Name: 使用光片荧光显微镜同时分析再灌注性急性心肌梗死的心脏损伤和免疫反应 3D (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: 了解光片荧光显微镜技术如何用于同时分析心肌梗死后的3D心脏损伤与免疫反应。该方法利用小鼠模型实现多靶点成像，为研究心肌修复机制提供新视角。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

作者感谢以下资助来源：德国研究基金会（UMEA 临床科学家项目，FU 356/12-2，Elias Haj-Yehia；HE6317/2-1，Ulrike Hendgen-Cotta；RA969/12-1，Tienush Rassaf）以及德国心脏病学会（DGK，Deutsche Gesellschaft für Kardiologie - Herz- und Kreislaufforschung e.V.，DGK02/2022，Elias Haj-Yehia）。部分研究工作在德国杜伊斯堡-埃森大学医学院影像中心埃森（IMCES）完成，该中心为医学院下属公共服务核心设施。我们感谢 IMCES 工作人员提供的持续技术支持及其仪器设备的使用许可。

所有实验动物操作均经当地负责的政府机构批准（批准号：81-02.04.2023.A059 — 自然、环境与消费者保护局（LANUV）），并符合动物实验与研究相关的所有伦理规定。实验使用雄性C57BL/6J小鼠（9至30周龄）。动物饲养和使用均在当地动物房的特定病原体-free（SPF）条件下进行，光照周期为12小时光照/12小时黑暗循环。
注意：所有外科手术均在腹腔注射氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）进行麻醉诱导，并以异氟烷（1.5 Vol%）维持麻醉的条件下实施。为减轻动物痛苦，所有动物在麻醉前后当天均接受皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡，并在夜间提供含丁丙诺啡的饮用水。诱导再梗死性急性心肌梗死（repAMI）的手术方案此前已在其他文献中详细描述。16,17在开始体内抗体注射之前，准备两个用于此目的的6 cm培养皿 离体 在后续步骤中进行逆行抗体注射。需要一个盛有冰上PBS的浅培养皿，用于粗略去除心脏周围多余的组织（建议在培养皿中放置裁剪成合适大小的纱布片，以方便后续操作）。另一个培养皿用于主动脉插管，其中放置一根浸没在冰上PBS中的20 G钝头不锈钢插管针，插管切迹处预先套有5-0缝线松结。应避免或清除插管内的气泡，因为气泡可能阻塞冠状血管，导致灌注不完全。
1. 活体抗体注射
<ol>
	<li>使用氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>通过尾静脉注射，将各10 µg直接标记的小鼠抗CD31抗体（克隆号：MEC13.3；荧光染料：AlexaFluor 790）和小鼠抗Ly6G抗体（克隆号：1A8；荧光染料：AlexaFluor 647）溶于PBS中，总注射体积为每克体重5 µL（例如20 g小鼠注射100 µL）。 
	注意：该抗体注射可标记心脏内所有血管内皮，用于量化再灌注心肌梗死（repAMI）损伤范围。</li>
	<li>注射抗体后，等待10分钟使其充分循环，再继续后续操作。</li>
</ol>
2. 心脏采集
注意：第 2 和第 3 部分具有严格的时间要求，必须在 6 分钟内完成。
<ol>
	<li>注射抗体10分钟后，通过颈椎脱位法处死动物。通过评估反射确认死亡。 
	注意：如果需要采集血样，应在进行下一步之前完成采样。</li>
	<li>将小鼠置于体视显微镜下。</li>
	<li>打开胸腔，并在上腔静脉从胸廓进入颈部的出口附近切开暴露的血管。 
	注意：保持主动脉完整，因其后续步骤需要 离体 逆行性抗体注射</li>
	<li>灌注心脏 原位 使用含肝素（20 IE/mL）的PBS，通过27 G针头和滚轴泵（70 µL/s），经左右心耳灌注，持续3分钟。心脏血液充分清除的表现为心表血管影逐渐消失，以及肺和肝脏变白。 
	注意：避免通过右心室或左心室进行心脏灌注，因其可能在光片荧光显微镜成像过程中产生成像伪影。</li>
	<li>切除心脏以及至少5 mm的残余主动脉，并连同周围肺组织一起取出。 
	注意：切除过程中切勿直接抓握心肌组织，以免造成组织损伤，并避免在光片荧光显微镜成像过程中产生伪影。</li>
</ol>
3. 离体 逆行抗体注射
<ol>
	<li>将心脏转移至预先准备好的含有冰冻 PBS 和纱布的 6 cm 培养皿中。</li>
	<li>切除残留的周围肺组织、脂肪和血管组织，直至仅剩带有约 5 mm 主动脉的心脏。</li>
	<li>将心脏转移至已准备好的培养皿中，用于主动脉插管。</li>
	<li>将残留的主动脉套入 20 G 钝头不锈钢插管上，并用预先打结的 5-0 缝线在插管凹槽处结扎固定。 
	注意：应将插管尖端推至靠近主动脉瓣的位置，以确保灌注液无泄漏。</li>
	<li>使用 6-0 缝线在之前用于诱导再灌注急性心肌梗死（repAMI）的相同位置，永久性重新结扎左前降支动脉（LAD）。</li>
	<li>通过插入的插管逆行注入 400 µL 含有 20 µg 小鼠抗 CD31 抗体（克隆：MEC13.3）的 PBS 溶液，该抗体标记有 AlexaFluor 546。 
	注意：用封口膜封闭注射器与插入插管之间的连接处，以确保抗体通过冠状动脉完全灌注。该抗体注射仅会标记风险区（AAR）以外的内皮细胞，因此可用于风险区的定量分析。</li>
	<li>从主动脉中拔出插入的插管。</li>
	<li>将心脏转移至含有 10 mL 4% 多聚甲醛（PFA）的 15 mL 聚丙烯离心管中，在 4 °C 避光条件下静置孵育过夜。</li>
</ol>
4. 样品处理与透明化
<ol>
	<li>在室温（RT）避光条件下，将固定的心脏置于5 mL聚丙烯反应管中，用5 mL PBS溶液洗涤三次，每次10分钟，始终以接近顶部旋转的方式轻轻振荡。</li>
	<li>在室温（RT）避光条件下，将固定的心脏置于5 mL聚丙烯反应管中，依次使用50%、70%和100%的乙醇（溶剂为去离子水）进行梯度脱水，每步至少2小时，始终以接近顶部旋转的方式轻轻振荡。 
	注意：50%和70%乙醇孵育时间可延长至次日，100%乙醇孵育时间可延长至3天。</li>
	<li>将脱水后的心脏转移至15 mL聚丙烯反应管中，加入含5% DMSO和5% H2O2的10 mL 100%乙醇进行漂白处理，在4 °C避光条件下静置孵育4小时（不振荡）。 
	注意：漂白过程中管内可能产生压力，后续打开管盖时需小心操作。</li>
	<li>将漂白后的心脏置于5 mL聚丙烯反应管中，用5 mL 100%乙醇洗涤三次，每次12小时，室温（RT）避光条件下始终以接近顶部旋转的方式轻轻振荡。 
	注意：每步孵育时间可延长至最多3天。</li>
	<li>将心脏转移至含有4 mL肉桂酸乙酯（ECi）的5 mL聚丙烯反应管中，进行组织透明化处理，在室温（RT）避光条件下静置孵育3天（不振荡）。 
	注意：透明化后的心脏在正确保存（室温避光）条件下，可在ECi中存放至少3个月而不出现荧光强度下降。请勿将ECi或存于ECi中的样品置于6 °C以下环境中，因ECi在此温度会冻结，从而损伤样品。</li>
</ol>
5. 凝胶多糖块的制备
<ol>
	<li>将1 g结冷胶粉末加入100 mL加热的自来水（50–60 °C）中混合。</li>
	<li>使用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。 
	注意：若粉末未能充分溶解，可将溶液在微波炉中加热至沸腾。</li>
	<li>用100 µm细胞筛过滤结冷胶溶液。</li>
	<li>将过滤后的溶液倒入浅底10 cm培养皿中。</li>
	<li>静置冷却，直至凝胶完全固化。</li>
	<li>将凝胶切成15 mm × 15 mm × 5 mm的块状。</li>
	<li>将凝胶块置于50 mL聚丙烯反应管中，加入去离子水配制的50%和70%梯度乙醇溶液进行脱水处理，每步至少2小时，室温下持续近似顶部旋转振荡。 
	注意：加入凝胶块后，需用乙醇充满反应管。凝胶块体积不得超过反应管容量的一半。</li>
	<li>将脱水后的凝胶块在50 mL 100%乙醇中孵育，每次12小时，共三次，室温下持续近似顶部旋转振荡，使用同一50 mL聚丙烯反应管。 
	注意：加入凝胶块后，需用乙醇充满反应管。凝胶块体积不得超过反应管容量的一半。脱水后的凝胶块可在最后一次含100%乙醇的反应管中长期保存，直至进行ECi透明处理。</li>
	<li>将凝胶块转移至含有25 mL ECi的50 mL聚丙烯反应管中，室温下静置孵育3天，不进行振荡。 
	注意：每个反应管中仅放入少量凝胶块，以避免透明过程中产生伪影。透明后的凝胶块可在ECi中保存至少6个月，室温储存即可。</li>
</ol>
6. 成像
<ol>
	<li>将透明化的结冷胶块切割至所需大小，以在显微镜样品 holder 中稳定固定透明化的心脏组织。 
	注意：结冷胶块可多次重复使用。</li>
	<li>使用适当的激发和发射滤光片设置，检测目标荧光信号（自发荧光、AAR 染色 [与 AlexaFluor 546 标记的抗 CD31 抗体]、与 AlexaFluor647 偶联的抗 Ly6G 抗体以及 CD31neg 染色 [与 AlexaFluor 790 标记的抗 CD31 抗体]）。图像采集时，使用数值孔径为 0.1 的物镜，工作距离为 17.6 mm。 
	注意：使用白光激光器（200 mW；480–2400 nm）进行信号检测。检测结缔组织来源的自发荧光时，采用 470/30 nm 带通激发滤光片和 525/50 nm 带通发射滤光片；检测与 AlexaFluor 546 偶联抗体标记的 CD31 染色时，使用 520/40 nm 带通激发滤光片和 585/40 nm 带通发射滤光片；检测与 AlexaFluor 647 偶联抗体标记的 Ly6G 染色时，使用 630/30 nm 带通激发滤光片和 680/30 nm 带通发射滤光片；检测与 AlexaFluor 790 偶联抗体标记的 CD31 染色时，使用 740/40 nm 带通激发滤光片和 824/55 nm 带通发射滤光片。照明时间与激光衰减百分比需根据信号质量进行调整。</li>
	<li>选择以下设置进行光片显微成像：
	<ol>
		<li>选择光片数值孔径（sheet NA）为 0.079，由此产生的光片厚度为 5 µm。</li>
		<li>选择相邻两个 z 层面之间的距离为 10 µm。 
		注意：这会导致采样不足，进而影响轨迹追踪和体积测量的精度。为避免此问题，相邻两个 z 层面之间的距离应等于光片厚度的一半，即本例中应为 2.5 µm。本研究选择欠采样数据，因为成像时间缩短和数据堆栈体积减小所带来的优势超过了分析精度的轻微损失。</li>
		<li>将光片宽度设为 100%，以实现样品的均匀照明。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 图像后期处理
注意：所获取的数字图像数据进一步使用下述列表中的科学三维图像处理与分析软件进行处理 材料表.
<ol>
	<li>启动 Imaris 文件转换器 10.1 软件，通过将包含图像文件的文件夹拖放到 Imaris 文件转换器窗口中，或点击浏览并导航至包含图像文件的文件夹，将原始数据集加载到软件中。</li>
	<li>通过选择文件夹来指定输出文件夹。</li>
	<li>点击全部开始，等待文件被转换为 .ims 格式的 Imaris 文件。</li>
	<li>启动软件，在左上角选择Surpass模式。</li>
	<li>通过选择打开并选中相应的 .ims 数据文件，来加载图像堆栈。</li>
	<li>为创建整个心脏的自动生成表面，选择3D 视图和表面功能。</li>
	<li>在算法设置部分，选择仅分割感兴趣区域，最终处理整幅图像和对象-对象统计，同时禁用分类表面。 
	注意：启用对象-对象统计可实现不同表面及斑点功能的叠加计算。</li>
	<li>点击创建面板右下角的蓝色箭头按钮，进入下一步操作。</li>
	<li>使用图像视图内出现的操作手柄，确定三维感兴趣区域。</li>
	<li>进入下一步，选择源通道（自发荧光通道）。</li>
	<li>启用平滑功能，并选择默认设置 11.8 µm。</li>
	<li>进入下一步，确定用于生成视觉上满意的三维表面的阈值，该表面将显示在图像视图中。</li>
	<li>在最后一步中，调整表面滤波器，选择体素数量作为滤波器类型，并将阈值设为 10。</li>
	<li>点击创建部分右下角的绿色箭头按钮以生成表面。通过使用颜色面板，根据需要更改所创建表面的材质和颜色。</li>
	<li>再次选择3D 视图和表面，手动创建另外两个表面：分别为 AAR（AlexaFluor 546 通道中的 CD31neg 体积）和心肌内皮损伤体积（AlexaFluor 790 通道中的 CD31neg 体积）。</li>
	<li>在算法设置部分，选择仅分割感兴趣区域，最终处理整幅图像和对象-对象统计，同时禁用分类表面，然后点击跳过自动创建，手动编辑。</li>
	<li>在面板面板中，选择XY作为方向，无作为可见性，并手动将分辨率控制器调整至最大。</li>
	<li>进入模型面板，点击距离图标，并将顶点间距设为 100 µm。</li>
	<li>启用绘制功能，并每隔 10 个图像切片，在 AlexaFluor 546 通道或 AlexaFluor 790 通道中圈出 CD31neg 区域。</li>
	<li>完成所有相关区域的圈选后，选择自动拟合并点击执行自动拟合。</li>
	<li>点击创建表面，并在颜色面板中调整所生成表面的材质和颜色。</li>
	<li>为将中性粒细胞显示为 Ly6G+ 斑点，选择3D 视图和斑点功能以生成斑点分析。</li>
	<li>在算法设置部分，选择仅分割感兴趣区域，最终处理整幅图像和对象-对象统计，同时禁用分类斑点。</li>
	<li>使用创建面板右下角的蓝色箭头按钮，进入后续步骤。</li>
	<li>如前所述，使用图像视图中出现的操作手柄确定三维感兴趣区域。</li>
	<li>进入下一步，使用源通道（AlexaFluor 647 通道）。</li>
	<li>将估计的 XY 直径设为 10 µm，启用沿 Z 轴建模 PSF 延伸，并将估计的 Z 直径设为 20 µm。</li>
	<li>禁用背景减除。</li>
	<li>进入下一步，选择强度最小值作为滤波器，并设置合适的阈值。 
	注意：为估算阈值水平，点击程序窗口上方区域的切片，并选择 AlexaFluor 647 通道。将光标移至代表阳性 Ly6G 染色的原始图像切片中的不同斑点上，读取程序窗口左下角显示的强度值。</li>
	<li>点击创建面板右下角的绿色箭头按钮以生成斑点。</li>
	<li>在创建面板的点样式/质量部分，将半径比例设为 3.0。</li>
	<li>进入颜色面板，根据需要调整斑点颜色。</li>
</ol>

<ol><li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease%3A+mechanisms+and+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annu Rev Physiol. 72, 19-44 (2010).</li>
<li>Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+in+cardiac+injury%2C+repair+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation in cardiac injury, repair and regeneration.</a> Curr Opin Cardiol. 30 (3), 240-245 (2015).</li>
<li>Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+basis+for+cardiac+repair+after+myocardial+infarction%3A+from+inflammation+to+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">The biological basis for cardiac repair after myocardial infarction: from inflammation to fibrosis.</a> Circ Res. 119 (1), 91-112 (2016).</li>
<li>Koch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capillary+endothelia+and+cardiomyocytes+differ+in+vulnerability+to+ischemia%2Freperfusion+during+clinical+heart+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cardiothorac+Surg%22%5BJournal%5D)">Capillary endothelia and cardiomyocytes differ in vulnerability to ischemia/reperfusion during clinical heart transplantation.</a> Eur J Cardiothorac Surg. 20 (5), 996-1001 (2001).</li>
<li>Singhal, A. K., Symons, J. D., Boudina, S., Jaishy, B., Shiu, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cells+in+myocardial+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Vasc+Dis+Prev%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cells in myocardial ischemia-reperfusion injury.</a> Vasc Dis Prev. 7, 1-14 (2010).</li>
<li>Robbers, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging-defined+areas+of+microvascular+obstruction+after+acute+myocardial+infarction+represent+microvascular+destruction+and+haemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging-defined areas of microvascular obstruction after acute myocardial infarction represent microvascular destruction and haemorrhage.</a> Eur Heart J. 34 (30), 2346-2353 (2013).</li>
<li>DeLisser, H. M., Newman, P. J., Albelda, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+functional+aspects+of+PECAM-1%2FCD31%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">Molecular and functional aspects of PECAM-1/CD31.</a> Immunol Today. 15 (10), 490-495 (1994).</li>
<li>Merz, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporaneous+3D+characterization+of+acute+and+chronic+myocardial+I%2FR+injury+and+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Contemporaneous 3D characterization of acute and chronic myocardial I/R injury and response.</a> Nat Commun. 10 (1), 2312(2019).</li>
<li>Buscemi, L., Price, M., Bezzi, P., Hirt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatio-temporal+overview+of+neuroinflammation+in+an+experimental+mouse+stroke+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Spatio-temporal overview of neuroinflammation in an experimental mouse stroke model.</a> Sci Rep. 9 (1), 507(2019).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+epithelial+cells-derived+small+extracellular+vesicle-VEGF-A+promotes+peritubular+capillary+repair+in+ischemic+kidney+injury%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Tubular epithelial cells-derived small extracellular vesicle-VEGF-A promotes peritubular capillary repair in ischemic kidney injury.</a> NPJ Regen Med. 7 (1), 73(2022).</li>
<li>Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarct+size+and+area+at+risk+assessment+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice.</a> Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).</li>
<li>Arai, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+resonance+imaging+for+area+at+risk%2C+myocardial+infarction%2C+and+myocardial+salvage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Magnetic resonance imaging for area at risk, myocardial infarction, and myocardial salvage.</a> J Cardiovasc Pharmacol Ther. 16 (3-4), 313-320 (2011).</li>
<li>Botker, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+guidelines+for+rigor+and+reproducibility+in+preclinical+and+clinical+studies+on+cardioprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Res+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection.</a> Basic Res Cardiol. 113 (5), 39(2018).</li>
<li>Rassaf, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+nitrite+contributes+to+cardioprotection+by+remote+ischemic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Circulating nitrite contributes to cardioprotection by remote ischemic preconditioning.</a> Circ Res. 114 (10), 1601-1610 (2014).</li>
<li>Haj-Yehia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD47+blockade+enhances+phagocytosis+of+cardiac+cell+debris+by+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22IJC+Heart+Vasculature%22%5BJournal%5D)">CD47 blockade enhances phagocytosis of cardiac cell debris by neutrophils.</a> IJC Heart Vasculature. 48, 101269(2023).</li>
<li>Totzeck, M., Hendgen-Cotta, U. B., French, B. A., Rassaf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+approach+to+remote+ischemic+preconditioning+and+ischemic+preconditioning+against+myocardial+ischemia%2Freperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Methods%22%5BJournal%5D)">A practical approach to remote ischemic preconditioning and ischemic preconditioning against myocardial ischemia/reperfusion injury.</a> J Biol Methods. 3 (4), e57(2016).</li>
<li>Michel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+pressure-volume+analysis+of+acute+myocardial+infarction+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Real-time pressure-volume analysis of acute myocardial infarction in mice.</a> J Vis Exp. (137), e57621(2018).</li>
<li>Ojha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+structural+and+functional+changes+in+the+myocardium+following+focal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of the structural and functional changes in the myocardium following focal ischemia-reperfusion injury.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (6), H2435-H2443 (2008).</li>
<li>Clasen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+ischemia+and+reperfusion+in+mice%3A+a+comprehensive+hemodynamic%2C+electrocardiographic+and+electrophysiological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cardiac ischemia and reperfusion in mice: a comprehensive hemodynamic, electrocardiographic and electrophysiological characterization.</a> Sci Rep. 13 (1), 5693(2023).</li>
<li>Lang, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expedient+assessment+of+post-infarct+remodeling+by+native+cardiac+magnetic+resonance+imaging+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expedient assessment of post-infarct remodeling by native cardiac magnetic resonance imaging in mice.</a> Sci Rep. 11 (1), 11625(2021).</li>
<li>Coolen, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+T1+mapping+of+the+mouse+heart+using+variable+flip+angle+steady-state+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22NMR+Biomed%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional T1 mapping of the mouse heart using variable flip angle steady-state MR imaging.</a> NMR Biomed. 24 (2), 154-162 (2011).</li>
<li>Zhong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+cardiovascular+magnetic+resonance+of+myocardial+mechanics+in+mice+using+three-dimensional+cine+DENSE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Comprehensive cardiovascular magnetic resonance of myocardial mechanics in mice using three-dimensional cine DENSE.</a> J Cardiovasc Magn Reson. 13 (1), 83(2011).</li>
<li>Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy%3A+3D+reconstruction+of+large+microscopical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens.</a> J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).</li>
<li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Rajendran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+peripheral+neural+circuits+that+regulate+heart+rate+using+optogenetic+and+viral+vector+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Identification of peripheral neural circuits that regulate heart rate using optogenetic and viral vector strategies.</a> Nat Commun. 10 (1), 1944(2019).</li>
<li>Mann, L., Klingberg, A., Gunzer, M., Hasenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+visualization+of+leukocyte+infiltrate+in+a+murine+model+of+fulminant+myocarditis+by+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy.</a> J Vis Exp. (123), e55450(2017).</li>
<li>Taki, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((14C-Methionine+uptake+as+a+potential+marker+of+inflammatory+processes+after+myocardial+ischemia+and+reperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nucl+Med%22%5BJournal%5D)">14C-Methionine uptake as a potential marker of inflammatory processes after myocardial ischemia and reperfusion.</a> J Nucl Med. 54 (3), 431-436 (2013).</li>
<li>Michel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD1+deficiency+modifies+cardiac+immunity+during+baseline+conditions+and+in+reperfused+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">PD1 deficiency modifies cardiac immunity during baseline conditions and in reperfused acute myocardial infarction.</a> Int J Mol Sci. 23 (14), 7533(2022).</li>
<li>Park, K. C., Gaze, D. C., Collinson, P. O., Marber, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+troponins%3A+from+myocardial+infarction+to+chronic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac troponins: from myocardial infarction to chronic disease.</a> Cardiovasc Res. 113 (14), 1708-1718 (2017).</li>
<li>Whittington, N. C., Wray, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+red+blood+cell+autofluorescence+for+immunocytochemistry+on+fixed+embryonic+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue.</a> Curr Protoc Neurosci. 81 (2), 28.21-28.28 (2017).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using light sheet microscopy.</a> J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+practical+considerations+for+tissue+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging.</a> Nat Protoc. 16 (6), 2732-2748 (2021).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li>
<li>Merz, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+for+precise+staging+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging for precise staging in melanoma.</a> Eur J Cancer. 159, 182-193 (2021).</li>
<li>Hofmann, J., Gadjalova, I., Mishra, R., Ruland, J., Keppler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+tissue+clearing+and+multi-organ+volumetric+imaging+enable+quantitative+visualization+of+sparse+immune+cell+populations+during+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient tissue clearing and multi-organ volumetric imaging enable quantitative visualization of sparse immune cell populations during inflammation.</a> Front Immunol. 11, 599495(2020).</li>
<li>Pichardo, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tissue+clearing+to+study+the+intra-pulmonary+biodistribution+of+intravenously+delivered+mesenchymal+stromal+cells+and+their+interactions+with+host+lung+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Optical tissue clearing to study the intra-pulmonary biodistribution of intravenously delivered mesenchymal stromal cells and their interactions with host lung cells.</a> Int J Mol Sci. 23 (22), 14171(2022).</li>
</ol>

Elias Haj-Yehia 报告从阿斯利康（AstraZeneca）获得的个人酬金及其他报酬，这些利益关系与本提交的研究无关。Simon F. Merz 和 Lea Bornemann 目前受雇于 Miltenyi Biotec B.V. &amp;#38; Co. KG。Matthias Totzeck 和 Tienush Rassaf 报告从 Edwards 和 Novartis、Bristol Myers Squibb、拜耳（Bayer）、第一三共（Daiichi Sankyo）以及阿斯利康（Astra Zeneca）获得的个人酬金及其他报酬，这些利益关系与本提交的研究无关。Tienush Rassaf 和 Ulrike B. Hendgen-Cotta 共同创立了 Bimyo 公司，该公司致力于心脏保护肽的开发。Matthias Gunzer 收到了来自 Miltenyi BioTec B.V. &amp;#38; Co. KG 的常规研究资助。其余所有作者声明无利益冲突。

在小鼠再灌注急性心肌梗死（repAMI）期间，有多种成像方法可用于检测心肌组织损伤。这些技术各有优势，但也存在局限性。利用氯化三苯基四氮唑（TTC）染色检测心肌细胞代谢活性降低是最常用于量化心肌缺血/再灌注（I/R）损伤的方法，可与伊文思蓝（Evan's blue）染色结合使用，以区分风险区（AAR）13,14,15这是一种快速且经济高效的方法，但由于需要制备连续的组织切片，因此在精确的三维重建方面存在局限性。这一限制同样适用于心脏组织损伤的传统组织学方法，例如苏木精-伊红染色或戈莫里三色染色，这些方法虽可实现更高空间成像分辨率的分析18,19另一方面，再灌注急性心肌梗死（repAMI）期间的组织损伤可通过磁共振成像（MRI）进行评估12,<sup class="xr...

再灌注急性心肌梗死（repAMI）中的组织损伤是心脏重构和心力衰竭发展的主要驱动因素1。多种局部介质、心脏固有细胞以及浸润的免疫细胞通过复杂的相互作用共同影响组织损伤的扩展2,3。理解这些过程的空间组织对于深入认识再灌注后心肌损伤的机制、识别新的治疗靶点并改善心脏功能至关重要。
由于心肌本身由不同类型的细胞组成，因此对心脏损伤进行详细分析具有挑战性，因为每种细胞类型在缺血和再灌注损伤期间表现出各自特有的耐受能力4,5。在再灌注急性心肌梗死（repAMI）背景下，一个重要特征是血管系统显著丢失，并伴随内皮细胞功能恶化6。目前用于显示小鼠和人类血管结构以及分析内皮功能障碍的最成熟标志物是CD31（也称为PECAM-1），这是一种表达于内皮细胞表面的黏附分子7。在不同的缺血/再灌注模型中，CD31的丢失已被证明是区分内皮组织损伤的良好替代标志物8,9,10。此外，在repAMI过程中，整个心脏可区分出三个主要的损伤区域。未受缺血/再灌注（I/R）损伤影响的心脏组织称为远端区域。血管闭塞下游的心肌定义为风险区域（AAR）11,12。再灌注开始后，可在AAR内部进一步区分出一个明确的心肌组织区域，该区域因先前的缺血而受损（损伤区域）13。传统的小鼠心脏I/R损伤评估方法采用连续厚切片的氯化三苯基四氮唑（TTC）染色，以显示受损心肌细胞代谢活性降低13,14。同时，可结合ex vivo伊文思蓝染色以确定AAR15。然而，这些成熟的方法存在若干局限性，包括难以同时评估免疫细胞浸润、难以区分细胞类型特异性损伤，以及无法实现精确的三维组织重建。
光片荧光显微镜（LSFM）能够对经透明化处理的完整小鼠器官进行成像，其荧光信号分辨率可达细胞水平。近期，一种改进的无毒组织透明化方法被引入，利用肉桂酸乙酯（ECi）实现完整小鼠心脏的三维可视化8为克服TTC/伊文思蓝染色的局限性，采用活体抗体标记的CD31荧光染色法，显示心脏内皮损伤区域为无CD31染色（CD31缺失）的区域。阴性) 在再灌注急性心肌梗死期间8额外给药 离体 通过使用另一种荧光光谱的荧光标记抗CD31抗体进行逆行主动脉注射，可实现对AAR的活体染色及同步三维成像。此外，该方法可通过增加中性粒细胞染色进行拓展，从而分别分析远端区域、AAR及心肌内皮损伤体积中的细胞分布，有助于深入理解再灌注急性心肌梗死（repAMI）过程中中性粒细胞的功能。

<table><tbody><tr><td>27 G 针头</td><td>Becton Dickinson</td><td>305889</td><td>BD Eclipse</td></tr><tr><td>三维图像处理 &amp;和分析软件</td><td>Bitplane</td><td>版本 10.1.0</td><td>Imaris</td></tr><tr><td>5-0 缝合线</td><td>Serag-Wiessner</td><td>IC108000</td><td>丝蛋白</td></tr><tr><td>6-0 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>EH7814</td><td>Prolene</td></tr><tr><td>AlexaFluor 546 抗体标记试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A20183</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 790 抗体标记试剂盒</td><td>Invitrogen</td><td>A20189</td><td></td></tr><tr><td>抗小鼠 Ly6G 抗体（AlexaFluor 647）</td><td>Biolegend</td><td>127610</td><td>克隆：1A8</td></tr><tr><td>细胞滤网（100 &amp;micro;m)</td><td>康宁</td><td>431752</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>卡尔·罗斯</td><td>7029.1</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>卡尔·罗特</td><td>0911.4</td><td></td></tr><tr><td>肉桂酸乙酯（ECi）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>112372</td><td></td></tr><tr><td>文件转换软件</td><td>Bitplane</td><td>版本 10.1.0</td><td>Imaris</td></tr><tr><td>纱布</td><td>Fuhrmann</td><td>10021</td><td></td></tr><tr><td>结冷胶粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td>Phytagel</td></tr><tr><td>肝素（25,000 IE/5 mL）</td><td>LEO Pharma</td><td>15261203</td><td></td></tr><tr><td>过氧化氢（H₂O₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 30%)</td><td>卡尔·罗特</td><td>8070.2</td><td></td></tr><tr><td>注射器</td><td>B Braun</td><td>9161502S</td><td>Omnican F</td></tr><tr><td>氯胺酮（100 mg/mL）</td><td>bela-pharma</td><td>402581.00.00</td><td></td></tr><tr><td>光片显微镜系统</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>-</td><td>UltraMicroscope Blaze</td></tr><tr><td>鲁尔锁式注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>303172</td><td>BD Plastipak</td></tr><tr><td>磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>444-0572</td><td></td></tr><tr><td>Neo sCMOS 相机（4.2 MP）</td><td>Andor Technology</td><td>ZL41 细胞 4.2</td><td></td></tr><tr><td>目标</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-133-625</td><td>MI Plan 1.1x NA 0.1，WD 17.6 mm</td></tr><tr><td>多聚甲醛（PFA，4%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496</td><td>10% 甲醛，中性缓冲液</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Greiner Bio-One</td><td>632181</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>不含 MgCl₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>聚丙烯管（15 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>聚丙烯管（5 mL）</td><td>卡尔·罗斯</td><td>EKY9.1</td><td>黑色</td></tr><tr><td>聚丙烯管（50 mL）</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>小鼠心脏插管准备皿</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-4327</td><td>包含套管针</td></tr><tr><td>纯化的抗小鼠 CD31 抗体</td><td>Becton Dickinson</td><td>53369</td><td>克隆：MEC13.3</td></tr><tr><td>滚轴泵</td><td>Ismatec</td><td>ISM597-230</td><td></td></tr><tr><td>封口膜</td><td>贝米斯</td><td>PM-996</td><td>Parafilm</td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>Leica</td><td>S6D</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转仪</td><td>Heidolph</td><td>Polymax 1040</td><td></td></tr><tr><td>白光激光器</td><td>NKT Photonics</td><td>SuperK extreme</td><td>200 mW，480&amp;ndash;2400 nm</td></tr><tr><td>野生型小鼠品系</td><td>Janvier Labs</td><td>-</td><td>C57BL/6JRj</td></tr><tr><td>赛拉嗪（2%）</td><td>Ceva 动物保健</td><td>6324464.00.00</td><td></td></tr></tbody></table>

利用光片荧光显微镜对再灌注急性心肌梗死中心脏损伤与免疫反应进行同步三维分析

Simultaneous 3D Analysis of Cardiac Damage and Immune Response in Reperfused Acute Myocardial Infarction Using Light Sheet Fluorescence Microscopy

复杂细胞相互作用决定了再灌注急性心肌梗死（repAMI）期间功能性和结构性的组织重塑。这些过程表现出明显的空间分布特征，因为受损心肌可分为不同区域（损伤区、风险区（AAR）和远端区）。对这些区域进行三维（3D）可视化，对于分析常驻心肌细胞与浸润性免疫细胞之间的多种相互作用至关重要，有助于识别潜在的治疗靶点。本文介绍了一种可在repAMI后对心肌损伤区、AAR及浸润性免疫细胞（如中性粒细胞）进行同步且可自动化的3D可视化与定量分析的实验方案。该方案包括通过活体抗体介导标记心肌损伤区（CD31阴性）和中性粒细胞浸润（Ly6G+) 之后 离体 通过逆行抗体灌注可视化AAR，并结合无毒组织透明化技术用于光片荧光显微镜（LSFM）成像。该技术可实现对完整小鼠心脏中靶细胞（如浸润的免疫细胞）及损伤区域的空间分析，适用于心肌缺血再灌注损伤（repAMI）后的研究。在完成无毒组织透明化处理后，可进一步进行传统组织学和免疫组织化学分析，并结合计算机辅助的后期图像处理进行成像。该方法可在同一只小鼠心脏中实现多组信息的整合，提高数据的可靠性，对于repAMI这类高度复杂的损伤模型尤为重要。

利用光片荧光显微镜（LSFM）的本方法可同时分析再灌注急性心肌梗死（repAMI）后的风险区面积（AAR）、内皮损伤及中性粒细胞浸润。图1A展示了repAMI诱导后24小时C57BL/6J小鼠的活体及ex vivo抗体染色情况。在处死前10分钟，通过静脉注射针对心肌内皮损伤（AlexaFluor 790标记的抗CD31抗体）和中性粒细胞浸润（AlexaFluor 647标记的抗Ly6G抗体）的抗体。在充分清除血液后，通过逆行主动脉灌注AlexaFluor 546标记的抗CD31抗体对AAR进行染色，并将心脏在4 °C条件下用4%多聚甲醛（PFA）固定过夜。图1B进一步说明了用于LSFM成像的组织处理流程。固定后，心脏依次经梯度乙醇脱水，并使用过氧化氢和二甲基亚砜进行漂白以降低组织自发荧光。最后，使用ECi对完全脱水的组织进行折射率匹配，从而实现全器官LSFM成像。图1C展示了利用透明化的结冷胶块以增强器官稳定性，将透明化后的心脏正确放置于样品...

再灌注急性心肌梗死（repAMI）中心脏损伤的三维（3D）重建可实现对相关疾病影响模式的精确量化与共定位。本文提供了一种可自动化的光片引导成像方法，用于同时测量心脏损伤、风险区域以及免疫细胞反应。

复杂的细胞间相互作用决定了再灌注急性心肌梗死（repAMI）期间组织的功能性与结构性重塑。这些……

我们正在研究心肌梗死后免疫细胞与受损组织之间的相互作用。我们的目标是理解免疫反应并改善心脏功能。有研究提出，在心肌梗死后，三种主要的细胞成分——心肌细胞、其他细胞以及免疫细胞——必须通过多靶点策略同时进行调控。除了同时分析心脏损伤及其反应外，我们还能够对这些受损区域进行三维定位，而这一点在此前尚属未知。三维分析，尤其是在多重检测多种靶标时，为评估心肌梗死后细胞组成提供了更为可靠的方法。首先，将处死的小鼠置于体视显微镜下。使用精细剪刀打开胸腔，并在上腔静脉从肋骨框架通向颈部的出口附近进行切开。使用连接至滚轴泵的27号针头，通过右心房和左心房的开口原位灌注含有肝素的PBS缓冲液。通过观察心脏浅表血管影的逐渐消失以及肺和肝脏颜色变白，确认心脏血液已充分清除。使用镊子和剪刀切除心脏，同时保留至少五毫米的残余主动脉及周围肺组织，并将其转移至预先装有冰冻 PBS 和纱布的六厘米培养皿中。随后，剪除残余的肺组织、脂肪和血管组织，直至仅剩带有约五毫米主动脉的心脏。将心脏转移至用于主动脉插管的培养皿中，并将残余主动脉套入20号钝头不锈钢插管上。用5-0缝线将其固定在套管切口处。在用于诱导再灌注急性心肌梗死的位置，使用6-0缝线永久结扎左前降支动脉。通过插入的套管逆行注射400 µL含有20 µg小鼠NT CD31抗体的PBS溶液，该抗体标记有LexaFluor 546。小心地将套管从主动脉中抽出，并将心脏转移至含有10毫升4%多聚甲醛的15毫升聚丙烯反应管中。在4°C避光条件下静置过夜，不进行振荡。在室温避光条件下，用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）分三次洗涤固定后的心脏，每次10分钟，使用近垂直旋转方式在5毫升聚丙烯反应管内进行振荡。将固定的心脏置于5毫升50%乙醇（溶于去离子水中）中，在室温避光条件下脱水至少2小时，使用5毫升反应管并以接近顶部旋转的方式振荡。为漂白脱水后的心脏，将其转移至含有10毫升100%乙醇、5%二甲基亚砜和5%过氧化氢的15毫升反应管中，在4°C避光条件下孵育4小时，期间不进行振荡。将漂白后的心脏在5毫升100%乙醇中洗涤三次，每次12小时，于室温避光条件下进行，使用5毫升反应管并以接近顶部旋转的方式振荡。将心脏转移至含有4毫升肉桂酸乙酯的5毫升反应管中，在室温避光条件下静置孵育3天。将透明化的凝胶和胶块切割至合适大小，以稳定固定透明化后的心脏于显微镜样品架中。使用数值孔径为0.1、工作距离为17.6毫米的物镜进行图像采集。然后使用适当的激发和发射滤光片设置检测荧光信号。对于光片显微成像，选择数值孔径为0.079的光片，从而产生5微米厚的光片。将两个独立Z平面之间的距离设置为10微米。使用100%的光片宽度以实现对样本的均匀照明。本图展示了通过多通道抗体染色和自发荧光标记定位风险区域、内皮损伤及浸润性中性粒细胞的代表性心脏切片。风险区域通过逆向注射后CD31染色缺失来识别，内皮损伤通过静脉内CD31阴性来识别，而浸润的中性粒细胞则通过Ly6G阳性斑点（主要位于损伤区域附近）来识别。3D 渲染结果显示 AAR、内皮损伤与中性粒细胞簇之间存在重叠，提示存在区域特异性的免疫定位。定量分析显示，90.2% 的中性粒细胞位于 AAR 区域，而远端区域仅占 9.8%，表明炎症具有局部聚集特征。在 AAR 区域内，79.3% 的中性粒细胞位于内皮损伤区域之外，20.7% 位于损伤区域之内，提示中性粒细胞在损伤周围呈外周聚集分布。

simultaneous-3d-analysis-cardiac-damage-immune-response-reperfused

Research

科研

JoVE Journal

Medicine

医学

使用光片荧光显微镜同时分析再灌注性急性心肌梗死的心脏损伤和免疫反应 3D

本文介绍了一种深入了解脑部炎症反应复杂性的方法。我们描述了基于免疫荧光的实验方案，结合三维共聚焦分析，用于研究局灶性脑缺血小鼠模型中小胶质细胞/巨噬细胞表型标志物的共表达模式。...

实验性脑损伤中小胶质细胞/巨噬细胞极化标志物的三维共聚焦分析

本方案描述了一种将完整心脏心肌组织与磁共振成像（MRI）进行三维比对的新方法。该方法旨在对慢性猪心肌梗死模型中梗死边缘区的心肌内注射进行精确定量评估。...

三维全心心肌组织分析

在心脏中，分子事件协调着器官的电活动和收缩功能。本文介绍了一系列局部场荧光显微技术，可用于在完整心脏中记录细胞水平的变量。明确调控心脏功能的机制，对于理解心脏在病理状态下的工作方式至关重要。...

局部场荧光显微技术：在完整心脏中成像细胞信号

本文介绍了一种光片显微镜方法，用于在无菌性暴发性心肌炎小鼠模型中可视化心脏 CD45+ 白细胞浸润，该模型通过向 CD11c.DTR...

通过光片显微镜对暴发性心肌炎小鼠模型中白细胞浸润的定量可视化

本研究采用双侧照射光片荧光显微镜（LSFM）技术结合光学透明化方法，对小鼠心脏进行研究。...

用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

心肌细胞在损伤后的增殖是一个动态过程，需要来自非心肌细胞群体的多种细胞外信号协同作用。通过利用谱系示踪、被动透明化（passive...

通过透明化心脏三维成像捕获靶向细胞群体的心肌损伤反应

已开发并应用于成年小鼠心脏的一种优化的组织透明化方法。该方法旨在清除致密且具有自发荧光的心肌组织，同时保留由遗传报告基因策略标记的成纤维细胞的荧光信号。...

基于CLARITY优化的组织透明化技术用于小鼠健康与损伤心脏中三维成纤维细胞结构的研究

我们报告了一种通过结合组织转化和染色技术的新进展与轴向扫描光片显微镜的开发，实现小鼠全心脏介观重建的方法。...

小鼠全心介观光学成像

本方案介绍了一组关于肌节、钙离子及宏观几何结构的 来自主动收缩的心室小梁的数据...

离体心脏小梁收缩过程中的明场、荧光与光学相干断层成像同步观察 Ex Vivo

该方案利用先进的光片显微镜技术，结合改良的组织透明化方法，用于研究啮齿类动物心脏中复杂的结构，在理解心脏形态发生及重塑过程方面具有重要意义。...

光片成像揭示啮齿类动物心脏结构

本实验采用的2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）检测法引入了一种优化的TTC染色方案，可在显微分辨率下分析心肌损伤，生成高质量图像，从而在细胞水平上对梗死面积和心肌细胞活力进行准确可靠的评估。...

一种用于心肌损伤精确可靠分析的显微级氯化三苯基四氮唑检测法

了解光片荧光显微镜技术如何用于同时分析心肌梗死后的3D心脏损伤与免疫反应。该方法利用小鼠模型实现多靶点成像，为研究心肌修复机制提供新视角。

利用光片荧光显微镜对再灌注急性心肌梗死中心脏损伤与免疫反应进行同步三维分析

探索更多视频