 纳米，对经 Niall Red 或 Rhodamine PE 染色的 cGUV 进行成像。使用与显微镜连接的软件修改并提取 .CZI 图像文件。插入比例尺等图形元素，并启用 2D 和 3D 视图。然后进入“处理方法与参数”以调整所需设置。点击“应用”以 JPG 格式导出图像。最后，在 ImageJ 软件中打开该文件。插入比例尺时，依次进入“分析”→“设定比例尺”进行校准，然后选择“分析”→“工具”→“比例尺”以应用比例尺。共聚焦 Z 轴堆叠成像证实，由于内层溶液密度较低，内层囊泡在 Z 平面上与外层囊泡完全分离并抬高。中间口形细胞态显示内层与外层囊泡之间通过狭窄的颈部连接，随后完全分离。渗透冲击六小时后，观察到多种囊泡形态，包括多个内层囊泡、星形结构和管状结构。使用摩尔比为 63:37 的 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酰胆碱（1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine）与胆固醇脂质混合物可高效形成大量 cGUVs。在交流电场作用下，cGUVs 发生变形，外层囊泡呈扁球形，内层囊泡呈长球形。

synthesis-compound-giant-unilamellar-vesicles-biomimetic-model

Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

复合巨型单层囊泡的合成：一种有核细胞的仿生模型

通过微流控喷射技术作用于液滴界面脂双层，可可靠地生成具有可控膜不对称性、跨膜蛋白整合及物质包封能力的囊泡。该技术可用于研究多种需要区室化生物分子的生物系统。...

利用微流控喷射技术生成脂质双层囊泡

展示了两种脱水-再水化方法——电形成法和凝胶辅助溶胀法，将跨膜蛋白KvAP重组到巨大单层囊泡（GUVs）中的过程。在这两种方法中，含有该蛋白的小区单层囊泡融合形成GUVs，随后可通过荧光显微镜和膜片钳电生理技术进行研究。...

将跨膜蛋白——电压门控离子通道KvAP——重组入巨大单层囊泡，用于显微镜与膜片钳研究

包含高度密集的微米级组分的巨大囊泡是有效的细胞模型。水包油乳液离心法是一种制备包封材料的巨大囊泡的简单而强大的工具。...

通过油包水乳液离心法制备包封微球的巨型囊泡

我们介绍一种利用局部钙离子梯度对囊泡进行非接触式微操作的技术。通过在巨型脂质囊泡附近微注射钙离子溶液，可重塑脂质膜，从而形成膜管状突起。...

响应局部钙离子梯度的巨型囊泡膜重塑

我们展示了在巨型囊泡（GVs）内进行细菌的单细胞培养。通过液滴转移法制备含有细菌细胞的巨型囊泡，并将其固定在玻璃基底上的支撑膜上，以便直接观察细菌的生长过程。该方法也可适用于其他类型的细胞。...

在巨型囊泡内对单个细菌细胞进行培养

本实验方案的目的是通过微管吸吮法可靠地测量巨囊泡的膜力学性质。...

通过电形成法制备巨型单层杂化囊泡及利用微管吸吮法测量其力学性质

本文介绍了一种快速制备包封细胞骨架蛋白的巨型单层囊泡的简单方法。该方法适用于在受限环境中从头重建细胞骨架结构以及研究细胞骨架与膜之间的相互作用。...

快速将重建的细胞骨架封装到巨大单层囊泡内

在本文中，我们展示了将F-肌动蛋白细胞骨架包封进巨大单层脂质囊泡（也称为脂质体）的实验技术，以及在脂质体膜内小叶形成模拟细胞皮层的F-肌动蛋白层的方法。...

体外 在巨大单层囊泡内重建肌动蛋白细胞骨架

本初学者指南介绍了一种通过液滴转移法制备巨大单层囊泡（GUVs）的通用实验方案，讨论了其中的关键步骤，并提供了相关见解，以帮助针对不同应用（包括合成生物学和微机器人技术）进行可能的调整。...

使用液滴转移法制备巨型单层囊泡的可靠方法

本文介绍了一种在相分离的巨大囊泡内简单的一锅法重建细胞骨架网络的方法。该方法具有普适性，可推广应用于多种生物大分子的包封或限域。...

体外在相分离的巨大单层囊泡（GUVs）内重建细胞骨架网络

学习复合巨型单层囊泡的合成方法，利用电形成和渗透冲击技术构建囊泡中囊泡结构，模拟有核细胞。该方法结合荧光显微镜与纳秒脉冲电场处理，为研究细胞电穿孔和电变形提供重要的生物物理模型。

合成复合型巨大单层囊泡：一种模拟有核细胞的生物仿生模型

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