Name: 体内研究 未麻醉 果蝇 成年果蝇神经活动的成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 了解果蝇无麻醉活体成像技术，用于研究记忆遗忘的神经机制与认知灵活性。该方法通过钙成像记录蘑菇体输出神经元的活动，揭示多巴胺能神经元在主动遗忘中的关键作用。

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本工作获得了美国普通医学科学研究所1R01GM147917-01A1项目和脑与行为研究基金会30442项目的支持。

本研究中所用设备与试剂的详细信息见材料表。
1. 转基因果蝇，Drosophila melanogaster
<ol>
	<li>将携带所需 Gal4 构建体的雌性处女蝇与携带相应 UAS 构建体的雄性果蝇（均在 25 °C、60% 相对湿度、12 小时光照/12 小时黑暗循环条件下培养）进行杂交，以获得特定目标神经元表达所需遗传编码活性报告基因的果蝇。</li>
	<li>将上述杂交后代培养至羽化后 2–5 天龄期。由于成像室为定制，可适配两种性别，因此雄性和雌性果蝇均可使用。</li>
</ol>
2. 制作一个吸液器（5分钟工作流程）
<ol>
	<li>使用剃刀将6 mm硅胶管切成约8英寸长。取一个p200移液器吸头，用剃刀切去约一半，作为吹嘴（图1A）。将切好的吸头插入硅胶管中。将一个p1000移液器吸头截取适当长度，使果蝇能够通过。</li>
	<li>取一小块棉花覆盖在硅胶管的一端，以防止果蝇被吸入实验者口中。将截短的p1000吸头套在覆有棉花的硅胶管上。</li>
	<li>用一个新的p200移液器吸头覆盖在p1000吸头的末端。为确定p200吸头应截取的合适长度，首先取下p200吸头，将一只果蝇吸入p1000吸头中，然后重新装上p200吸头。轻轻吹气并轻敲，使果蝇尽可能深入地进入p200吸头内。
	<ol>
		<li>当果蝇无法继续前进时，使用解剖显微镜观察，用剃刀标记果蝇头部末端与胸部起始的位置。将果蝇重新吸回p1000吸头中，并在标记处将p200吸头切断。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 组装金属管式口器吸虫器（5 - 10 分钟操作流程）
<ol>
	<li>使用Dremel工具和金刚石锯片将22X规格的金属皮下注射管切割至所需尺寸（约10 cm）。用Dremel 420切割片打磨金属管末端，以形成光滑且整齐的开口。该开口将用于容纳果蝇的喙。</li>
	<li>将金属管缠绕在15 mL离心管上，以获得所需的弯曲形状（图1A）。弯曲部分应呈钩状，使果蝇身体与腔室保持直线对齐。</li>
	<li>使用Dremel工具截取一段约7 cm长的12TW规格金属皮下注射管（该管应能插入2 µL移液器吸头中）。取一个2 µL移液器吸头，用剃刀片切去其末端，使其适配22X规格金属管。将较粗的金属管插入2 µL移液器吸头的另一端。</li>
	<li>取少量环氧树脂胶的树脂与固化剂混合均匀。在细金属管与移液器吸头连接处，以及粗金属管与移液器吸头连接处涂抹该混合物。待胶粘剂在室温下完全固化过夜后，再将组装件连接至显微操作仪上的固定装置。根据需要调整角度。</li>
</ol>
4. 在显微镜下进行学习与记忆实验的电击与气味递送移液管构建（10分钟工作流程）
<ol>
	<li>使用Dremel金刚石工具，在1 mL玻璃移液管的3 mL刻度处进行切割。裁剪一块尺寸为24.5 mm × 8 mm、厚度为1/8英寸的矩形丙烯酸板。 
	注意：也可通过3D打印方式制作该部件，以更好地适配电击网格（相应的stl和obj文件见补充文件1和补充文件2）。</li>
	<li>将铜制电击网格裁剪至可贴合上一步骤中矩形丙烯酸板的大小。在铜网格两端对角位置焊接两根导线。将铜网格嵌入矩形丙烯酸板中，并将其弯曲成形，使果蝇的腹部和足部能够贴合于电击网格上（图1I）。</li>
	<li>使用一段电工胶带将铜网格固定在矩形塑料片上。使用热熔胶枪将玻璃移液管牢固地粘接到电击网格上，确保其位置平直且居中。使用数字万用表检测铜网格是否正常工作，以确保能有效向果蝇足部传递电刺激。</li>
</ol>
5. 组装用于胶体熔化的铂电阻（肉豆蔻酸）（20分钟工作流程）
<ol>
	<li>使用剥线钳将200 mm的导线剪至所需长度，并剥去两根导线的一端绝缘层。再剪取约60 mm的铂丝（此长度足以形成用于熔化胶水的环状结构）。</li>
	<li>使用电烙铁将铂丝的一端焊接到电线的一端。将热缩管套入电线，然后使用本生灯加热使其收缩，覆盖住焊接部位。</li>
	<li>剪取两段内径为2.55 mm的橡胶管，每段长20 mm，并将它们套入铂丝上（保持铂丝平直以方便操作）。使用电烙铁将铂丝的另一端焊接到另一根电线上，并用新的热缩管覆盖该焊接点。</li>
	<li>取一支BD tb 1 mL注射器，拔出活塞，将前述步骤中的导线从注射器筒身中穿过，使铂丝从注射器筒的末端伸出。确保没有裸露的导线，且小段橡胶管应包裹住铂丝，仅留最末端裸露。</li>
	<li>使用剥线钳剥去两根电线另一端少量的绝缘层。使用电烙铁将每根导线分别焊接到香蕉插头上，确保连接牢固。</li>
	<li>使用环氧树脂胶将注射器筒的顶部和底部与导线固定在一起，以避免导线在注射器内部受到拉力，从而延长电阻器的使用寿命。让胶水过夜固化。</li>
	<li>将制作完成的电阻器连接至直流电源。</li>
</ol>
6. 记录室的构建 - （2天工作流程）
<ol>
	<li>随后 补充文件3，使用激光切割一片黑色垫片（厚度为0.0125英寸）。可调整腔室中央开口的尺寸以适应果蝇的大小（文件中提供的尺寸通常适用于雌性和雄性果蝇）。</li>
	<li>取一块玻璃载玻片作为腔室的基底。将树脂与环氧胶混合。取黑色亚克力腔室，使用环氧胶将3 mm × 2 mm的钕磁铁粘附在四个角上。建议每次粘接一个磁铁，并用回形针夹住固定，直至胶水完全固化。</li>
	<li>在之前粘贴于腔室上的每块磁铁上各放置两块新磁铁。使用环氧树脂将最后连接的磁铁粘附到载玻片上，并用回形针固定，直至固化。 
	注意：胶水固化后，腔室即已完成，可根据实验需要添加更多磁铁以调节腔室高度。 补充文件4，补充文件5 和 补充文件 6 显示组装好的记录室。</li>
</ol>
7.&#160;在体 无麻醉解剖操作流程——（5至7分钟工作流程）
<ol>
	<li>从移液器上取下 p200 吸头。将吸液器插入小瓶中，吸入一只果蝇至 p1000 吸头内。将 p200 吸头重新装回吸液器上。轻轻吹气并轻弹吸液器，使果蝇头部朝前固定在 p200 吸头顶部。</li>
	<li>将解剖腔室放置到操纵器支架上。将真空泵连接至果蝇固定管路，并根据需要调节流量（约500 mL/min）。使用快速接头可方便、快速地连接和断开真空图1A).</li>
	<li>将真空金属管移动至显微镜视野中央。确认腔室位置正确，以便在准备粘贴果蝇时能直接置于金属管上方。轻柔地将果蝇的喙吸入真空固定装置中图1A).</li>
	<li>当果蝇处于正确位置后，移动操纵器，使果蝇头部与腔室开口对齐。</li>
	<li>打开直流电源。电流应设置在0.40–0.50安培之间。电流过高可能导致肉豆蔻酸熔化至黏度过低的程度，增加胶水扩散至果蝇头部的风险。</li>
	<li>使用铂电阻，用熔化的肉豆蔻酸将果蝇的眼部和胸部侧面粘附到样品室中图1B）。为防止胶水沾到头部的角质层，应尽量少用胶水，尤其是在粘贴眼睛两侧时。</li>
	<li>眼睛和胸部固定后，断开真空管连接，使用操纵器将记录室从真空管上取下。将记录室倒置，从下方用铂电阻将喙固定图1C从底部粘住果蝇的眼睛是可选步骤，有助于在解剖过程中固定果蝇位置，但并非必需。</li>
	<li>所有部件粘合完毕后，关闭直流电源，将腔室 upright 放置，并将其固定到玻璃侧基座上。用剪刀剪下一小段胶带，分别贴在果蝇头部的正前方和正后方图1D).</li>
	<li>将腔室旋转至头部朝向实验者呈90度。使用解剖针沿眼睛两侧做垂直切口（图1E）。将培养皿转动，使其水平放置。使用解剖针，在角质层上横向切割（图1E). 
	注意：确保表皮 &#34;窗&#34; 使用解剖针可将刚刚制备的组织轻轻提起。若组织无阻力地被提起，则将解剖针放回其盖子上。步骤13和14中不使用生理盐水，以避免光线折射，从而防止切割过程中视野受阻。</li>
	<li>向果蝇头部顶端加入 100 µL 生理盐水（图1F）。使用尖头镊子小心地移除窗口（图1G）。使用尖头镊子，仔细去除残留的脂肪或气管。此时大脑已准备好进行成像（图1H-1J).</li>
</ol>
通过厌恶性嗅觉条件化可视化学习诱导的可塑性（20分钟工作流程）
<ol>
	<li>使用配备激光器和水浸物镜的共聚焦显微镜，将制备好的果蝇放置在显微镜载物台上。可选地，使用带有微距镜头的相机对果蝇进行对焦，确保果蝇健康且处于活动状态。</li>
	<li>使用显微操作器调整电击网格/气味移液管的位置，使果蝇位于电击网格上。 
	注意：电击网格应仅轻微接触果蝇的腿部并略微接触腹部，果蝇仍应能够自由移动（当果蝇收缩时，其腿部和腹部应能脱离网格）。气味递送移液管应朝向果蝇的触角。</li>
	<li>使用粗调Z轴调节旋钮，沿脑组织的Z轴方向扫描，定位目标脑区。将帧尺寸调整为512 × 512像素。扫描频率应调整至所需速度，最低不得低于2 Hz。最后，设定记录时长。</li>
	<li>使用定制或商用的气味递送系统开始记录目标神经元，并同时启动&#34;训练前&#34;气味递送（图2C）。设定记录时长为2分钟。训练前的气味刺激包括：首先记录对持续5秒的第一种气味脉冲（CS-）的反应，随后记录对持续5秒的第二种气味脉冲（CS+）的反应，两次刺激之间间隔30秒。</li>
	<li>在采集完训练前反应后，等待5分钟再启动气味递送系统中的训练程序。在此示例中，训练阶段仅呈现CS+气味。CS+气味在触发气味递送系统后30秒开始，持续1分钟。电击刺激器被设定为在呈现气味的同时同步施加12次、90 V的电击。</li>
	<li>训练结束后，等待5分钟或15分钟，再采集训练后的反应。以与第6步中记录训练前反应相同的方式记录训练后反应。将所有文件保存为适当的格式，用于后续图像分析。</li>
</ol>
9. 图像分析
<ol>
	<li>为分析记录结果，在神经元区域周围绘制一个兴趣区（ROI）。应尽可能精确地绘制，以减少背景荧光的影响。</li>
	<li>使用测量工具提取记录中每一帧在 ROI 内的平均荧光强度数据。将此数据导出为 CSV 文件。</li>
	<li>在 MATLAB 或任何数据分析程序中打开数据，计算每条气味轨迹的 ΔF/Fo 值。整合数据以获得每只果蝇记录的平均 ΔF/Fo 值，并绘制训练前后平均气味响应轨迹图（图 2E、F）。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

理解学习与记忆背后的神经环路是神经科学领域的一个核心目标。Drosophila 所具备的遗传工具包，结合其行为学检测的简便性与多功能性，使其成为研究这些过程的理想模式生物。多个实验室已发表的研究描述了在不使用麻醉剂的情况下准备果蝇进行功能成像的不同方案44,45。然而，这些方案差异较大，且通常依赖高度专业化的定制工具，而关于如何构建或使用这些工具的指导十分有限。本方案介绍了一种在果蝇中进行in vivo功能成像的方法，可避免全身麻醉带来的干扰效应。此外，该方法能够在同一只果蝇中记录实时神经元活动，从而实现对刺激前后神经反应的直接比较。
在完成本方案时，关键步骤包括确保果蝇的喙被正确插入真空管中。此步骤可确保后续粘胶位置准确，并保证果蝇头部处于合适角度，以便观察目标神经元。胶水用量应尽可能少，以维持果蝇的健康状态；使用能固定果蝇所需的最小胶量为最佳。本方案也可根据特定需求进行一些修改，例如仅粘贴复眼两侧，使果蝇整个身体保持自由。类似地，可在记录室顶部连接灌流室，以实现任氏液灌流或药物递送。最后，可如先前报道所述，在果蝇下方放置一个可旋转的浮动跑步机，用于分析运动方向性46,47。
该方案确实存在一些局限性，包括在进行显微手术以制备活体成像果蝇时，果蝇所承受的应激。操作体型微小的果蝇、精确地使用少量胶水，以及在不损伤任何脑组织或身体结构的前提下小心打开头壳，均需要较高的专业技术，而这种技能只能通过细致的练习和反复操作才能获得。尽管该方法在细胞水平上研究认知过程方面具有显著优势， 体内 成像技术与电生理记录相比仍存在一些局限性。此外，尽管本方案在成像前避免使用麻醉剂，果蝇仍被限制在物理腔室内，这可能始终会影响细胞反应。然而，本方法为维持果蝇健康状态以实现最佳实验效果提供了最接近理想的途径 体内 成像。与现有使用麻醉并固定果蝇的方法相比，本方法旨在尽可能保持果蝇自由活动，同时能够对运动最小的细胞进行成像。

基因编码活性报告分子的最新进展通过提供神经元活动的实时、高度特异性洞察，彻底改变了神经科学领域。这类报告分子（如钙离子或电压传感器1,2,3,4,5,6,7,8,9）使研究人员能够以前所未有的时间精度和空间分辨率追踪神经元内部的电和化学信号。通过实现对特定单个神经元乃至跨不同脑区神经网络的监测，这些工具加深了我们对神经元放电模式如何与学习、记忆或决策等认知过程相关联的理解10,11,12,13,14。
为了利用这些基因编码的指示剂，研究人员开发了先进的方法来制备其模式生物 体内 成像。关于神经元可塑性的首篇报道由 体内 功能成像，常被称为一种 &#34;记忆痕迹&#34;在蜜蜂经过趋性嗅觉条件反射后，于其触角叶中发现了该现象15这一发现激发了在遗传上具有高度可塑性的模式生物中的相关研究， 黑腹果蝇 从而推动了创新性的发展 体内 成像技术10,16,17,18.
果蝇 因其强大的嗅觉记忆形成能力，是研究学习与记忆的极佳模型 通过 经典条件反射，其中一种气味（条件刺激-CS）与一种厌恶或奖励性刺激（非条件刺激-US）相关联19,20,21,22在 果蝇， 气味在蘑菇体（MB）中呈稀疏表征23，一个对关联记忆至关重要的脑区，每半球约包含2,000个肯尼恩细胞神经元（KCs）24嗅觉信息从萼部传递到蘑菇体叶 通过 KC轴突聚集形成蘑菇体叶。在嗅觉条件化过程中，非条件刺激（US），如电击或糖奖励，通过不同的多巴胺能神经元（DANs）传递至蘑菇体叶：PPL1神经元传递厌恶性刺激，PAM神经元传递奖赏性刺激。25,26,27,28,29,30记忆的获得被认为涉及条件刺激（CS）和非条件刺激（US）通路的同时激活，从而协同性地增加环磷酸腺苷（cAMP）水平，后者编码了记忆信息31,32该过程在KC→MBON突触处诱导可塑性，改变其突触权重11,12,13,33,34,35,36,37DAN介导的可塑性最终会驱动蘑菇体输出神经元（MBONs），从而引发对已学习气味的趋近或回避行为。34目前的模型认为，信息从肯扬细胞（KCs）流向蘑菇体输出神经元（MBONs），这一过程将气味信息的表征从肯扬细胞中对气味身份的编码，转变为蘑菇体输出神经元中更为抽象的信息，例如基于先前经验所形成的气味效价。34,38与KC不同，MBON对气味的响应具有广泛的调谐性；任何一种特定气味都会引起大多数MBON的响应39MBON的气味调谐受突触可塑性调节，并在不同个体果蝇之间表现出显著差异，表明MBON会根据经验改变其对气味的反应。共有34个MBON，其中大部分MBON网络似乎分为两类相互拮抗的神经元，分别驱动趋近或回避行为。34因此，使用 在体内 利用成像技术通过记录不同MBON中的活动来研究记忆提取已被广泛使用。
早期方法用于 体内 功能成像包括进行手术，从头部囊壳顶部移除一部分角质层，然后用一小片塑料薄膜覆盖该区域18. 虽然这标志着 体内 成像技术在 果蝇，自那时以来，在果蝇制备技术以及显微镜下刺激递送方法方面已取得显著进展，可用于研究学习与记忆等过程。然而，即使在今天，大多数用于果蝇制备的技术仍存在 体内 成像过程需要对果蝇进行麻醉。这种做法存在挑战，因为已有大量证据——以及一个完整的研究领域——表明麻醉会影响记忆以及其他认知和生理过程。例如，一项研究探讨了实验室中常用的几种麻醉剂（二氧化碳、异氟烷、七氟烷和冷休克）的影响。研究发现，麻醉暴露时间越长，果蝇的恢复时间越长，运动活动发生改变，繁殖力降低，并可能影响其水分和脂质储存。40此外，有报道称，训练后立即施加低温休克麻醉可完全破坏短期记忆21从这项初步研究可知，在 果蝇存在一种未巩固的记忆（对麻醉敏感的记忆），其在6-8小时内逐渐消退；还存在一种已巩固的记忆（对麻醉抵抗的记忆），该记忆在学习后逐步形成，可持续约24小时41因此，麻醉会影响认知处理和神经元活动，最终使记忆得以正常表达。
麻醉对记忆的影响并不仅限于 果蝇 大量人类及其他哺乳动物的研究已证实了类似发现。例如，一项在大学医院开展的横断面研究发现，患者在全身麻醉后24小时的短期记忆显著下降42另一项在小鼠中开展的研究发现，全身麻醉显著降低了海马CA1区的神经元放电动态，使细胞集群去相关，并改变了树突棘的动态。海马CA1区是哺乳动物学习与记忆功能所涉及的重要脑区。43为克服这些困难，本研究旨在提供一种新型实验方案，该方案在果蝇制备过程中完全避免使用麻醉剂 体内 成像，使果蝇的身体完全自由。该方法能够实现更准确的神经元活动记录，改善果蝇的健康状况以支持更长时间的记录，并避免了与其他方法相比可能存在的麻醉干扰效应。本方案旨在记录神经元中的活动 果蝇，特别关注神经元在学习过程中及学习后的可塑性表现。然而，该解剖方案具有良好的通用性，可灵活适用于活体成像研究中的多种应用。

<table><tbody><tr><td>0.102 mm 铂丝</td><td>Surepure Chemetals</td><td>2690</td><td></td></tr><tr><td>外径 0.25，内径 0.125，铂固化硅胶管</td><td>VWR</td><td>89068-474</td><td></td></tr><tr><td>内径 0.3 mm 硅胶管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-189-14</td><td></td></tr><tr><td>香蕉插头</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>腔室用黑色亚克力板，厚度 0.0125 英寸</td><td>Precision Brand</td><td>44250</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>铜质电击网格</td><td>定制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>铂电阻用直流电源</td><td>Fisher Scientific</td><td>S35740</td><td></td></tr><tr><td>Dremel 工具 3000-1</td><td>Dremel</td><td>3000-N/18</td><td></td></tr><tr><td>黑腹果蝇 / ;;uas-tdtom</td><td>BDSC</td><td>36328</td><td></td></tr><tr><td>黑腹果蝇 / ;uas-gcamp6f;</td><td>BDSC</td><td>42747</td><td>该 uas 品系与 ;;uas-td-tom 组合，以构建同时含有两个插入片段的品系</td></tr><tr><td>黑腹果蝇 / ;;MB077C-gal4</td><td>BDSC</td><td>68287</td><td></td></tr><tr><td>环氧胶&amp;nbsp;</td><td>Gorilla</td><td>4200102</td><td></td></tr><tr><td>气体流量计 1.5 LPM</td><td>Amazon</td><td>B01N0UWZ2T</td><td></td></tr><tr><td>玻璃 1 mL 刻度移液管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-232-9516</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>12TW 规号皮下注射用管</td><td>Microgroup</td><td>316H12TW</td><td></td></tr><tr><td>22X 规号皮下注射用管</td><td>Microgroup</td><td>304H22X</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>肉豆蔻酸</td><td>Acros Organics</td><td>156961000</td><td></td></tr><tr><td>钕磁铁 3×2 mm</td><td>Amazon</td><td>B0CXSQ387M</td><td></td></tr><tr><td>P1000 吸头</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>23-165RL</td><td></td></tr><tr><td>P200 吸头</td><td>Genesee Scientific&amp;nbsp;</td><td>23-150RL</td><td></td></tr><tr><td>气动推入式接头，外径 6 mm</td><td>Amazon</td><td>B07ZHG8Y1Y</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 管，外径 6 mm</td><td>Amazon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剃须刀片&amp;nbsp;</td><td>Amazon</td><td>B08LYD6645</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>海藻糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0167</td><td></td></tr></tbody></table>

在活体成像未麻醉的果蝇成虫中的神经活动

In Vivo Imaging of Neural Activity in Unanesthetized Drosophila Adult Flies

体内成像对于研究黑腹果蝇（Drosophila）的神经生物学至关重要，因为它能够在完整且行为正常的果蝇体内实时观察神经元活动、发育过程及可塑性。&#160;该技术为突触功能和神经环路连接性等动态过程提供了不可替代的洞察，而这些过程在固定样本或离体（ex vivo）制备中无法被准确捕捉。目前大多数用于体内成像的果蝇制备技术，均涉及在功能成像前对果蝇进行短暂麻醉。然而，大量证据表明，麻醉会影响多种认知和生理过程。因此，在成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的体内成像过程中，避免在动物制备阶段使用麻醉剂，是一种虽具挑战性但极具价值的方法。本文所介绍的方案通过将清醒果蝇的喙部吸入连接真空系统的细金属管中，从而固定其头部。在头部被固定的同时，无需麻醉即可完成果蝇的功能成像准备工作。该方案快速且可重复，确保不对果蝇造成伤害。该方法的主要优势在于避免了麻醉剂的使用，从而排除了麻醉对神经活动可能产生的复杂影响。该方法成本低廉且高度可调，使用价格便宜且可定制的工具。它能够成功实现活体果蝇的成像，捕捉与动态认知过程相关的神经活动的快速变化。

此处， 体内 成年体成像 果蝇 在未使用麻醉的情况下，用于研究厌恶性嗅觉条件反射在已充分表征的蘑菇体输出神经元（MBON γ2α'1）中诱导可塑性12钙离子指示剂 GCaMP6f2, 与红色荧光蛋白 TdTom 一起，在蘑菇体输出神经元中表达，该神经元的树突支配蘑菇体 γ 和 α' 叶的区室，并利用 split-Gal4 品系 MB077C 通过遗传靶向至 MBON γ2α'134 (图2A，B).
为观察厌恶性嗅觉条件反射后的可塑性，将果蝇置于共聚焦显微镜下，使其腹部和腿部与电击网格中央对齐，气味递送移液管对准果蝇的触角。首先，记录果蝇对5秒脉冲的4-甲基环己醇（MCH）以及随后5秒脉冲的3-辛醇（OCT）的钙信号响应，两次刺激之间间隔30秒。5分钟后，通过同时呈现1分钟OCT（条件刺激+，CS+）和12次90 V电击对果蝇进行训练。该关联性条件化方案可产生显著的行为厌恶性记忆。最后，在条件化后5分钟和15分钟，再次记录果蝇对MCH和OCT的钙响应，方法与训练前相同。在条件化前，MBON γ2α'1对MCH和OCT均表现出强烈的钙瞬变响应图 2D-F。然而，这一结果与先前的研究发现一致12，条件刺激后5分钟对CS+（OCT）的钙反应完全被抑制（图2D-F）。此外，对条件刺激-（MCH）的反应显著增强。训练后15分钟的结果与此相似，条件刺激+的钙反应显著降低，而条件刺激-的反应增强。这些结果表明，在两种气味刺激中观察到的记忆痕迹至少持续15分钟（图 2D-F）。这些反应通过计算5秒脉冲期间的平均气味反应进行量化，并在同一只果蝇内进行比较。这些气味反应的变化还可通过厌恶训练前后GCaMP6荧光变化的伪彩色图示进行可视化（图 2E）。相比之下，在制备过程中对果蝇进行麻醉会导致对 CS+ 和 CS- 的可塑性均降低。在麻醉的动物中，仅观察到对 CS+ 的部分抑制，因为训练后的反应仍然存在。此外，训练后对 CS- 的反应无显著差异。图 2G，H）。为了更清楚地观察这一现象，我们将诱导可塑性计算为 CS+/CS- 的比值，并发现与麻醉后的果蝇相比，未麻醉果蝇的可塑性显著增强（图 2I。这些代表性结果表明，该方案适用于在显微镜下研究学习与记忆，并能确保果蝇在长时间成像过程中神经元的健康状态。该方案具有足够的通用性，可应用于其他类型的 体内 成像及其他感兴趣的神经元。
<img alt="果蝇解剖装置示意图；吸管组装，果蝇固定及粘贴步骤详解。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68332/68332fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图1"> 
图1: 体内 成像制备 果蝇 无需使用麻醉。 (A) 上图： 示意图展示吸液器制备的各个步骤。 底部面板： 图示在果蝇定位过程中，将记录室固定于显微操作器上的状态。果蝇的喙被置于金属导管开口处，该导管连接抽吸装置并提供500 mL/min的负压。随后将记录室置于果蝇上方。B使用自制的铂电阻将肉豆蔻酸涂抹于果蝇眼睛和胸部的侧面。C将果蝇的喙从金属套管中取出，倒置记录室，使喙被固定在适当位置，从而在记录过程中最大限度地减少移动。D) 将记录室固定在玻璃载片底座上，用胶带从上方覆盖记录室并固定触角，同时在背面贴上胶带以防止任氏液泄漏。E在复眼附近的角质层两侧做两个垂直切口，接着在靠近胸部的角质层处做第三个横切口，从而形成通向脑组织的“窗口”。F) 100–200 之间200 µL 向果蝇切口处的头部加入生理盐水。 (G使用锋利的精细镊子抬起、拉起并分离角质层窗口，以暴露脑组织。H去除脂肪和气管组织，以便在显微镜下清晰观察脑细胞。I将准备好的果蝇置于显微镜下，并调整位置使其身体位于电击网格上方并与其对齐。J伪彩色图像显示 MBON γ2α′1 的表达模式。感兴趣区域以虚线标出，围绕树突分支。比例尺： 50 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/68332fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="嗅觉条件化实验；荧光成像；神经活动；图表；统计分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68332/68332fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：厌恶性嗅觉条件化诱导的 MBON γ2α′1 神经元的可塑性变化。（A）MB077C-splitGal4 驱动子驱动 GCaMP 表达的表达模式。脑组织经解剖后使用抗-GFP 抗体染色，并用抗-nc82 抗体复染。比例尺：50 µm。（B）MBON γ2α′1 的伪彩色图像，显示其胞体、延伸的轴突及树突分支。树突区域为采集钙信号响应的区域。比例尺：50 µm。（C）厌恶性训练方案示意图。果蝇先后暴露于 5 秒的 MCH 和 OCT 气流刺激，中间间隔 30 秒洁净空气。经过 5 分钟间隔后，果蝇被训练将 OCT 与十二次 90 V 电击关联。在训练后 5 分钟和 15 分钟分别记录对 MCH 和 OCT 的钙响应。（D）显示训练前、训练后 5 分钟和 15 分钟时对 MCH（上图）和 OCT（下图）的气味响应轨迹。粗黑条表示气味呈现的时间。（E）MBON γ2α′1 树突区域在训练前、训练后 5 分钟和 15 分钟对 MCH 和 OCT 刺激的伪彩色图像。对于条件刺激−（CS−，MCH），荧光信号增强；而对于条件刺激+（CS+，OCT），荧光信号消失。比例尺：20 µm。（F）MCH 的平均气味响应在训练后 5 分钟和 15 分钟均显著增强，而对 OCT（CS+）的响应则显著受到抑制。非参数 Wilcoxon 配对检验，N = 12。（G）显示麻醉状态下果蝇在训练前及训练后 5 分钟对 MCH（上图）和 OCT（下图）的气味响应轨迹。粗黑条表示气味递送时间。（H）在麻醉动物中，MCH 的平均气味响应在训练后未表现出显著增强，而对 OCT 的响应抑制程度也较未麻醉动物仅部分减弱。（I）训练诱导的可塑性（以 CS+/CS− 比值计算）在麻醉果蝇中显著低于未使用麻醉处理的果蝇。非参数 Wilcoxon 配对检验，N = 8–12。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/68332fig02large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充文件 1：网格支架（STL）。 用于固定电子网格的定制组件的 STL 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Grid_Holder.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 2：载网架（OBJ）。 用于固定电子载网的定制组件的 OBJ 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Grid_holder.obj" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 3：Chamber_LaserCut。 用于激光切割雄性和雌性果蝇记录室顶部组件的 Adobe Illustrator 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Chamber_laserCut.ai" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 4：记录室（STL）。 自定义设计的记录室的 STL 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Recording_chamber.stl" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 5：记录室（OBJ）。 自定义设计的记录室的 OBJ 文件。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Recording_chamber.obj" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>
补充文件 6：记录室动画。 MP4 视频，展示组装好的记录室的动画过程。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68332/Recordig_chamber_animation.mp4" target="_blank">请点击此处下载该文件。</a>

研究学习和记忆等认知过程中细胞活动的一个重要障碍是使用麻醉剂 体内 成像前准备。麻醉在多种模型中会损害短期记忆和认知功能，包括 果蝇 本研究介绍了一种制备成年 果蝇 用于 体内 无麻醉成像

活体成像对于研究果蝇神经生物学至关重要，因为它能够实时观察神经元活动、发育过程及可塑性……

我们正致力于理解自然记忆遗忘的分子、细胞和神经环路基础，旨在揭示大脑如何主动擦除或抑制记忆以维持认知灵活性。近期研究表明，遗忘并非仅仅是记忆的被动衰退，而是一个高度调控的主动生物学过程，需要特定模式的神经元活动参与。一个主要挑战是将特定的神经环路操控与动态记忆过程关联起来，同时以严谨且可解释的方式整合连接组学、遗传学和行为学数据。我们帮助确立了遗忘是一种受生物学主动调控的过程。我们的研究鉴定了果蝇大脑中特定的多巴胺能神经元以及介导正常遗忘所需的分子通路。我们的实验方案能够在不使用麻醉剂的情况下对果蝇进行功能成像，从而避免麻醉剂带来的非特异性干扰效应。我们利用该方法研究记忆形成和主动记忆遗忘背后的神经相关机制。[旁白] 首先，使用Dremel工具和金刚石锯片将一段22号规格的金属皮下注射管切割至约10厘米长。使用Dremel 420切割片对管的两端进行抛光，以形成光滑且清洁的开口，以便容纳果蝇的喙。将切割好的金属管缠绕在一支15毫升离心管上，使其形成所需的弯曲形状。然后，截取一段7厘米长的12号规格金属皮下注射管。接下来，使用刀片修剪2微升移液器吸头的一端，使其能够与22号金属管相匹配。将12号金属管插入移液器吸头的另一端。随后，将少量环氧树脂与固化剂混合均匀。将环氧树脂涂抹在小金属管与移液器吸头的连接处，以及大金属管与另一端的连接处。待环氧树脂在室温下完全固化过夜后，再将组装件连接至显微操作仪支架，并根据需要调整角度。为构建电击与气味递送移液管，使用Dremel金刚石工具在1×100玻璃移液管的3毫升刻度处截去1毫升长度的一段。然后，切割一块尺寸为24.5毫米×8毫米、厚度为1/8英寸的矩形丙烯酸片。将铜制电击网格裁剪至可贴合该矩形丙烯酸片的大小。将两根导线分别焊接在铜网格的相对两端。将铜网格放置在丙烯酸片上，并轻微弯曲以适应果蝇的腹部和腿部。使用绝缘胶带将铜网格固定在丙烯酸片上。然后使用热熔胶枪将玻璃移液管垂直居中地粘附在电击网格上。为构建记录室，取一片玻璃显微镜载玻片作为室的基底。将树脂与环氧胶混合。使用环氧胶将钕磁铁粘附在黑色丙烯酸室的四个角上。在每个已粘合的磁铁上方再放置一个额外的磁铁。然后使用环氧胶将新放置的磁铁粘接到玻璃载玻片上。在胶体固化期间，使用回形针固定组件。从吸虫器上取下200微升移液器吸头。将吸虫器插入装有黑腹果蝇（Drosophila）的样品瓶中，吸取一只果蝇进入1000微升移液器吸头内。将200微升移液器吸头重新装回吸虫器上。然后轻轻吹气并轻弹吸虫器，使果蝇头部朝上并固定在200微升移液器吸头的顶端。接下来，将解剖室放置在显微操作仪支架上。将真空泵连接至果蝇固定金属管，并调节气流速率至约500毫升/分钟。将真空金属管移至显微镜视野中心。轻柔地将果蝇的喙吸入真空固定装置中。调节显微操作仪，使果蝇头部与记录室的开口对齐。打开直流电源。使用铂电阻丝加热肉豆蔻酸使其熔化，并用其将果蝇的眼睛和胸部粘附固定在记录室上。固定完成后，断开真空管路。使用显微操作仪将记录室从真空连接处取下，并将其翻转至倒置状态。然后从下方使用铂电阻丝加热固定果蝇的喙。当所有部位均被牢固粘附后，关闭直流电源。再将记录室恢复至正立位置。将记录室固定在玻璃载玻片基底上。用剪刀剪下一小段胶带，分别贴在果蝇头部的前方和后方以固定位置。旋转记录室，使果蝇头部以90度角面向实验操作者。使用解剖针在眼睛两侧做垂直切口。将记录室水平旋转，然后在体壁上做一条横向切口。向果蝇头部上方加入100微升生理盐水。使用尖头镊子移除体壁窗口，再用镊子清除残留的脂肪组织或气管。将准备好的果蝇放置在配备激光和水浸物镜的共聚焦显微镜的载物台上。通过显微操作仪调节电击网格和气味移液管的位置，使果蝇在电击网格上正确就位。使用粗调Z轴旋钮扫描大脑的Z轴方向，定位目标脑区。将成像帧尺寸设置为512×512像素。使用定制或商用的气味递送系统，开始记录目标神经元的活动。设定记录时长为2分钟。在采集完训练前反应5分钟后，启动训练程序。训练结束后约5至15分钟内记录训练后的反应。钙指示剂GCaMP6f和红色荧光蛋白tdTomato在蘑菇体输出神经元中特异性表达，其树突投射至蘑菇体的γ和α'叶，该神经元通过MB077C分裂GAL4驱动系实现可视化。在无麻醉条件下进行逆转训练后5分钟，蘑菇体输出神经元对3-辛醇的钙反应显著降低，并在15分钟时仍保持抑制状态。相比之下，对4-甲基环己醇的钙反应在训练后5分钟显著增强，并在15分钟时仍维持升高水平。伪彩色图像显示训练前后荧光信号存在明显差异。在麻醉果蝇中，训练后对条件刺激正项（CS+）的钙反应仅部分减弱，而对条件刺激负项（CS-）的反应与基线相比无显著差异。定量分析证实，在麻醉果蝇中，训练后CS+反应显著受抑制，但CS-反应在统计学上无显著变化。非麻醉果蝇的可塑性显著高于麻醉果蝇。

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神经科学

体内研究 未麻醉 果蝇 成年果蝇神经活动的成像

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离体 用于可视化内分泌信号对大脑反应的钙成像 果蝇

本文介绍了一种可在果蝇（Drosophila）学习与记忆过程中可视化突触前和/或突触后钙信号的实验方案。该方法结合了定位于突触的钙离子传感器进行活体钙成像，并采用经典的嗅觉条件化范式，从而能够揭示此类联想学习背后的突触可塑性机制。...

在体光学钙成像观察学习诱导的突触可塑性在 Drosophila melanogaster 中的研究

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准备成年黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）以进行行为和刺激响应期间的全脑成像

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体...

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

我们介绍了利用表面组织粘合剂固定样品，对Drosophila幼虫嗅觉神经元进行钙成像的实验方案。该方法提高了实验稳定性，有助于开展可靠的活体（in-vivo）和离体（ex-vivo）实验。通过定制的R语言脚本分析钙信号，为深入的神经生理学研究提供了高效平台。...

体内与离体条件下对三龄Drosophila melanogaster幼虫嗅觉环路神经元的钙成像

了解果蝇无麻醉活体成像技术，用于研究记忆遗忘的神经机制与认知灵活性。该方法通过钙成像记录蘑菇体输出神经元的活动，揭示多巴胺能神经元在主动遗忘中的关键作用。

在活体成像未麻醉的果蝇成虫中的神经活动

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