结膜活检与直接免疫荧光技术用于诊断黏膜类天疱疮

我们正致力于提高结膜活检在黏膜类天疱疮诊断中的应用。黏膜类天疱疮是一种慢性瘢痕性结膜炎，若不及时治疗，可能导致失明。对结膜活检标本进行直接免疫荧光染色，检测患者基底膜区免疫复合物沉积，是诊断黏膜类天疱疮（MMP）的关键方法，但目前全球许多医疗中心尚未常规开展此项检测。本文介绍了一种获取结膜活检标本的技术，并采用预装有最佳切割温度（OCT）包埋介质的 cartridge 进行样本转运和血液样本制备，从而减少了样本处理步骤。

首先，在局部或表面麻醉下，使用手术显微镜计划从疑似天疱疮患者的双眼采集活检样本。需事先获得患者的知情同意，并明确告知可能的副作用，包括出血、瘢痕形成，以及术后可能需要开始使用局部类固醇药物。在采集活检样本前，应准备包埋盒，用生理盐水清洗，并分别用最佳切割温度（OCT）包埋介质填充，每只眼睛使用独立的包埋盒。

现在将开睑器置入选定的眼睛（右眼或左眼）。在使用局部丙帕卡因后，若患者仍有疼痛感，用1毫升结核菌素注射器在结膜下注射0.2毫升2%利多卡因。用镊子将结膜从巩膜上提起后，用Westcott剪刀进行线性切除，切口长约4-5毫米，宽约2-3毫米。

立即将整个活检组织转移至最佳切割温度介质中。使用液氮或干冰对包埋的样本进行速冻，随后在 -80 摄氏度下保存过夜。

使用恒温为 -20 至 -25 摄氏度的冷冻切片机将冷冻组织切成 4–6 微米厚的切片。将切片贴附于带正电荷的多聚赖氨酸涂层显微镜载玻片上，以确保牢固黏附。染色前，先用铝箔包裹载玻片，随后于 -80 摄氏度保存。

将切片在室温下解冻10分钟。然后用100%冷丙酮固定组织10分钟，以保存抗原并尽量减少组织损伤。接着用OBS清洗切片3次，每次5分钟，以去除残留的OCT包埋剂和丙酮。

将稀释后的标记抗体（包括抗 IgG、抗 IgA、抗 IgM 和抗 IgC3）加于载玻片上。阴性对照载玻片不加抗体。随后将载玻片置于湿盒中，于 37 摄氏度孵育 45 至 60 分钟。

然后用 PBS 洗涤载玻片，每次 5 分钟，共洗涤 3 次，以去除未结合的抗体。使用含 DAPI 的封片剂进行复染，以实现细胞核的可视化。最后，将盖玻片覆盖在每张载玻片上，并静置 20 分钟使其充分固化。

使用配备适当滤光片的荧光显微镜观察切片，其中荧光团检测采用488纳米的绿色激发滤光片。在结膜活检组织中，通过PAS染色确认基底膜，其表现为上皮基底部连续的亮粉红色带状结构。直接免疫荧光阳性结果表现为沿基底膜分布的明亮绿色荧光。

直接免疫荧光阳性活检显示免疫球蛋白 IgM、IgA 和 IgG 出现荧光，而阴性活检则无荧光。阳性对照在基底膜处显示强烈的绿色荧光。