微型中风小鼠模型中神经免疫相互作用的分离与流式细胞术评估

我们的研究范围集中在缺血性中风后的免疫细胞功能。我们旨在了解中风病理学中驻留和浸润免疫细胞的规律。目前，流式细胞术广泛用于评估免疫细胞功能和神经炎症中的相互作用。

此外，免疫技术以及单细胞和测序正在推进神经免疫相互作用的研究。我们的实验室将专注于说明星形胶质细胞在神经免疫相互作用中的途径，血管对神经炎症过程的贡献。首先，取一个 50 毫升的注射器，并在其末端连接一根 26 号针头。

用盐水溶液完全填充注射器。将麻醉的小鼠仰卧放置在泡沫板上。伸展前肢和后肢，并使用 26 号针固定它们。

使用锯齿状拇指镊子，抓住腹部皮肤并做一个侧切口以暴露肝脏。沿肋骨两侧切开，露出心脏。现在将 26 号针插入左心室并切断右甲骨文。

按下注射器柱塞，让血液排出。继续灌注，直到从神谕中排出的血液变得清晰。将小鼠斩首并提取大脑后，将其转移到小鼠钢脑基质中，并将其切成连续的两毫米厚的角膜切片。

将 500 微升消化酶混合物引入 12 孔板的每个孔中。使用微型镊子，轻轻地分离梗死组织并将其转移到消化酶混合物中。最后，用眼科剪刀将组织碎片化为尽可能小的碎片，并将板在37摄氏度下孵育20分钟。

使用 AP 1000 移液器，轻轻吸出溶液并分配 10 次，以将组织解离成单个细胞。然后将溶液通过 70 微米细胞过滤器。用含有钙和镁的冰冷HBSS反复冲洗12孔板和细胞过滤器。

现在将收集的细胞悬液在4摄氏度下以500G离心5分钟。小心地丢弃上清液，不要干扰沉淀。将沉淀重悬于一毫升PBS中。

在重复离心过程后，将沉淀再次重悬于 150 微升 PBS 中，并将悬浮液转移到 96 孔圆形底板中。在4摄氏度下再次以500G离心5分钟。离心后，牢牢抓住96孔板并迅速倒置以丢弃上清液。

接下来，在PBS中以1比100的比例稀释细胞活力荧光芯片，并将沉淀重悬于150微升稀释的染料溶液中。在室温下孵育 10 分钟，同时保护板避光。在四摄氏度下离心五分钟后，弃去上清液。

在磁激活细胞分选或最大缓冲液中稀释细胞表面抗体混合物，在不清洗细胞的情况下，将抗体混合物添加到孔中。在4摄氏度下孵育15至20分钟，然后再离心5分钟。离心板并弃去上清液后，将沉淀重悬于150微升最大缓冲液中。

将悬浮液转移到 1.5 毫升离心管或 5 毫升圆底聚苯乙烯试管中。使用手动方法或在线面板设计工具，根据仪器配置设计多色流式细胞术面板。在面板中加入细胞活力染料，以从数据中排除非活细胞和碎片。

调整前向散射和侧向散射检测器设置，以确保目标细胞正确显示并可以正确门控。微调 FSC 和 SSC 参数以消除碎屑和外来噪音。在显示 FSC 面积与高度的点图上，将双峰与单胞区分开来。

使用活力染料的负信号来分离活细胞。将来自未染色细胞的自发荧光对照与染色细胞阳性对照进行比较，以确认染色细胞针对每个参数进行了正确缩放。通过分析多色细胞样本和检查两个彩色点图来微调补偿。

向上或向下调整补偿设置，直到细胞群垂直或水平对齐。利用 CD45 和 CD11B 信号根据淋巴细胞、小胶质细胞、髓系细胞和星形胶质细胞的特定表达模式来区分淋巴细胞、小胶质细胞、髓系细胞和星形胶质细胞。使用假脑组织作为自发荧光对照，作为识别淋巴细胞的参考。

如果分析特定靶标，请使用中风后脑组织的 FMO 对照。收集控制数据并保存。同样，收集样本数据并保存。

选择目标细胞群并将其分类到5毫升圆底聚苯乙烯试管或15毫升锥形离心管中。加入 500 微升 PBS 并冲洗收集管以保持细胞活力并帮助沉淀形成。在缺血性中风后第 2 天和第 7 天对 CCR7 阳性和 CD11c 阳性小胶质细胞进行定量。

与假对照相比，小胶质细胞中CCR7的表达在第2天急剧上升，在第7天保持升高。CD11c 阳性小胶质细胞遵循类似的趋势，在第 2 天达到峰值，并在第 7 天保持高于假小胶质细胞。点图显示第 2 天和第 7 天的密集 CCR7 和 CD11c 信号。

与假对照中的稀疏信号形成对比。门控策略使用 CD11B 和 CD45 表达分离小胶质细胞和淋巴细胞。其他标记物定义了活细胞、星形胶质细胞和淋巴细胞亚群。