使用液滴转移法制备巨型单层囊泡的可靠方法

我们的目标是开发出类似细胞的微型机器人，能够在人体组织中导航并实现局部治疗。这些微型机器人基于巨大单层脂质囊泡和磷脂膜，并包含活性颗粒。本实验方案为初学者提供了指南，帮助其在合成生物学及其他领域（例如微型机器人学）中采用和改进液滴转移方法。

与其他GUV制备技术相比，该方案具有较高的包封效率和操作简便的优点，任何具备基本实验设备的研究团队均可开展。我们将评估基于GUV的微型机器人在类组织环境中的导航能力，并实施传感策略以实现其向病变细胞的自主运动。首先，将手套箱置于化学通风橱内或旁边。

打开手套箱，在箱体底部放置一个装有硅胶颗粒的结晶皿。在结晶皿上方覆盖一层白色支撑面，并在其上铺上纸巾。将所有所需材料放入手套箱内，并将装有氯仿溶液的玻璃小瓶放置在尽可能靠近操作者一侧的软木环支架上或150毫升烧杯中。

现在关闭手套操作箱，确保两个半箱体紧密对齐且不会滑动。使用提供的塑料螺钉将箱体完全密封。关闭出口阀，并将5号管道浸入一个装有半杯水的500毫升烧杯中。

接下来，将2号管道的阀门调节端连接至真空管线，然后使用3号管道将另一端连接至氮气管线。打开阀门并启动真空管线，直至手套膨胀并变得过于僵硬而无法弯曲。

然后，关闭真空管路和阀门。接着，打开氮气管路，直至手套收缩并从手套箱中伸出。戴上手套后，使用 Hamilton 注射器将指定体积的氯仿 DOPC 溶液转移至避光玻璃小瓶中。

用带有针头的盖子密封小瓶。现在，使用双向连接件将6号管道连接到8号管道，将7号管道连接到9号管道。从手套箱中取出手套，并打开出口阀。

然后，缓慢打开氮气管线，观察烧杯中气体流动产生的气泡。逐渐增加氮气流量，直至达到稳定且可观察的气泡速率。持续通气三分钟后，关闭氮气管线。

最后一个气泡离开烧杯后，关闭出口阀。重新戴上手套，断开八号和九号管道与双向连接处的连接。接着，打开小瓶，将瓶盖移回到50毫升离心管上。

然后打开油瓶，将所需量的油转移至避光小瓶中。重新用瓶盖密封小瓶，脱去手套，打开手套操作箱。剧烈涡旋震荡密封的脂质悬浮液小瓶至少30秒。

然后在80摄氏度的水浴中孵育30分钟。再次涡旋混匀离心管后，于室温下孵育过夜。使用剪刀将5毫升离心管的管盖剪下。

在瓶盖中心钻一个直径约八毫米的孔，以适配P1000移液器吸头。如果孔过大导致吸头无法固定，请丢弃该瓶盖，并更换新的瓶盖重新操作。使用一条2厘米×5厘米的砂纸，打磨钻孔边缘使其光滑。

将盖子重新盖在5 mL离心管上，于3,000g离心5分钟，以去除任何残留的塑料微粒。随后，取下盖子并丢弃该离心管。现在，取一个新的5 mL离心管，剪下其盖子，并换上已制备好的带孔盖子。

将P1000枪头穿过孔洞插入，使O型圈卡在枪头与管盖之间，以防止进一步向下移动。通过枪头向管内加入5.5毫升外液。将先前制备的脂质悬浮液小瓶涡旋振荡至少30秒。

然后，将其在50摄氏度的水浴中孵育30分钟。将先前配制的水溶液在室温下平衡至少10分钟。接着，用移液器将300微升外层溶液加入1.5毫升离心管或先前改造过的5毫升离心管中。

将100微升脂质悬浮液缓慢地铺加到油溶液上方，确保形成两个明显且连续的相。让界面静置10分钟，以达到平衡。在2毫升离心管中，用移液器加入250微升脂质悬浮液，随后加入6.25微升内相溶液，制备成2.5%的水包油乳剂。

将两相混合，直至乳液呈现均匀且稳定的状态。取200微升制备好的乳液，转移至先前形成的油溶液脂质悬浮液界面处。如果使用1.5毫升离心管，直接封闭管口即可。

若使用改良的5毫升离心管，将橡胶帽盖在移液枪头末端，轻柔地将整个管子转移至50毫升锥形管中。在室温下以适当转速离心。离心后，确认管底存在不透明沉淀，且上层油相清晰透明。

为了从含有GUVs的五毫升离心管中去除油相，请在确保橡胶帽保持原位的情况下，取出移液器吸头。丢弃吸头，并保留橡胶帽、O型圈和固定帽以供后续使用。若使用1.5毫升离心管，则使用P1000微量移液器移除油溶液，残留约50微升，注意不要扰动沉淀。

更换移液枪头，然后用剩余的 50 微升溶液重悬沉淀。最后，将重悬的样品转移至一支干净的 2 毫升离心管中。在高湿度条件下制备的脂质溶液所产生的巨大单层囊泡产率显著较低，且无序聚集体的比例较高，与在湿度可控环境中制备的样品相比尤其如此，尽管后者中仍存在少量聚集体。

在3,300g离心20分钟时，蔗糖负载囊泡的得率和质量最佳；而离心速度过低或过高均会导致不利结果，例如得率降低或形成聚集体。矿物油产生的囊泡平均直径分布较大，而硅油AR 20则生成显著更高的总囊泡数量。