可重复使用的肝脏成像工具：一种用于肝脏活体显微成像的可重复使用3D打印工具

本实验的总体目标是展示可重复使用肝脏成像工具（Reusable Hepatic Imaging Tool，RHIT）作为一种突破性工具，能够获取高质量、动态的生物学数据，尤其适用于肝脏研究。传统科学研究方法在受控实验中研究小鼠时，长期依赖行为观察、生理监测和遗传分析。这些研究的复杂性常常导致数据输出不一致或受限。

许多实验依赖的数据要么不完整，要么难以解释，例如快速消失的低分辨率图像的短暂闪烁，这使得捕捉长期趋势或细微变化变得困难。引入RHIT技术，实现肝脏研究及其他领域的动态高分辨率成像。我们所展示的技术能够利用易得的材料和广泛可用的3D打印技术，制备定制化的成像工具。

该方法专为学术研究和资源有限的环境设计，可快速开发和部署用于支持高分辨率活体成像的装置。我们开发的可重复使用肝脏成像工具（Reusable Hepatic Imaging Tool, RHIT），旨在提高肝脏活体显微成像过程中的组织稳定性。RHIT 采用模块化设计，可适配不同体型的小鼠，并能在对生理状态干扰最小的情况下，支持对动态代谢过程进行长时间成像。

RHIT 使用丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）通过一步法制备而成。ABS 是一种热塑性塑料，因其质量轻、耐热性好和机械耐久性强而被选用。通过调节材料密度，RHIT 能有效吸收由呼吸和心跳引起的运动，从而减少图像伪影并提高成像清晰度。ABS 的化学惰性和不溶于水的特性使其可与生物组织安全接触，并支持高效清洁和重复使用。

为重现 RHIT，需使用三维产品设计软件。本设计采用 Autodesk Inventor 完成。打开 Autodesk Inventor 并创建一个新的标准零件。

使用适当的描述保存文件。使用创建二维草图功能，在前平面上创建 RHIT 的草图。单击矩形图标，并将其左下角放置在草图平面的原点处。

在第一个矩形内部绘制第二个矩形，以表示RHIT的成像窗口。使用尺寸标注功能为两个矩形添加尺寸，确保所有长度和宽度均相对于原点并相互关联。根据小鼠的大小调整RHIT的尺寸。

仅选择外侧矩形，然后使用拉伸工具对草图进行拉伸，以在中心留出开口，从而为RHIT增加厚度。选择拉伸后RHIT的底面，使用“开始2D草图”功能创建一个新的2D草图。绘制一个矩形以定义加热垫的凹槽区域。

根据将插入此插槽的加热垫的尺寸和厚度确定矩形的尺寸。这些测量值应与实际使用的加热垫相匹配，以确保对哺乳动物进行准确的温度建模。使用尺寸标注功能输入所需的尺寸。

退出二维草图，使用切除拉伸工具创建用于加热垫的深型型腔。根据需要放大视图，以精确定位草图。在同一表面上为温度探头创建新的草图。

单击以开始创建二维草图，然后选择圆形图标。将圆形放置在平面上，并相应地进行尺寸标注。退出草图模式。

单击“拉伸”并选择圆的草图。在拉伸模式下，依次单击“切割”、“拉伸”和“移除材料”。将圆放置在带有凹槽插入件的面的右侧。

目前无需居中。添加尺寸以将其与 RHIT 厚度的中心对齐。单击拉伸。

将弹出一个带有箭头的对话框，指示切割方向，同时显示“贯穿全部”选项。选择“贯穿全部”以穿透整个材料，然后单击确定。退出拉伸模式。

单击圆角图标，在窗口边缘添加圆角，并选择全部八个尖锐边缘。设置圆角尺寸后退出圆角模式。通过进入环境选项卡并选择3D打印选项卡，为3D打印准备模型。

要打印未经修改的RHIT，请将图1A或补充材料中的STL文件导入3D打印准备软件。点击导入，选择文件，然后点击准备，以将模型切片为可打印的层。选择一台兼容的商用3D打印机，然后点击打印。

监控打印过程。打印完成后，根据需要小心取下并清洁打印出的 RHIT。在喷射完成后等待 10 至 15 分钟，再开始手术和成像。

显微镜准备及使用RHIT。按照图2A所示，准备一台常规倒置共聚焦显微镜用于肝脏IBN。插入载物台适配器以固定样品。

本方案使用了定制的金属插件，其具有一个直径35毫米的圆形开口和一块40毫米的盖玻片。在成像前后，必要时使用70%乙醇彻底清洁盖玻片的两面。根据小鼠体型选择合适的RHIT，并用胶带将其固定；将RHIT的孔径与物镜对齐，使其平行于成像用的盖玻片，如图2G所示，将RHIT置于金属插件上，并用胶带覆盖在盖玻片上方进行固定。

根据成像区域大小、空间分辨率和成像时间选择成像物镜，例如 25X/0.95 水镜。将物镜调至接近盖玻片的位置。用胶带将一片纱布固定在湿窗上。

这有助于定位组织并将其与其他腹腔器官分离。使用插入插槽的加热垫预热RHIT，并将温度探头固定在RHIT附近，如图2G至2H所示。这将在成像过程中维持小鼠的体温。使用电动剃毛器和/或脱毛膏去除腹部毛发。

用70%乙醇清除毛发残留并消毒暴露的皮肤。根据机构动物护理和使用委员会（IACUC）的要求，可交替使用聚维酮碘和乙醇进行擦拭，以确保手术部位得到适当的准备。在对动物实施手术前，重新评估其麻醉深度。

使用手术剪从剑突处开始，在肋缘下方做一个横向月牙形、长2至3厘米的切口，止于上腹部左侧，以暴露肝脏。初始切口完成后，小心地在肌层做第二个较小的切口，以暴露肝脏左叶。必要时进行电灼，以防止出血。

使用电灼器时，将浸有生理盐水的纱布置于肝脏与肌肉层之间，以吸收肌肉散发的热量，防止肝脏受热损伤。避免任何过度出血、手术或机械性创伤以及外部压迫。肝脏暴露后，将小鼠转移至显微镜载物台上。

将小鼠放置在显微镜载物台上。将麻醉后的小鼠腹部朝下置于显微镜RHIT平台上方。调整鼻罩位置，确保小鼠持续处于麻醉状态。

使用浸有生理盐水的棉签轻轻将肝脏左外侧叶引导至盖玻片上，同时对胸腔轻轻施加外部压力。利用重力小心地将肝脏移出并置于盖玻片表面。用纱布条轻轻将肝脏与小鼠身体分离。

再次检查鼻锥，确保小鼠在成像过程中保持麻醉状态。通过在暴露腔隙边缘涂抹水性凝胶并避免与加热垫直接接触，防止组织脱水。使用带有封闭式湿度腔的显微镜也有助于维持温度和湿度。

涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。最后，设置延时活体显微成像（IVM）以开始图像采集。打开激光快门，评估荧光标记情况，并识别一个具有明显血流的稳定感兴趣区域。

选择合适的图像采集参数，包括格式、速度、成像时间间隔、持续时间、帧平均等。如有需要，定义Z轴扫描的上限和下限，并开始延时成像记录。为验证本实验方案，我们采用结构相似性指数（structural similarity index, SIM）对图像稳定性进行量化分析，结果如图3D所示。

SIM 根据亮度、对比度和结构模式比较两幅图像。数值为 1 表示完全相似，而数值为 0 则反映存在失真。图 3C 显示，RHIT 始终产生最高的 SIM 值，比无插入序列高出多达 50 倍，表明其图像质量更优。

在标注为 A 至 C 的图像中，我们比较了未使用稳定器的肝脏 IVM、使用纸板插件的 IVM 以及使用 RHIT 的 IVM。RHIT 能够清晰分辨出脂滴（品红色）、细胞核（绿色）和血管系统（青色）。黑白插图突出了图像的稳定性。

RHIT 还能够在肥胖小鼠中实现超过八小时的长期肝脏内成像，如视频一中所示。综上所述，这些结果证实了 RHIT 在不同条件下显著提高了成像质量和可重复性。总体而言，RHIT 简化了传统肝脏内成像所需的复杂设置，提升了实验的可重复性和可及性。

该方法预示着利用3D打印技术实现先进成像方案标准化的更广泛趋势。除肝脏成像外，RHIT的设计原理还可拓展至其他应用领域，包括器官断层扫描、材料科学和工程学，这些领域中运动稳定性对图像保真度至关重要。