伴纤维化的代谢功能障碍相关脂肪性肝病小鼠模型

在我们的研究中，我们专注于代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD），特别是脂质积聚和纤维化的机制。近期的一些进展包括单细胞和空间转录组学、MASLD动物模型的标准化，以及司美格鲁肽被批准用于治疗MASLD。尽管存在多种MASLD动物模型，但我们发现其中许多模型并不能诱导肝脏纤维化。

为了解决这一问题，我们开发了MASLD的小鼠模型。该小鼠模型通过给食欲亢进的小鼠喂食一种类似于普通美国饮食的饲料，从而诱导出伴有纤维化的MASLD。这种方法产生的MASLD与人类疾病非常相似。

我们的方法将有助于开展关于代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）的病理生理学研究以及新疗法的测试。首先，获取载玻片上的石蜡包埋肝组织切片。进行脱蜡时，将载玻片浸入二甲苯或Citrisolv中5至15分钟。

随后依次在100%、95%和70%乙醇中复水，每次5分钟，再用蒸馏水处理5分钟。然后用 Sirius Red 染色切片并进行脱水。每次从透明液中取出一张载玻片，用纸巾轻轻吸干以去除多余液体。

加入约 50 至 100 微升封片剂至样本区域。盖上盖玻片，并轻轻按压以去除气泡。让载玻片自然风干。

现在，使用4倍至20倍物镜，在明场透射光显微镜下观察已制备的切片。取约500至1000微升肝匀浆液转移至1.5毫升离心管中，加入三氯乙酸，使其终浓度达到12%。短暂涡旋振荡管子以混匀内容物。将管子置于冰水浴中孵育30分钟，然后在4摄氏度条件下以6,000 ×g离心10分钟。

然后用移液器吸除上清液。加入1毫升100%预冷的乙醇洗涤沉淀，并进行超声处理以充分重悬。再次离心后，用移液器吸走上清液。

第三次洗涤后，将离心管敞口放置，使沉淀在空气中干燥10分钟或更长时间（视需要而定）。然后向含有蛋白沉淀的离心管中加入800微升6摩尔/升盐酸，使用超声波破碎仪重悬沉淀，方法如前所述。将悬液转移至带螺口盖的玻璃管或小瓶中，并拧紧盖子密封。

将试管置于110摄氏度的烘箱中孵育约22小时。如有需要，在离心前将玻璃小瓶中的内容物转移至离心管中。将水解后的样品在16,000 g离心10分钟，并吸取含有羟脯氨酸的上清液至1.5毫升离心管中。

进行羟脯氨酸氧化时，向含有50微升样品和标准品的试管中加入450微升氯胺溶液。用涡旋振荡器混匀各试管内容物，在室温下孵育25分钟。然后向每个样品和标准品中加入500微升厄利希试剂。

涡旋混匀后，将样品置于培养箱中，在65摄氏度下孵育20分钟。孵育结束后，让离心管冷却至室温，并观察样品的最终颜色。最后，使用分光光度计在550纳米波长处测定样品和标准品的吸光度。

使用苦味酸天狼星红对肝组织进行胶原染色，在明场照明下观察时，胶原呈红色，背景为浅橙色或黄色。染色不仅显示了对应于纤维化的胶原沉积，还显示了血管壁、肝门区及肝包膜中的胶原。偏振光显微镜下可见在深色背景上呈现出明显双折射的胶原纤维，从而增强了纤维化的可视化效果。

对饲喂高脂高果糖饮食（HFFD）的刺豚鼠黄色小鼠肝脏中胶原阳性面积的定量显示，与饲喂低脂低果糖饮食的野生型对照小鼠相比，其纤维化程度显著升高。饲喂HFFD饮食16周后，刺豚鼠黄色小鼠肝脏羟脯氨酸含量显著高于对照组小鼠，该结果进一步证实了纤维化肝脏中胶原沉积增加。