一种用于生成河岸带与水生甲虫分子操作分类单元（MOTUs）的整合分析流程

为了加快在物种极为丰富的热带地区发现新物种的进程，本实验方案旨在通过结合计算机分析方法，对水生及河岸带甲虫建立物种聚类假说。

这一利用COI DNA序列的分析流程，为仅基于漂流甲虫形态学数据所建立的Anisostena属物种的物种界定提供了更充分的证据。

本方案旨在解决分类学障碍问题，即通过基于形态学的分类法进行物种发现——尽管该方法被认为是昆虫系统学的金标准，但对于研究尚不充分、物种极其丰富且形态极为隐蔽的水生甲虫而言，往往耗时且令人困惑。

[Emmanuel] 该流程会生成称为MOTUs的分子辅助假设，无论该序列是否与参考序列中的已知物种相对应，也无论这些物种是否为尚未发现或尚未描述的物种。

通过这种方法，无需一次性解剖和比较数百个甲虫的生殖结构，该流程即可提供初步的聚类结果，进而可对样本进行更细致的同种性检验。

[旁白] 首先，启动 MEGA X 并加载用于比对的 DNA 序列。通过选择一行，然后点击“编辑”或“构建比对”，并选择“创建新比对”来打开比对界面。点击“确定”确认选择，并选择 DNA 作为数据类型。将鼠标悬停在“编辑”选项卡上，点击“从文件插入序列”。导航至相应目录，选择要加载到 MEGA 中的序列文件。接着，点击“比对”，然后选择“使用 ClustalW 比对”以默认设置进行序列比对，点击“确定”继续。对于序列的手动编辑，通过点击插入的碱基或位置并按下键盘上的删除键来删除任何插入。接下来，通过点击代表缺失碱基的短横线，将其删除并输入正确的碱基来修正缺失。然后，找到所有序列均含有字符的最早位置。点击该位置左侧行标题中的空白框，并拖动以选中所有多余的起始位置。按下删除键以裁剪掉这些起始部分。接着，找到最后一个比对位置，点击该点右侧的框，再次按下删除键以裁剪末端。现在，选中所有序列，点击“翻译的蛋白质序列”标签。当提示时，确认遗传密码为无脊椎动物线粒体遗传密码。如果遗传密码不同，点击“否”，此时将出现一个菜单，允许用户勾选“无脊椎动物线粒体遗传密码”选项。如果比对中出现由星号标记的终止密码子且贯穿整列，则点击“DNA 序列”，并删除所有序列的第一个位置。再次点击“DNA 序列”，然后以 .mos 或 .mosx 格式保存比对结果。要使用 TaxonDNA 模块开始分类单元划分，请打开 TaxonDNA 软件。点击“导入”，然后选择 FASTA 格式并上传以 FASTA 格式保存的比对文件。现在，点击“模块”，然后选择“聚类”。将阈值设为 3%，并勾选“为每个聚类生成单独信息”复选框。点击“立即生成聚类”以开始聚类，并通过截图保存结果。对于使用 Kimura 2-参数法进行的分类单元划分，请打开 MEGA，点击“文件”，然后选择“打开文件或会话”。点击“距离”，选择“计算成对距离”，并确认用于划分的 .meg 文件。将鼠标悬停在“模型或方法”旁边的框上，点击箭头展开下拉菜单，选择 Kimura 2-参数模型，然后点击“确定”运行程序。打开数据输出窗口查看结果。点击“文件”，然后选择“导出并打印距离”以保存结果。打开“通过自动划分组装物种”或 ASAP 网络服务器。点击标有“选择文件”的橙色框，上传 .fasta 文件。向下滚动并点击“开始”。要下载聚类结果，请点击 ASAP 评分最低且 P 值排名最高的那一行的“列表”。接下来，为了开始系统发育树构建，请打开 MEGA 并点击“数据”，然后选择“打开文件或会话”以加载 .meg 文件。点击“模型”，然后选择“寻找最佳 DNA 和蛋白质模型”或“ml”以确定最合适的替换模型。在分析偏好菜单中点击“确定”。现在，为了生成系统发育树，请点击“系统发育”，然后选择“构建并检验最大似然树”。通过点击“模型或方法”旁边的框并从下拉菜单中选择适当的模型，使用最合适的替换模型。在“系统发育检验”部分，点击“系统发育检验”旁边的框，然后从下拉菜单中选择“自举法”。点击“自举重复次数”旁边的框，输入 1000，然后点击“确定”运行分析。当包含结果树的窗口打开后，将会话保存为 .mts 或 .mtsx 文件。同时将输出保存为 .newick 文件，并将树导出为 .png 图像。对于基于 PTP 的分类单元划分，请访问 PTP 网络服务器。点击“选择文件”并上传 Newick 格式的树文件。在“我的树是”选项下选择“有根树”。在“外群分类单元名称”框中，通过输入外群末端分类单元的名称来指定外群。接下来，在“最大似然解”部分，点击“下载划分结果”以保存 PTP ML 输出结果。同样地，在“最高贝叶斯支持解”部分，点击“下载划分结果”以保存 PTP BI 输出结果。对于基于 MPTP 的分类单元划分，请访问 MPTP 网络服务器。通过将 Newick 文件拖放到灰色方块上或点击该方块来上传文件。数据加载完成后，点击“进入外群选择”。在外群指定页面，通过点击外群样本分类单元标签旁的复选框来选择外群。然后点击“模型选择”，选择 MPTP，再点击“可视化选项”。在可视化选项页面，接受默认设置，点击“提交”。右键点击“可下载文件”下的文件，选择“另存为”以保存结果。现在，为了生成分子操作分类单元（MOTU），使用图像编辑程序或 PowerPoint 打开系统发育树。创建条形图以表示每种分子物种划分方法的结果。如果所有方法对某一分子聚类得出相同结果，则根据共识将该聚类定义为一个 MOTU。该图展示了基于 COI 3'端序列和六种划分方法的 boranus 甲虫的最大似然基因树及分子聚类结果。所有方法一致识别出四个 MOTU：Byrrhinus negrosensis、Byrrhinus villarini、Byrrhinus A 和 Byrrhinus B，各方法间的聚类结果完全一致。尽管来自相同地点，Byrrhinus negrosensis 与 Byrrhinus villarini 仍被明确区分开来。来自四个省份的序列被归入 Byrrhinus A，未表现出明显的地理结构。该图显示 Anisostena 甲虫被划分为四个 MOTU，包括 Anisostena angatbuhay、Anisostena auxilium、Anisostena A 和 Anisostena B，所有方法结果完全一致。Anisostena auxilium 在地理分布上与 Anisostena A 和 Anisostena B 存在重叠，表明仅凭地理因素无法解释其分子分化。