Name: 基于乙醇的导管内消融输注预防兔模型乳腺癌的 X 射线可视化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 16 s
Description: 学习基于乙醇的导管内消融输注技术，利用X射线荧光透视实时成像引导，在兔乳腺多导管系统中实现精准灌注，为乳腺癌预防提供一种创伤更小的替代方案。

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本工作部分得到了美国国家癌症研究所授予LFS的R01 CA258314基金项目的支持。我们感谢密歇根州立大学兽医医疗中心提供其成像系统和技术支持（Luke Syperda和Susan Rosser），感谢密歇根州立大学校园动物资源中心提供的技术协助（Rebecca Winget），并感谢密歇根州立大学精准健康计划组织分析核心设施以及密歇根州立大学定量生物元素分析与成像（QBEAM）中心提供的技术协助。

所有描述的实验均在密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会批准的协议下进行。兔子（Oryctolagus cuniculus）在获得AAALAC认证的设施中饲养，遵循《实验动物护理和使用指南》及美国农业部《动物福利法》的规定。
注意：本方法采用来自商业来源的新西兰白兔，包括未产仔（初产）和已退役的经产（多产）兔，其年龄范围为4个月至&#62;1年，体重范围为2.6至4.2 kg。根据我们的经验，预测乳头大小时，以体重决定的动物体型比年龄更为可靠。通常，体重超过3.3 kg的动物具有适合插管的乳头。下述方案主要针对年龄为4–5个月、体重超过3.3 kg的未产兔，因为它们更适合用于长期有效性、伤口愈合、毒性和安全性研究。
1. 术前准备
<ol>
	<li>动物到达新设施后，至少适应环境1周，特别是用于恢复性操作和长期研究的动物。在第一周内，每天监测/检查兔子，并根据机构指南提供零食和营养补充，以帮助其适应新环境。</li>
	<li>从经批准的饲养设施获取兔子（约4月龄的新西兰白兔）。在操作前记录其体重。 
	注意：可在操作前一天记录体重，以便提前完成麻醉所需的相关计算。也可使用退役种兔（&#62;1岁，&#62;3.5 kg），因其乳头较大，更便于单个导管的插管（图3）。基于这些原因，可在初始实验中使用退役种兔，以熟悉并优化导管内操作流程。</li>
	<li>在异氟烷给药前20分钟，按35 mg/kg剂量肌肉注射氯胺酮，按5 mg/kg剂量肌肉注射赛拉嗪，以镇静动物。 
	注意：麻醉药物剂量根据兔子体重计算，氯胺酮的剂量范围为15–35 mg/kg，赛拉嗪为2–5 mg/kg。确保动物已进入镇静状态后再进行脱毛和插管操作，以保障动物及工作人员的福利与安全。确认镇静后，将兔子仰卧位固定于成像/手术台上。</li>
	<li>当出现临床镇静体征（如行为安静、眼睑半闭且呈粉红色）后，皮下注射5 mg/kg的酮洛芬以提供镇痛。 
	注意：镇痛药物剂量依据兔子体重给药，酮洛芬的剂量范围为2–5 mg/kg。</li>
	<li>使用合适的设备（如气管插管或声门上气道装置）为兔子插管，并连接至已充分测试并认证合格的异氟烷麻醉机（1–2% 异氟烷，1.0 L/min 氧气），以实施麻醉。密切监测动物呼吸，确保异氟烷维持在1–2%的浓度。在整个操作过程中，持续监测兔子的血氧饱和度（SpO2）、心率、呼吸频率和体温。 
	注意：插管管径的选择取决于兔子的体重和体型。然而，推荐的尺寸范围并不总是准确，因此建议准备多种尺寸的插管以选择最适合当前兔子的型号。也可使用鼻罩替代气管插管进行麻醉17，但需注意该方式无法提供插管所带来的气道保护作用。将循环温水毯（保温毯）设定为37°C，并置于毛巾下，以维持兔子体温。</li>
	<li>将25 G静脉导管置入耳缘静脉并固定，以便紧急情况下给药。 
	注意：可根据兔子静脉大小选用24至26 G范围的导管。</li>
	<li>在双眼涂抹眼用润滑剂，以防止眼部刺激和角膜干燥。</li>
	<li>使用电动剃刀剃除第二和第三对乳头周围的毛发。用棉签将脱毛膏涂抹于乳头区域，保持接触15秒。 
	注意：使用剃刀时必须格外小心，避免损伤乳头。可使用无线吸尘器辅助维持操作区域清洁。</li>
	<li>15秒脱毛膏作用后，用无菌生理盐水浸湿纱布垫，擦拭去除脱毛膏并清除残留毛发。确认乳头区域脱毛后视野清晰、操作无障碍。必要时可重复操作。 
	注意：脱毛膏在兔子皮肤上的停留时间应尽可能短，控制在10–30秒之间，并必须彻底清除，以防造成化学性皮肤灼伤。</li>
</ol>
2. 导管内灌注
<ol>
	<li>在BSL2级生物安全柜中的无菌条件下，通过混合适量的储备溶液来制备消融溶液。 
	注意：由于碘海醇（350 mg 碘/mL）对光敏感，应将其储存在避光处。本实验中使用了不同浓度的乙醇（EtOH）。若需测试其他浓度的EtOH，可将储备液稀释至所需的消融溶液浓度。为在不同浓度的EtOH、PBS或无菌水中保持消融溶液中碘浓度一致，可用PBS或无菌水补足体积差异。</li>
	<li>以该示例为例，准备5 mL新鲜消融液，其中含10%乙醇、280 mg碘/mL碘海醇、1%食用染料。取350 mg碘/mL的碘海醇储备液4 mL，加入500 μL 100%乙醇（200 proof）、450 μL PBS和50 μL蓝色食用染料储备液，定容至5 mL。 
	注意：每条导管树最多可灌注400 µL，但对于体重低于3.5 kg的动物，通常使用250–350 µL。可使用浓度不超过0.2%的伊文思蓝（Evans Blue）替代食用染料。若在灌注后需立即进行整体组织染色或其他组织学分析，建议优先选用伊文思蓝。</li>
	<li>用精细的尖头镊子去除覆盖在导管开口处的任何死皮。 
	注意：兔子的乳头可能有角质栓突出，若不移除可能阻碍成功插管。也可在乳头周围使用局部利多卡因，以减少注射部位周围的刺激。表1).</li>
	<li>用氯己定纱布擦拭输注部位。 
	注意：氯己定用于注射部位穿刺前的清洁消毒表1).</li>
	<li>将28 G（长度：12.7 mm）针头的斜面插入乳头侧面，以200 µL/min的速度缓慢注入200 µL 0.9%生理盐水。此操作有助于更清晰地观察导管开口。 
	注意：并非所有200 µL生理盐水都需要注入乳头；一旦观察到生理盐水从一个或多个导管开口流出，即停止注射。</li>
	<li>使用1 mL鲁尔锁式注射器吸取1 mL配制好的消融液。将注射器连接至雌性接头， &#34;有翅的&#34; 将12英寸公母延长管的公端小心连接27 G钝头针（长度：12.7 mm）。用溶液预冲延长管。使用酒精纱布擦拭针头以保持清洁。同时注意避免倾斜装有消融溶液的注射器，以防产生气泡。 
	注意：以下为推荐体积，旨在充分灌注导管树：每棵导管树最多300 µL，每侧宫颈和/或腹股沟乳腺组织最多1.2 mL（1st 和 4th 对），每棵树最多400 µL，每个胸腹部乳腺最多1.6 mL（2nd 和 3rd 对）。对于其他应用，可根据实验需求和/或在透视引导下使用更小或更大的灌注体积，以避免导管树过度充盈。延长管有助于更好地控制流速，并实现灌注与实时透视成像的同步进行。作为对照，推荐在9至12周龄小鼠模型中进行导管内灌注的体积如下4 最多30 μL用于宫颈和腹股沟，最多50 μL用于胸腹部乳腺，以及大鼠模型5：宫颈和腹股沟乳腺最多100 μL，胸腹部乳腺最多300 μL。</li>
	<li>使用10倍放大灯以辅助定位导管开口。用手指轻轻握住乳头，将针头插入导管开口。轻柔地继续插入27 G钝头针，直至针尖完全进入乳头内。为使针头顺利进入乳头，应将乳头向上提向针头，而不是将针头向下推入乳头。操作时需注意沿导管开口的走向进行。 
	注意：在某些兔子中，尝试将针头插入乳头开口时可能会感到阻力。此时应小心施加轻微压力，以穿透表层上皮细胞。根据我们的经验，需要使用放大设备才能清晰识别导管开口以便插管。该设备可以是放大灯、透镜、放大镜或类似装置。</li>
	<li>以约 200 µL/min 的恒定速率，缓慢注入 300 µL 溶液，此时针头应已完全插入。注射完成后等待 30 秒，再将针头从导管树中取出；此举可确保注入体积保留在导管树内，并降低泄漏风险。 
	注意：通常由一名研究人员进行插管并固定针头，另一名研究人员手持注射器并以所需速度推动推杆。可使用注射泵以实现更精确控制的流速，因为输注速率的突然变化可能导致导管树破裂或受损。</li>
	<li>使用湿润的纱布或乙醇擦拭巾清除任何溢出的溶液，以避免图像中出现多余的对比溶液。</li>
</ol>
3. 荧光透视成像
<ol>
	<li>每次输注导管树后，采集X射线透视图像。透视成像参数为：在X射线透视仪上设置30帧/秒、67 kV和17.3 mA。但应根据具体实验和成像需求调整这些参数。</li>
	<li>利用透视图像判断是否需要额外体积以完全充盈导管树。 
	注意：可在输注消融液的同时实时进行X射线透视成像。成像过程中可使用金属或塑料镊子夹持乳头，以保护工作人员免受有害X射线辐射。该方法可实时监测导管树的充盈情况。通过观察腺泡末端体积的增加，实时透视可指导何时停止输注。输注后的透视成像可用于确认导管树是否完全充盈，或是否存在泄漏。通常在同侧乳腺内每根导管输注后均进行一次确认性透视成像。</li>
</ol>
4. 术后护理与恢复
<ol>
	<li>在最后一次导管内灌注后停止异氟烷的气流。</li>
	<li>按0.5 mg/kg剂量肌肉注射阿替美唑。 
	注意：不同动物的恢复时间有所差异，但兔子通常在注射后5–20分钟内开始出现恢复迹象。</li>
	<li>在动物完全从麻醉中恢复之前，持续使用加热毯为其提供保温支持。在移出麻醉设备前，继续供氧最多5分钟。 
	注意：恢复迹象包括咀嚼、咳嗽、鼻部抽动和/或眼球运动等口部活动。兔子应在放回恢复运输箱之前具备翻正反射，并能够维持胸卧位。复苏药物根据兔子体重给予，阿替美唑剂量范围为0.1–1 mg/kg。</li>
	<li>按5 mg/kg剂量皮下注射酮洛芬。</li>
	<li>当兔子能够维持胸卧位时，移除静脉导管。在导管拔除部位用纱布按压，以防止过多出血。 
	注意：导管可在兔子处于运输箱内时进行移除。</li>
	<li>将兔子运送回相应的饲养设施。</li>
	<li>术后至少连续3天每日皮下注射5 mg/kg的酮洛芬。</li>
	<li>术后至少连续3天每天监测一次兔子是否出现不适、痛苦、疼痛或自残行为。若兔子表现出上述任何临床症状，可延长酮洛芬治疗。记录并监测体重变化，以评估是否存在厌食迹象。 
	注意：酮洛芬根据兔子体重给药，剂量范围为2–5 mg/kg，可在导管内灌注后每24小时给药一次，最多持续5天，以减轻炎症并减少瘢痕形成。为降低皮肤溃疡或其他与伤口愈合相关不良事件的风险，可在注射部位局部使用利多卡因。任何在酮洛芬治疗后仍持续表现出不适、痛苦、疼痛或损伤症状的动物，应予以安乐死。</li>
</ol>
5. 组织分析
<ol>
	<li>以100 mg/kg剂量静脉注射安乐死溶液（戊巴比妥钠和苯妥英钠）。60秒后通过脚趾/耳部夹捏、呼吸或心跳迹象、角膜反射和/或瞳孔刺激检查生命体征。</li>
	<li>进行剖检以获取乳腺组织，并在10%中性缓冲福尔马林中固定24–36小时后，按常规程序进行石蜡包埋18。随后进行标准苏木精和伊红（H&amp;#38;E）染色和/或使用细胞类型特异性标记物的免疫组织化学染色，以辅助实现所需的分析读数18。按照适当的处理规程（如焚烧）处置尸体。</li>
	<li>在病理学家的协助下分析乳腺组织。使用计算机软件程序辅助定量消融率和邻近组织损伤。 
	注：组织分析是在新西兰白兔（4月龄）输注后一小时内进行的（图4），采用QuPath生物图像分析开源软件（https://qupath.github.io/）。该分析仅基于H&amp;#38;E染色组织。QuPath或类似计算机软件需由病理学家进行输入和校准。仅依靠形态学特征时，部分细胞可能被错误分类（图4）。使用细胞类型特异性标记物（如细胞角蛋白和α-平滑肌肌动蛋白）可提高计算机辅助分类的准确性6。最终，细胞分类分析必须由病理学家进行审校和验证。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在我们之前的研究中，已证明将70%乙醇（EtOH）经导管内（ID）递送可消融乳腺上皮细胞，同时对啮齿类动物周围组织造成最小损伤6,7。在本实验中，我们证实这种消融性溶液的导管内灌注可扩展至兔模型。特别是，在具有多导管树系统的较大动物模型中，我们成功实现了对单侧乳腺内所有导管的依次灌注。这标志着将该消融技术转化为高危人群原发性预防中预防性乳房切除术可行替代方案的下一阶段。
美国食品药品监督管理局（FDA）批准的碘基X射线造影剂欧乃派克（Omnipaque，碘海醇）可通过实时显影导管树内的溶液输送过程，用于评估灌注是否成功。利用荧光透视成像观察灌注后的乳腺组织，与未来可能用于临床实施该影像引导手术的设备和仪器高度一致10,11。该成像方式可帮助我们判断何时停止灌注，因此实时荧光透视是该消融手术临床应用中的关键组成部分。我们已证实该手术在啮齿类动物到兔的乳腺导管系统中具有可扩展性，但仍需进一步研究以确定在该较大动物模型中，既能有效消融乳腺上皮细胞、又能最大程度减少周围组织损伤的乙醇最佳浓度。本方案主要关注导管内灌注的可行性以及术后即刻的组织分析。相关问题的解决策略和实用提示详见表1。尽管本方案的主要目的是递送基于乙醇的消融溶液，但该方法也可用于其他应用，例如局部递送其他成像试剂、基因编辑系统（如CRISPR/Cas9）、慢病毒载体、siRNA、生长因子和/或致癌物2,3，以研究兔乳腺发育及肿瘤发生过程中的其他问题。
综上所述，本方案提供了开展系统性、纵向研究所需的研究工具，可用于评估不同消融溶液的局部和全身效应。这些信息将确定该操作的安全性，并明确在首次人体临床试验中进一步开发和临床评价所涉及的任何问题。

乳腺癌（BC）是美国女性中最常见且癌症相关死亡率第二高的疾病。预计到2025年，将有316,950例新增乳腺癌病例，其中42,170名女性将死于乳腺癌1。目前，双侧预防性乳房切除术是预防乳腺癌最有效的手段。然而，该手术具有高度侵入性，需完全切除乳腺导管上皮细胞（乳腺癌的起源细胞）及其周围组织。由于其侵入性以及对心理和社会的影响，接受风险降低性乳房切除术的高风险女性不足50%2。我们及其他研究者已开发出导管内（ID）给药方法，用于啮齿类动物模型中乳腺癌的初级预防和/或局部治疗2,3，作为当前预防和治疗方法的替代方案。乙醇（EtOH）具有明确且良好的低毒性和安全性，已广泛应用于多种临床场景，例如用于治疗静脉畸形的硬化剂，以及用于某些癌症局部治疗的消融剂3。在这些临床操作中，通常以90–100%浓度输注或递送数毫升乙醇。在我们先前的研究中，将70%乙醇直接递送至小鼠和大鼠模型的乳腺导管系统，可有效化学消融乳腺上皮细胞，同时对邻近正常组织造成有限损伤，并能预防乳腺肿瘤的形成4,5,6,7。当该技术扩展应用于具有更大管腔容积与管腔上皮细胞表面积比的兔类导管系统时，我们探索了较低浓度乙醇溶液（10%至70%）的消融特性。考虑到向临床转化的前景，我们认为，能够有效消融上皮细胞的最低乙醇浓度将具有最佳耐受性和安全性。
确认导管树完全充盈是必要的，以确保消融溶液已与乳腺上皮细胞直接接触。在我们先前的啮齿类动物模型研究中，操作后采用显微CT成像对灌注的导管树进行X射线可视化观察。由于成像过程需要一定时间来麻醉、转移、安置和定位动物，因此美国食品药品监督管理局（FDA）批准的Omnipaque（碘海醇）或类似的含碘快速扩散对比剂并不适用于啮齿类动物导管树的可视化。6,8我们发现，基于纳米颗粒的对比剂，尤其是含有五氧化二钽纳米晶体的对比剂，在啮齿类动物中扩散较慢，更适用于导管树的成像观察。6,7,8,9然而，通过显微CT成像进行的这种事后验证无法实时监测或控制灌注体积，且偏离了临床 established 的诊断流程，例如导管造影术10,11，用于导管树的可视化。因此，将该ID手术技术可行性转化为人类应用的关键步骤是在乳腺腺体大小和复杂性递增的动物模型中，证实灌注后导管树的实时荧光透视成像效果。本方案将该消融手术从啮齿类动物逐步扩展4,5 与兔模型相比，从进化、解剖和生理学角度来看，兔的乳腺比啮齿类或其他大型动物模型（如牛和羊）的乳腺更接近人类乳房。12,13,14雌性兔子有四对乳腺，每对乳腺各包含四棵导管树，而啮齿类动物每个乳腺仅有一棵导管树。兔子的乳头可进行插管。15,16 采用类似于首次人体临床研究中临床导管造影时经导管内（ID）给予造影剂的操作方法。因此，兔子为这种经导管内消融技术向人体转化应用提供了一个实用且相关的中型动物模型。本方案针对经导管内给药过程中的技术难点进行了阐述 体内 成像一种在啮齿类动物模型中无法研究的多导管树系统。本方案所使用的仪器、试剂和材料均与当前临床实践中用于导管树成像的技术相兼容。因此，所述的在荧光透视引导下灌注含碘海醇的乙醇消融溶液的操作程序，可直接应用于首次人体临床试验并进行评估。
本方法已在我们的实验室中成功实施，可在单次操作中对一只或多只兔子的一个或多个乳腺的全部四条导管树进行插管，并依次灌注含对比剂的乙醇消融溶液（图1，图2，图3）。该方法是在荧光透视台上，使用27 G钝头针直接将消融溶液注入已插管的乳头开口，实验对象为4月龄未产兔。操作过程中，动物处于全身麻醉（异氟烷）状态，并在围手术期及术后接受抗炎治疗（酮洛芬，非甾体抗炎药）。荧光透视成像使我们能够实时监测导管树的充盈情况，控制灌注速度和体积，以及评估每个独立导管系统内药物递送的成功程度（图1，图2，图3）。该荧光透视技术更接近于临床应用中图像引导消融治疗的预期模式，有助于限制患者所受的总体辐射剂量。本方案表明，经FDA批准的欧乃派克（碘海醇，Omnipaque）是一种适用于显示兔导管树初始充盈的合适对比剂（图3）。大体观察和组织学分析显示，70%乙醇浓度可在导管树内部及外部引起快速的组织损伤，且损伤范围可超出乳腺结构本身（图3）。而10%-40%浓度范围的乙醇可在实现充分上皮细胞消融的同时，较70%乙醇产生更少的邻近组织损伤（图4）。未来还需开展纵向研究，针对每种消融溶液设置适当样本量的实验组，并进行定时组织采集，以确定该消融溶液在人类患者临床评估中的最佳参数。

<table><tbody><tr><td>带光源和夹具的10倍放大镜，大号鹅颈型</td><td>Amazon</td><td>B0D982JCZ2</td><td>用于乳头可视化</td></tr><tr><td>Exel International 胰岛素注射器</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-31</td><td>用于导管周围盐水注射</td></tr><tr><td>批量钝头针，规格27，长度0.5英寸</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>B27-50 100 Bulk</td><td>用于导管内插管</td></tr><tr><td>伊文思蓝</td><td>Sigma</td><td>E2129-50G</td><td>用于乳腺组织可视化</td></tr><tr><td>荧光X射线成像系统</td><td>GE HealthCare</td><td>DT-C31-01&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>用于荧光成像采集</td></tr><tr><td>HotDog 兽用加热毯</td><td>HotDog</td><td>WC71V</td><td>用于导管内操作/术前准备</td></tr><tr><td>公母接头延长管，长度12英寸</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>EXT-12</td><td>用于导管内操作</td></tr><tr><td>Omnipaque 500 mL（350 mg 碘/mL）</td><td>GE Healthcare</td><td>0407-1414-72</td><td>用于X射线成像（荧光透视）的造影剂</td></tr><tr><td>无菌蓝色食用色素</td><td>McCormick</td><td>930641</td><td>用于乳腺组织可视化</td></tr><tr><td>无菌磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td>用于溶液配制</td></tr><tr><td>注射器</td><td>BD</td><td>309659</td><td>用于导管内灌注</td></tr><tr><td>V-gel</td><td>Docsinnovent</td><td>D30001 - 30006</td><td>用于插管（货号取决于V-gel尺寸）</td></tr><tr><td>酮洛芬</td><td>Covetrus</td><td>#005488</td><td>用于镇痛</td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Covetrus</td><td>71069</td><td>用于镇痛</td></tr><tr><td>局部利多卡因</td><td>Covertus</td><td>70859</td><td>用于镇痛</td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Covetrus</td><td>80907</td><td>用于麻醉</td></tr><tr><td>戊巴比妥</td><td>Covetrus</td><td>#009444</td><td>用于安乐死</td></tr><tr><td>眼用润滑剂</td><td>Covetrus</td><td>75848</td><td>用于麻醉期间眼部保护</td></tr><tr><td>阿替米唑</td><td>Covetrus</td><td>82124</td><td>用于麻醉拮抗</td></tr><tr><td>香蕉片</td><td>Bio-Serv</td><td>#F7161</td><td>用于动物适应性训练</td></tr><tr><td>Furity Gems</td><td>Bio-Serv</td><td>#F5136-1</td><td>用于动物适应性训练</td></tr><tr><td>酸奶滴丸</td><td>Bio-Serv</td><td>#F7200-1</td><td>用于动物适应性训练</td></tr></tbody></table>

兔模型中基于乙醇的导管内消融灌注预防乳腺癌的x射线可视化

X-ray Visualization of Intraductal Ethanol-based Ablative Infusion for Prevention of Breast Cancer in Rabbit Models

乳腺癌是女性癌症相关死亡的第二大原因。尽管对于平均风险女性而言，主动干预措施较少，但预防性乳房切除术是对高风险女性最有效且能显著降低风险的干预手段。然而，预防性乳房切除术是一种侵入性手术，会移除所有乳腺上皮细胞以及周围的间质、脂肪组织和/或肌肉组织。我们的总体研究目标是开发一种非侵入性的导管内（ID）递送方法，通过将消融溶液灌注至整个乳腺导管树，实现对乳腺上皮细胞的局部杀灭。我们先前已在啮齿类动物模型（小鼠和大鼠）中证明，使用乙醇作为消融溶液进行导管内递送是有效的。本方案描述了将含碘海醇（90–300 mg/mL）作为X射线对比剂的10–70%乙醇溶液，递送至兔乳腺多导管系统的技术。具有多导管系统的兔（Oryctolagus cuniculus）乳腺结构比其他大型动物（如牛、羊）更接近人类乳腺。该兔模型方案解决了在大型动物中间模型中，针对多导管系统进行可扩展性操作、实时成像及导管内递送所面临的技术挑战。本方案建立了可在临床直接应用的器械、材料和试剂基础上的透视引导下多导管导管内递送技术。组织学分析可用于优化乙醇浓度，以实现最大程度的上皮消融和最小程度的邻近组织损伤，为未来在人体首次评估该消融技术用于乳腺癌一级预防奠定基础。

雌性家兔的每侧8个乳腺均包含4个导管树，每个导管树分别开口于独立的乳头孔（图2）。由于啮齿类动物每个乳腺仅有一个导管（而家兔每个乳腺有多个导管树），且导管树的大小和数量介于啮齿类与人类之间，因此家兔是用于人类研究转化的理想中间模型。我们可向4月龄新西兰白兔任一乳腺的整个导管树内灌注最多400 µL、浓度为10%-70%的乙醇（EtOH）溶液（图1、图2、图3、图44,8,9）。在单次实验中，最多可在8个乳腺内对最多4个导管树灌注消融溶液。典型的实验设计是在最多4个乳腺中，对每个乳腺内的2-3个导管树灌注含碘基X射线造影剂的特定消融溶液（图2，图3）。对于含碘海醇（每毫升含碘90-300 mg）的消融溶液，可在每次灌注期间和/或之后进行透视成像，以评估每个导管树灌注成功与否，以及灌注溶液量是否达到部分或全部预定剂量（图2、图3）。乳腺组织的采集可用于评估不同配方变化对乳腺上皮细胞破坏程度的影响（图4）。这些影像学分析结果有助于确定在最大限度实现消融的同时，尽可能减少周围组织损伤的最优溶液。我们发现，10%的乙醇溶液所达到的消融效果与含更高浓度乙醇的消融溶液相当（图4）。
<img alt="术前至组织分析流程图；导管内灌注、荧光透视、组织学结果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68334/68334fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 1"> 
图1：导管内操作流程图。 导管内（ID）操作的关键步骤已突出显示。更多细节请参见视频。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68334/68334fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="导管周围注射、导管灌注、荧光透视；麻醉兔、注射器法、导管成像。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68334/68334fig2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图2"> 
图2：导管内插管与灌注的关键步骤。（A）垂直于乳头注射生理盐水以扩张导管开口，便于插管（正中矢状面观）。（B）可通过消融液中的蓝色染料追踪导管树（D1）的插管与充填过程（正中矢状面观）。（C）实时荧光透视成像可对消融液中碘海醇充填导管树（D1）的过程进行精确且高分辨率的监测（背侧位视图）。导管树开口从左至右编号，起始于上象限（D1，左上象限），终止于下象限（D4，右下象限）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68334/68334fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="乳腺肿瘤成像；摄影对比，荧光透视；肿瘤大小测量，定位。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68334/68334fig3.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图3"> 
图3：乳头大小及消融溶液向多个导管的成功输送。 新西兰白兔乳头大小的典型表现。乳头大小因兔子的体重和年龄而异。乳腺从左上（L1，左侧颈区）至右下（R8，右侧腹股沟区）依次编号。所有图像均显示为背侧平面。（A）上图：2.8 kg未产兔，乳头较小，插管困难；中图：3.5 kg未产兔，乳头大小适中，适合插管；下图：4.1 kg经产兔，乳头较大，更易于插管。（B）灌注液中加入蓝色食用色素可用于提供导管内给药及导管树填充的in vivo证据。红色轮廓表示给药失败（脂肪垫给药，上图），蓝色轮廓表示成功给药（导管内给药，中图和下图）。70%乙醇溶液在灌注数分钟后对皮肤造成更明显的损伤（红斑，深蓝色，中图），相比之下10%溶液引起的皮肤反应较轻（浅蓝色，下图）。（C）荧光透视可提供导管内给药的in vivo证据。上图显示给药失败（脂肪垫给药）；左下图显示先成功灌注D1导管，随后成功灌注D2导管树；右下图显示实时荧光透视下D3导管树的填充过程（白色箭头所示）；含碘海醇的消融溶液填充的延长管以及用于固定乳头的镊子亦清晰可见。比例尺在不同放大倍数的图像中均代表1 cm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68334/68334fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="未处理和乙醇处理乳腺组织的组织学分析；包括细胞分类和上皮细胞丢失定量。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68334/68334fig4.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 4"> 
图 4：新西兰白兔乳腺组织在导管内注射乙醇消融液后的组织学分析。（A-B）4月龄动物右侧腹股沟乳腺组织的代表性H&amp;E染色结果，左侧为未经消融处理的组织，右侧为经10% EtOH消融处理的组织。组织切片沿中位面切割，因此D1和D3（左侧导管树）在同一组织切片上显示。全组织视野（A）和高倍放大视野（B）展示了EtOH消融对H&amp;E染色的形态学和显色影响（上层面板），以及基于计算机辅助训练分类器推断出的上皮细胞和间质细胞类别（下层面板）。黑色标尺在A中代表1 mm，白色标尺在B中代表100 μm。（C）柱状图显示接受不同浓度EtOH处理或未处理的导管树中细胞类别的分布情况（每组n &gt; 4）。星号表示每组各细胞类别与10% EtOH处理组对应细胞类别之间未配对Welch's t检验的p值（* &lt;0.05，** &lt; 0.01，**** &lt;0.0001）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68334/68334fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>

本方案介绍了一种在影像引导下向兔乳腺导管系统进行灌注的方法。我们通过荧光透视实时成像，演示了将含有X射线造影剂的乙醇消融溶液可控地灌注至所有乳头开口的过程。

兔模型中基于乙醇的导管内消融灌注预防乳腺癌的X射线可视化

乳腺癌是女性癌症相关死亡的第二大原因。尽管对于平均风险女性而言，主动干预措施较少，……

乳腺癌是癌症相关死亡的第二大原因。对于平均风险女性，目前主动干预措施较少，而高风险女性可选择预防性乳房切除术和激素治疗。然而，由于这些预防措施存在严重的不良副作用，许多高风险女性选择不接受这些治疗。因此，亟需一种针对高风险人群的新型预防策略。我们开发了一种导管内递送技术，可消融乳腺癌起源的记忆性上皮细胞，作为局部且较微创的乳房切除术替代方案。我们先前的研究已证明，在高度侵袭性小鼠模型中，单次导管内灌注70%乙醇可有效预防乳腺癌的发生。我们已成功将该方法扩展至大鼠模型，并通过微型CT确认了灌注效果。尽管我们已在小鼠和大鼠模型中实现了导管树的充填及活体X射线成像，但这些模型每个乳腺仅有一个导管树。因此，在本实验中，我们将探讨该技术在具有多导管树系统的兔模型中的可扩展性。兔子为将这种乳导管消融术转化应用于人类提供了一个实用且相关的中型大动物模型。简而言之，我们首先对动物进行术前准备，去除拟注射乳头周围区域的毛发，然后进行乳导管内灌注；每次灌注后均拍摄X射线透视图像，以确认乳导管树已被充分填充。最后通过组织学分析评估消融溶液的作用效果及成功率。在给予异氟烷前20分钟，通过肌肉注射麻醉剂对兔子进行镇静。我们使用了氯胺酮和赛拉嗪。在出现镇静的临床体征后，注射镇痛剂。我们使用了酮洛芬。将兔子放置在铺有循环温水毯的成像台上，并使用合适尺寸的气管插管对兔子进行插管，然后连接至异氟烷麻醉机。插管的尺寸取决于兔子的体重，但体重估算并不总是准确，因此建议准备多种尺寸的插管以备使用。如果无法获得合适的密封，可以使用面罩代替气管插管。将25号静脉导管插入兔耳，以便紧急给药。待兔完全麻醉后，剃除第二和第三对乳头周围尾侧腹部的毛发。无线吸尘器有助于保持输注部位的清洁。去除大部分毛发后，在乳头周围涂抹脱毛膏，涂抹15秒后用湿润的纱布擦除。确认乳头区域视野清晰、易于操作，必要时可重复上述步骤。使用氯己定纱布垫擦拭该区域，以在插管前清洁注射部位。兔子的导管开口处可能有突出的栓状物，若不将其清除，可能会阻碍乳头的成功插管。使用尖头镊子轻轻去除导管开口表面的皮肤层。将28号针头（斜面朝上）插入乳头侧面，缓慢注入0.2毫升无菌0.9%生理盐水。部分生理盐水可能会从导管开口处排出。这有助于在插管过程中更清晰地观察导管开口。使用无菌技术准备用于插管的12英寸延长管。用乙醇清洁操作台表面，并小心戴上无菌手套。取下延长管两端的保护帽。使用1毫升鲁尔锁型注射器吸取1毫升制备好的消融液。小心地将注射器连接到带翼的雌性端口，然后在另一端小心地安装27号钝头针。缓慢推动液体通过管路，直至针头处有稳定的液流流出。注意不要倾斜注射器，否则会导致气泡形成。用拇指和食指轻轻捏住乳头并略微提起，以进行导管内灌注。使用27号钝头针小心地插入目标导管。10倍放大灯有助于观察导管开口。应缓慢灌注溶液，以尽量减少导管内快速流动液体可能造成的损伤。通常由一名研究人员进行插管并持针，另一名研究人员持注射器并以所需速度推动推杆。Omnipaque 是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的碘基造影剂，可使我们在X射线透视成像下观察导管树。这使我们能够实时观察导管树被消融溶液填充的过程，并在溶液到达导管末端时立即停止给药。在灌注完成后，透视成像还可快速、简便地确认整个导管树是否已成功填充。在此输注至第三导管的实时操作过程中，您可以看到导管1和导管2已经完成输注。实时成像有助于最大限度地充盈导管系统。一旦操作完成，应通过肌肉注射给予逆转剂，开始对兔子进行复苏。在本实验中，我们使用了阿替美唑。恢复的迹象包括咀嚼和鼻子抽动。在让兔子自行恢复之前，务必确保其能够自行保持直立姿势。术后至少连续三天皮下注射酮洛芬，以减轻炎症并尽量减少瘢痕形成。苏木精和伊红染色（hematoxylin and eosin stain），更常被称为H&E染色，是组织学中最常用的染色方法。通过该染色可观察到乳腺中的四个导管开口及其导管走行路径。在我们的实验中，测试了乙醇浓度为10%至70%的一系列溶液。根据这一浓度范围可以看出，与高浓度乙醇相比，乙醇含量低于10%的消融液仍能有效消融导管树。这些结果表明，应优先选择这种低至10%乙醇浓度的消融液进行进一步研究。我们介绍了一种在兔乳腺导管系统中进行影像引导灌注的方法。通过荧光透视实时成像，我们演示了将含乙醇消融液的X射线造影剂可控地灌注至所有乳头开口，并通过组织学分析确认上皮细胞消融率及组织损伤情况。该方法为实现一种较侵入性更小的乳腺癌原发性预防手段提供了可行性，可作为预防性乳房切除术的替代方案。本方案采用与当前临床实践中用于显示导管树的仪器、试剂和材料相兼容的设备，进行含碘海醇的乙醇消融溶液的透视引导下灌注。因此，所述操作可直接应用于首次人体临床试验，并进行评估。

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Cancer Research

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