利用光片荧光显微镜对再灌注急性心肌梗死中心脏损伤与免疫反应进行同步三维分析

我们正在研究心肌梗死后免疫细胞与受损组织之间的相互作用。我们的目标是理解免疫反应并改善心脏功能。有研究提出，在心肌梗死后，三种主要的细胞成分——心肌细胞、其他细胞以及免疫细胞——必须通过多靶点策略同时进行调控。

除了同时分析心脏损伤及其反应外，我们还能够对这些受损区域进行三维定位，而这一点在此前尚属未知。三维分析，尤其是在多重检测多种靶标时，为评估心肌梗死后细胞组成提供了更为可靠的方法。首先，将处死的小鼠置于体视显微镜下。

使用精细剪刀打开胸腔，并在上腔静脉从肋骨框架通向颈部的出口附近进行切开。使用连接至滚轴泵的27号针头，通过右心房和左心房的开口原位灌注含有肝素的PBS缓冲液。通过观察心脏浅表血管影的逐渐消失以及肺和肝脏颜色变白，确认心脏血液已充分清除。

使用镊子和剪刀切除心脏，同时保留至少五毫米的残余主动脉及周围肺组织，并将其转移至预先装有冰冻 PBS 和纱布的六厘米培养皿中。随后，剪除残余的肺组织、脂肪和血管组织，直至仅剩带有约五毫米主动脉的心脏。将心脏转移至用于主动脉插管的培养皿中，并将残余主动脉套入20号钝头不锈钢插管上。

用5-0缝线将其固定在套管切口处。在用于诱导再灌注急性心肌梗死的位置，使用6-0缝线永久结扎左前降支动脉。通过插入的套管逆行注射400 µL含有20 µg小鼠NT CD31抗体的PBS溶液，该抗体标记有LexaFluor 546。

小心地将套管从主动脉中抽出，并将心脏转移至含有10毫升4%多聚甲醛的15毫升聚丙烯反应管中。在4°C避光条件下静置过夜，不进行振荡。在室温避光条件下，用5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）分三次洗涤固定后的心脏，每次10分钟，使用近垂直旋转方式在5毫升聚丙烯反应管内进行振荡。

将固定的心脏置于5毫升50%乙醇（溶于去离子水中）中，在室温避光条件下脱水至少2小时，使用5毫升反应管并以接近顶部旋转的方式振荡。为漂白脱水后的心脏，将其转移至含有10毫升100%乙醇、5%二甲基亚砜和5%过氧化氢的15毫升反应管中，在4°C避光条件下孵育4小时，期间不进行振荡。将漂白后的心脏在5毫升100%乙醇中洗涤三次，每次12小时，于室温避光条件下进行，使用5毫升反应管并以接近顶部旋转的方式振荡。

将心脏转移至含有4毫升肉桂酸乙酯的5毫升反应管中，在室温避光条件下静置孵育3天。将透明化的凝胶和胶块切割至合适大小，以稳定固定透明化后的心脏于显微镜样品架中。使用数值孔径为0.1、工作距离为17.6毫米的物镜进行图像采集。

然后使用适当的激发和发射滤光片设置检测荧光信号。对于光片显微成像，选择数值孔径为0.079的光片，从而产生5微米厚的光片。将两个独立Z平面之间的距离设置为10微米。

使用100%的光片宽度以实现对样本的均匀照明。本图展示了通过多通道抗体染色和自发荧光标记定位风险区域、内皮损伤及浸润性中性粒细胞的代表性心脏切片。风险区域通过逆向注射后CD31染色缺失来识别，内皮损伤通过静脉内CD31阴性来识别，而浸润的中性粒细胞则通过Ly6G阳性斑点（主要位于损伤区域附近）来识别。

3D 渲染结果显示 AAR、内皮损伤与中性粒细胞簇之间存在重叠，提示存在区域特异性的免疫定位。定量分析显示，90.2% 的中性粒细胞位于 AAR 区域，而远端区域仅占 9.8%，表明炎症具有局部聚集特征。在 AAR 区域内，79.3% 的中性粒细胞位于内皮损伤区域之外，20.7% 位于损伤区域之内，提示中性粒细胞在损伤周围呈外周聚集分布。