复合巨型单层囊泡的合成：一种有核细胞的仿生模型

本文介绍了一种制备具有囊泡中囊泡结构的化合物巨型单层囊泡 （cGUV） 的方法，在内部、环形和外部区域具有定制的导电性。电构造合成简单的 GUV，这些 GUV 通过渗透压休克转化为口细胞和 cGUV，为研究有核细胞的生物物理学提供了有价值的模型。

我们对复合巨型单层囊泡的合成和电流体动力学进行了详细研究，以将它们确定为真核细胞的生物磁等效物。该尝试是了解涉及将电场应用于生物细胞的技术，例如细胞电穿孔和细胞电变形。

采用荧光和光学显微镜、纳秒脉冲电处理、示波器和电源以及创新的合成方法的组合来推进该领域的研究。合成结构良好的化合物 GUV 的挑战在于方法对温度、脂质类型和所用成分的敏感性。在这项工作中，我们证明了 DMPC 和胆固醇系统的这一点，但推广它仍然具有挑战性。文献中已经合成了模拟核细胞的简单 GUV。我们合成复合巨囊泡来模拟具有瓣膜防御结构的有核细胞，包围一个大约是外囊泡一半大小的内部囊泡。

我们将重点研究微秒和纳秒脉冲对内囊泡的影响，内囊泡是电穿孔背景下生物细胞核的模拟物。

[旁白]首先，使用洗洁精溶液彻底清洁氧化铟锡或ITO涂层载玻片，并用电导率为0.055微西门子/厘米的去离子水冲洗。然后使用 100% 乙醇溶液再次清洁载玻片并用去离子水冲洗。在设置为 85 摄氏度的烤箱中干燥载玻片。使用钳形表识别每个 ITO 涂层载玻片的导电侧。使用真空将干净的载玻片固定到旋转编码器载物台上，确保导电侧朝上。将 25 微升脂质溶液（一液滴）四滴涂抹在一个 ITO 载玻片的导电侧。取另一张载玻片，以相同的方式涂抹 25 微升脂质溶液两次。在干燥器中真空干燥两张涂有脂质的载玻片，并在黑暗中储存至少两个小时。然后将脂质涂层的ITO载玻片与干净的载玻片平行排列，确保导电面相对，并在它们之间放置一个三毫米厚的硅橡胶垫片。用夹子密封装置以创建一个电熔室。现在使用两毫升注射器用 100 毫摩尔蔗糖溶液填充腔室。将函数发生器的输出电缆连接到带有函数发生器的 ITO 涂层载玻片。将两个电铸室置于保持在 38 至 40 摄氏度之间的培养箱中。使用双通道函数发生器在 10 赫兹频率下施加 5 伏峰峰值的交流电场 4 小时。孵育后，断开电成室与函数发生器的连接。将它们从培养箱中取出，让它们冷却至室温。使用注射器，从每个腔室中收获合成的巨型单层囊泡，并将它们转移到单独的两毫升微量离心管中。在进行渗透性休克之前，将试管在25至27摄氏度的室温下孵育一小时。将悬浮在含有100毫摩尔蔗糖溶液的水合培养基中的200微升简单巨型单层囊泡或sGUV转移到观察室中，并引入125微升300毫摩尔葡萄糖溶液以诱导渗透冲击并启动形状转变。让现在正在接受渗透性休克的sGUV在放置在显微镜载物台上的观察室内休息一小时。使用配备单色相机的倒置显微镜进行差分干涉对比和落射荧光显微镜。使用 Plan Fluor 超长工作距离 20X x 0.45 和 40X x 0.60 物镜观察 sGUV 中的形状变化。对于落射荧光，对于尼尔红染色双层，使用激发波长为 510 至 560 纳米的绿色滤光片组、575 纳米的二向色镜和 590 纳米的阻挡滤光片。使用微分干涉对比和落射荧光显微镜和 Plan Fluor 物镜监测观察室内的形状变化。观察随着形状转变的进行，口细胞囊泡的形成。监测较大的囊泡如何首先沉降，然后随着时间的推移增加较小的囊泡数量。接下来，在诱导渗透冲击之前加入盐溶液以调整cGUV不同区域的电导率。例如，为了在外部和内部区域产生比环形区域更高的电导率，请将 200 微升蔗糖溶液转移到电融合室中。将 20 微升 7.5 毫摩尔盐溶液加入腔室中，并用 125 微升 300 毫摩尔葡萄糖溶液诱导渗透冲击。让渗透冲击 sGUV 在腔室中静置三到四个小时。确认与环形区域相比，所得cGUV在外部和内部区域具有更高的电导率。 要对 cGUV 进行电变形，请将线电极间隔 500 微米，并使用函数发生器在 100 kHz 时施加 7.5 伏峰峰值的交流电势。施加电场后，以每秒10帧的速度拍摄视频，观察外囊泡的扁变形和内囊泡的扁变形。然后将 cGUV 混合物装入空腔载玻片中，并用盖玻片密封以防止移动。使用激光扫描共聚焦显微镜通过Z轴扫描分析cGUV形态，步长为1微米。使用 Plan Apochromat 40X x 1.3 油 DIC 物镜进行成像。使用具有 561 纳米激发和 561 至 695 纳米发射的红色单通道模式对用尼尔红或罗丹明 PE 染色的 cGUV 进行成像。修改并提取 .使用显微镜链接软件的 CZI 图像文件。插入比例尺等图形，并启用 2D 和 3D 视图。然后转到处理方法和参数以调整所需的设置。然后点击 应用 将图像导出为 JPG 格式。最后，在ImageJ软件中打开文件。要插入比例尺，请转到分析，然后选择要校准的比例，然后选择分析，然后选择工具和比例尺以应用它。共聚焦 Z 堆栈成像证实，由于内部溶液密度较低，内部囊泡与外部囊泡完全分离，并在 Z 平面上升高。中间口母细胞状态在完全分离之前显示出连接内囊泡和外囊泡的窄颈。渗透休克后六小时观察到多种囊泡形式，包括多个内囊泡、星形体和管状结构。使用 1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱和胆固醇的脂质混合物以 63 至 37 摩尔比形成高丰度的 cGUV。在交流电场下，cGUVs表现出变形，外囊泡形成扁圆形，内囊泡形成长方形。