探究戈丹提白夏在哺乳动物细胞中引发吞噬作用的连续细胞事件

吞噬作用是指吞噬细胞摄取并降解外来颗粒的过程，对免疫防御至关重要。目前亟需改进更为便捷的方法，以高效监测和评估这一复杂的细胞过程。

实时捕捉降解事件并避免光漂白带来的假象，仍是准确研究吞噬作用及细胞内转运过程中的关键挑战。与荧光标记或合成颗粒不同，本方案采用戈丹提·婆萨玛（Godanti Bhasma）这一无标记颗粒，无需光漂白、优化或复杂制备步骤，即可直接可视化观察吞噬作用的各个阶段。这些发现提供了一个可重复的模型，用于解析吞噬机制，为研究囊泡动力学、病原体功能障碍以及免疫和溶酶体相关疾病的潜在治疗干预提供了新工具。

我们的目标是探索吞噬体成熟过程中的分子调控机制，研究疾病模型中的吞噬功能障碍，并筛选能够调节囊泡动力学和细胞内运输的潜在药物。首先，精确称取100毫克戈丹蒂巴什玛（Godanti Bhasma）或GB粉末。将该粉末悬浮于10毫升添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。

充分涡旋振荡悬浮液以混匀内容物，静置1分钟，使较大的颗粒沉降至底部。使用移液器将上层5 mL悬浮液转移至无菌离心管中。将转移的5 mL GB悬浮液标记为储备液，用于后续细胞培养工作。

在将悬浮液加入细胞前，再次充分涡旋振荡，以确保颗粒均匀分散。将3×10⁴个3T3-L1细胞接种至含有2 mL DMEM的35 mm培养皿中。将培养皿置于37°C、5% CO₂的培养箱中孵育，直至细胞达到70%融合度。

然后将300微升GB储存悬浮液充分混入2毫升预热的新鲜培养基中。将含有细胞和GB悬浮液的培养皿放入成像显微镜的载台培养箱内。在显微镜上选择10倍物镜。

使用“亮场”按钮打开亮场照明。然后启动 DIGI ImagePlus 软件并选择相应的相机。单击“捕获”按钮，选择延时成像选项。

将时间间隔设置为五分钟，点击“完成”按钮开始记录。在显微镜载物台二氧化碳培养箱内，每隔五分钟连续采集明场图像，持续16至24小时。使用ImageJ软件将所有采集的图像合成为延时视频。

这可以识别吞噬作用的各个阶段，从颗粒的内化到其完全降解。在96孔板中细胞培养24小时后，充分混匀GB颗粒储备悬液，每孔加入30 µL该悬液。

使用不含GB颗粒的孔作为阴性对照。将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳环境中孵育24小时，以诱导空泡形成。配制中性红溶液时，将中性红溶解于无血清DMEM中，制成0.5毫克/毫升的溶液。

通过0.2微米滤器过滤溶液。成像前，从96孔板中移除培养基。每孔加入60 µL滤液染料后，将板在37 °C孵育15分钟。

用 PBS 洗涤孔板三次，以去除多余的染料。随后进行显微成像。使用 20x 物镜在显微镜下观察染色后的液泡，评估液泡的大小、形态和数量。

配制巴佛洛霉素 A1 储存液时，将 100 微克化合物溶解于 50 微升二甲基亚砜中，然后加入 950 微升 DMEM 稀释。工作液的配制方法为：取 1 微升储存液加入 1.6 毫升 DMEM 中，使其终浓度为 0.1 纳摩尔。

充分混匀工作液，取100微升加入96孔板中含细胞的各孔。然后，向每孔细胞中加入30微升GB颗粒悬浮液，以研究对空泡和吞噬体形成的抑制作用。为抑制吞噬体酸化，向先前经GB处理并已形成空泡的各孔中加入100微升巴佛洛霉素A1（bafilomycin A1）工作液。将所有孔置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育24小时。

向每个孔中加入 60 µL 中性红染料。在 37 °C 下孵育 15 分钟，用 PBS 洗涤孔板三次以去除多余的染料，然后在显微镜下分析空泡的形成和酸化情况。用 50 µL GB 悬浮液处理培养的细胞，并在标准实验条件下，于 37 °C、5% CO₂ 环境中孵育过夜。

处理后，向细胞中加入浓度为1毫克/毫升的吖啶橙溶液，在37摄氏度孵育15分钟，以染色液泡和酸性囊泡样细胞器。接着，用无菌PBS洗涤细胞3次，以去除未结合的染料并降低背景荧光。最后，立即使用配备20倍物镜和450至492纳米蓝色激发滤光片的荧光显微镜分析染色后的载玻片。

通过评估细胞形态和吖啶橙摄取情况来理解液泡动态。经 GB 处理 30 分钟后，观察到颗粒附着在三个 3T3-L1 细胞的表面。颗粒周围出现杯状的膜延伸结构，表明颗粒吞噬过程的启动。

处理后12小时，在细胞内观察到含有GB颗粒的大型膜结合空泡。延时成像显示，在单个活细胞中，GB颗粒逐步内吞并形成空泡的过程持续了4.75小时。空泡内的GB颗粒随时间推移逐渐降解，细胞随之恢复正常的形态，表现为空泡的更新循环。

流式细胞术分析显示，内化的戈丹提矿物药颗粒在24小时内完全降解，培养基中无任何颗粒残留。中性红染色显示，与仅呈现微弱溶酶体染色的对照组相比，三种细胞系中经戈丹提矿物药处理的细胞其空泡酸化程度显著升高。吖啶橙染色显示，戈丹提矿物药处理的3T3-L1细胞空泡中出现橙红色荧光，表明发生了酸化，而未经处理的细胞仅显示绿色荧光。

与巴佛洛霉素共同处理抑制了3T3-L1和HeLa细胞中的空泡形成，表现为与各自对照组相比空泡消失。经巴佛洛霉素处理后，中性红摄取被有效阻断，从而破坏了细胞内空泡的酸化和成熟过程。