Name: 来自小鼠乳腺肿瘤的癌症相关成纤维细胞作为分子和计算研究的工具 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 探索癌症相关成纤维细胞在乳腺癌进展中的作用机制，利用分子生物学、体外体内实验及计算方法分析肿瘤微环境。本研究结合转录组学和肿瘤类器官技术，揭示STAT3转录因子及其靶基因在CAF功能中的关键作用，为靶向治疗提供新策略。

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本工作由意大利癌症研究协会（AIRC，项目编号IG16930和IG24851，授予V.P.）；意大利大学与研究部（MIUR PRIN 2017和2022，授予V.P.）；列支敦士登Truus和Gerrit van Riemsdijk基金会向V.P.的捐赠；皮埃蒙特大区（Deflect项目）资助。A.S. 获得意大利癌症研究基金会（FIRC）博士后奖学金资助，L.A. 获得Umberto Veronesi基金会资助。

作者声明无竞争利益。

本研究中，我们介绍了小鼠CAFs永生化的优化方案，以及对其促肿瘤活性的表征方法 体外 和 体内我们并未根据标志物表达选择性地分离特定的CAF亚型，而是选择保留整个细胞群体以维持其异质性。对细胞群体进行整体功能表征，并分析其基因表达谱以捕捉其多样性。由于原代CAF在衰老前可传代的次数有限，因此永生化CAF对该研究至关重要。通过该方法获得的永生化细胞为研究多种CAF介导的现象（包括化疗耐药性）提供了有价值的工具，因其能够用于探究CAF如何影响癌细胞对不同治疗方式的反应。永生化细胞易于进行遗传操作，使其在功能研究中尤为有用。然而，应当认识到永生化可能改变细胞的表型和活性，因此我们建议对永生化CAF与其原代对应细胞进行充分比较，并定期评估其生长速率及CAF标志物的表达水平。在基因沉默实验中，可考虑采用可诱导而非稳定的沉默策略，其中pLKO-tetON Puro载体较为适用。43，而基于CRISPR的系统可用于基因敲除（pLenti-CRISPRv2）、基因干扰（CRISPRi，pLV-dCas9-KRAB）或基因激活（CRISPRa，pLV-dCas9-VP64...

乳腺癌（BC）是女性中最常见的恶性肿瘤，具有显著的分子异质性，不同的分子特征可指导诊断、治疗决策和预后评估。肿瘤微环境（TME）同样具有高度异质性，在肿瘤进展、免疫反应及治疗结局中发挥关键作用。
癌症相关成纤维细胞（CAFs）是肿瘤微环境（TME）中最丰富的细胞类型，也是肿瘤发展的关键调控因子。它们参与细胞外基质的沉积与重塑、血管生成、免疫逃逸以及耐药性1,2,3,4,5,6。CAFs通过直接的细胞-细胞接触、释放细胞外囊泡7以及分泌多种可溶性因子2,5，促进肿瘤生长、侵袭及治疗耐药8,9,10。事实上，与间质相关的基因表达特征对乳腺癌（BC）的进展和治疗反应具有预测价值，并与化疗耐药相关11,12,13,14。然而，尽管有大量证据表明CAFs是颇具潜力的治疗靶点，但针对这些细胞的临床试验大多未能成功15。其中一个主要挑战在于对CAFs调控肿瘤行为的分子机制仍了解有限。近年来，单细胞和空间转录组分析技术的进步加深了人们对乳腺癌中CAFs复杂性的认识16,17,18,19,20,21，使得研究人员能够鉴定出具有特定功能程序的不同CAF亚型16,22，进一步凸显了其异质性与可塑性23。
基因工程小鼠模型（GEMMs）是研究人类癌症的成熟模型，其中癌基因或肿瘤抑制基因被过表达或失活24,25,26,27与将肿瘤细胞移植到野生型小鼠体内的同系模型相比23,28，GEMMs 能更准确地模拟乳腺癌的多步骤进展过程以及癌细胞与肿瘤微环境之间的相互作用。然而，由于 CAFs 具有异质性，难以在不产生对其他间质或上皮成分脱靶效应的情况下靶向所有 CAF 亚型，因此在 GEMMs 中调控 CAFs 活性的操作颇具挑战性5结合GEMMs与互补性方法，例如 体外 CAF 操作可用于生成细胞模型，以开展功能缺失实验 体外 和 体内 然而，由于细胞衰老迅速发生，建立用于研究特定基因功能作用的稳定细胞模型仍然具有挑战性。
在此，我们介绍一种在CAFs中进行稳定基因功能缺失实验的可靠平台，随后进行功能分析 体外 和 体内 对工程化细胞进行分析和转录谱检测；该方法为解析癌相关成纤维细胞（CAF）表达基因在乳腺癌中的功能相关性提供了全面的策略，在特异性、可重复性和适应性方面优于现有方法。该方法还结合了一种新型的基于网络的工具，用于探索来自人类乳腺肿瘤的激光捕获显微切割间质和上皮组分的转录组，支持跨物种比较，并有助于从人类数据中生成科学假设。

<table><tbody><tr><td>1Kb plus DNA 标准分子量标记</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>833922</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>833924</td><td></td></tr><tr><td>乙酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>AgeI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3552</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>聚维酮碘</td><td>Meda Pharma</td><td>23907076</td><td></td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker 计数板&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>40443703</td><td></td></tr><tr><td>低温精细尖电灼器</td><td>Keeler</td><td>AX10339KL</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 锥形管</td><td>Sarstedt</td><td>62554502</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 锥形管</td><td>Sarstedt</td><td>62547254</td><td></td></tr><tr><td>Cryopure 2 mL 微量离心管</td><td>Sarstedt</td><td>72380992</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0775</td><td>室温储存，在通风橱中使用&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>100 mm 直径培养皿&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>833902</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 直径培养皿&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>833920</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>自制</td><td></td><td>室温储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>数显卡尺</td><td>Preciva</td><td>02-301-2</td><td></td></tr><tr><td>数码显微镜</td><td>Leica</td><td>DM6B</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s 改良 Eagle&amp;rsquo;s 培养基 (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>室温储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>胎牛血清 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>Sarstedt</td><td>703010255</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>Sarstedt</td><td>703030255</td><td></td></tr><tr><td>1000 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>Sarstedt</td><td>703060255</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>Sarstedt</td><td>703030265</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L 滤芯吸头</td><td>Sarstedt</td><td>703031255</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S Plus 0.20 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>831826102</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur S Plus 0.45 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>831826</td><td></td></tr><tr><td>精细剪刀</td><td>2Biol</td><td>1406009</td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>2Biol</td><td>1102412</td><td></td></tr><tr><td>遗传霉素</td><td>Gibco</td><td>10131035</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 转染试剂</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11668019</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>含 8 &amp;mu;m PET 膜的 Matrigel 侵袭小室&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354480</td><td></td></tr><tr><td>酶标仪（600 nm 吸光度）</td><td>Promega</td><td>GM3500</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>7269001</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 培养基</td><td>Gibco</td><td>31985047</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>多聚甲醛 (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>室温储存，在通风橱中使用</td></tr><tr><td>pBABE-neo largeTcDNA&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1780</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>pCL-Ampho</td><td>Novus Biological&amp;nbsp;</td><td>18746853</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>pCMV-R8.74</td><td>Addgene</td><td>22036</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>pCMV-VSVG&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（Pen Strepto，10,000 &amp;mu;g/mL）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>相差显微镜&amp;nbsp;</td><td>Olympus&amp;nbsp;</td><td>BX42</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液&amp;nbsp;(PBS)</td><td>自制</td><td></td><td>室温储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>pLKO.1-Puro&amp;nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10878</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8920</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>来自&amp;nbsp;Streptomyces alboniger 的嘌呤霉素二盐酸盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart 缓冲液&amp;nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>B6004</td><td>储存于 -20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>啮齿类动物剃毛器</td><td>Aesculap</td><td>GT416</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 培养基 (RPMI)</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td>4 &amp;deg;C 储存，在生物安全柜中使用</td></tr><tr><td>圆头吸水棉签</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z744127</td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Gima</td><td>27041</td><td></td></tr><tr><td>Secura 半微量电子天平</td><td>Sartorius</td><td>SECURA125-1S</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 血清移液管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861254001</td><td></td></tr><tr><td>2 mL 血清移液管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861252001</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 血清移液管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861256001</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 血清移液管&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>861253001</td><td></td></tr><tr><td>5-0 缝合线</td><td>Ethicon</td><td>1866G</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 注射器</td><td>Pentaferte</td><td>00202250E14</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 注射器</td><td>Pentaferte</td><td>00202250E12</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 胰岛素注射器 1 mL</td><td>Braun</td><td>9151125S</td><td></td></tr><tr><td>组织粘合剂</td><td>3M Vetbond</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Transwell 小室，8 &amp;micro;m 孔径&amp;nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Transwell Matrigel 小室，8 &amp;micro;m 孔径&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354480</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA（0.5%），无酚红</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 离心浓缩管，截留分子量 10,000 Da&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z614602</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞作为分子与计算研究的工具

Cancer-Associated Fibroblasts from Mouse Mammary Tumors as Tools for Molecular and Computational Studies

大量研究已证实肿瘤微环境（TME）在乳腺癌（BC）生长和侵袭性中的关键作用。癌症相关成纤维细胞（CAF）是TME中的主要细胞成分，通过与肿瘤细胞及其他基质细胞之间复杂的相互作用，在响应肿瘤来源的激活信号时显著影响TME的行为。小鼠模型被广泛用于研究CAF在乳腺癌进展中作用的潜在机制，因其可评估内源性TME以及通过同源异种移植研究来分析免疫系统的参与。本文介绍了一系列方法，用于培养来源于乳腺癌的CAF、调控基因表达，并通过体外（in vitro）和体内（in vivo）手段评估其促肿瘤功能。我们还描述了CAF基因表达谱和转录组分析的实验方案，以及一种利用公开的批量RNA测序（bulk RNA-seq）数据推断原发性肿瘤中转录特征的计算流程。此外，我们介绍了一种用户友好的基于网页的工具，用于分析激光捕获显微切割获得的乳腺癌肿瘤中基质和上皮组分的转录组。最终，这些方法可为驱动CAF-肿瘤相互作用的分子机制提供有价值的见解，并有望发现新的治疗靶点。

体外 CAF活性评估 
采用根据步骤3制备的永生化癌相关成纤维细胞（iCAFs），研究乳腺肿瘤来源的癌相关成纤维细胞（CAFs）对乳腺癌（BC）侵袭性特征的贡献。按照步骤6所述方法对iCAFs进行超激活处理，随后在sDMEM中饥饿培养以收集其条件培养基（CM），并将该CM用于处理4T1细胞48小时（见步骤7.1）。此处理之后进行 体外 功能实验 图1 结果显示，与对照组的无血清培养基（CTR）相比，经 s.a. iCAFs CM 处理后，4T1 细胞的增殖显著增强。这种增殖的增加通常在 24 小时内开始，并在随后的几天内持续上升。在这些实验中，至关重要的是在使用条件培养基（CM）处理前，优化接种细胞数量以及培养基中的血清百分比。s.a. iCAFs CM 还显著增强了 4T1 细胞的迁移和侵袭能力。经 CM 处理后，4T1 细胞的迁移能力提高了一倍，而在侵袭方面也观察到虽较温和但仍具有统计学意义的增加图1)...

本方案概述了培养、操作和分析小鼠CAFs的方法，包括 体外/体内 功能分析、转录组学和计算分析。此外，本文还描述了一个基于网络的平台，该平台旨在分析从一组人乳腺癌肿瘤中激光捕获显微切割分离的间质和上皮组分的公开转录组数据。

大量有力的研究已证实肿瘤微环境（TME）在乳腺癌（BC）生长和侵袭性中的关键作用。

我们的研究利用分子生物学、体外实验、体内实验以及计算方法，探究癌症相关成纤维细胞如何影响乳腺癌的进展，旨在解析其分子机制并鉴定潜在的治疗靶点。近年来出现的新技术，如肿瘤类器官、单细胞测序和空间转录组学，正在改变我们对肿瘤微环境的建模方式，使我们能够更精确、动态地理解肿瘤间质或微环境中的细胞相互作用。癌症研究仍面临微环境异质性以及间质-上皮复杂性的挑战。通过体外实验和小鼠模型进行切除，可揭示适用于治疗干预的关键分子机制。我们已确立转录因子STAT3及其靶基因在介导乳腺肿瘤中癌症相关成纤维细胞的支气管生成功能中的关键作用。我们将利用患者来源的支架，以在人类体系中验证研究发现的生物学和临床相关性，包括药物耐药性的诱导。首先，准备实验所需的试剂和实验耗材。将700微升添加了补充物的DMEM培养基加入24孔板的每个孔中。将8微米的Transwell小室插入每个孔内，用于侵袭实验时，小室需预先包被生物活性基质；用于迁移实验时，则使用未包被的小室。然后，将培养板转移至37摄氏度培养箱中平衡。现在，取一个100毫米培养皿，其中含有经永生化肿瘤相关成纤维细胞条件培养基预处理48小时的4T1细胞。用移液器加入1毫升5毫摩尔的EDTA溶液至培养皿中，以解离细胞。然后，向培养皿中加入 5 mL 完全 DMEM 培养基。将细胞悬液转移至 15 mL 圆锥形离心管中。离心该离心管以沉淀细胞。将沉淀重悬于添加了补充物的DMEM培养基中。使用血细胞计数板对细胞进行计数。取100微升制备好的细胞悬液，加入每个Transwell小室的上室中。作为铺板对照，取100微升相同的细胞悬液接种至含有500微升完全培养基的24孔板中。使用细头标记笔标记每个插入式培养小室的上侧。用镊子将插入式培养小室浸入装有PBS的50毫升锥形管中进行洗涤。然后，使用棉签小心清洁Transwell的内部。在通风橱中，将每个插入物放入700微升4%多聚甲醛中孵育。随后，将插入物在700微升PBS中洗涤三次。静置干燥10分钟后，将小室置于700微升0.1%结晶紫溶液中，室温孵育10分钟。用镊子将小室在含有双蒸水的50毫升锥形管中浸没3次。用棉签擦干内表面。成像前可在室温下保存样品长达三天。使用相差显微镜，用10倍物镜拍摄一张图像以观察大部分孔表面。使用20倍物镜从膜的五个独立区域获取图像。加入乙酸以溶解结晶紫。对于孔板，每孔加入100微升10%乙酸。在室温下于摇床上以10分钟时间混匀。对于Transwell小室，将其底部朝上放置。在表面加入50微升乙酸，并用移液器吹打混合，直至染料完全溶解。将每个样品中溶解的50微升结晶紫转移至96孔板中，用于光谱分析。注射后第21天，在通风橱内使用手术剪刀打开已处死的荷瘤BALB/c小鼠的胸腔。去除下颌下区域的皮肤和唾液腺，以清晰暴露气管。准备一支装有4%多聚甲醛的22号针头注射器。将针头

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来自小鼠乳腺肿瘤的癌症相关成纤维细胞作为分子和计算研究的工具

在本报告中，我们展示了一种从小鼠乳腺中分离和培养供体细胞的系统，并将这些细胞原位移植到受体小鼠体内，以分析乳腺肿瘤发生过程中间质与上皮之间的相互作用。...

C57BL/6J小鼠乳腺基质细胞与癌细胞移植

富含肌成纤维细胞的癌相关成纤维细胞（CAFs）存在于肿瘤间质中，在驱动肿瘤进展中发挥重要作用。我们建立了一种共移植肿瘤异种移植模型，用于从人乳腺成纤维细胞实验性地生成CAFs。本方案描述了如何建立获得促肿瘤发生能力的CAF肌成纤维细胞。...

从人乳腺成纤维细胞实验性生成癌相关成纤维细胞（CAFs）

癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过促进细胞增殖、血管生成和炎症的信号通路，促进肿瘤的发生、生长和进展。本文介绍一种利用细胞分选技术，以PDGFRα作为表面标志物，从新鲜的小鼠和人类组织中分离出纯化的正常成纤维细胞和CAFs群体的方法。...

通过荧光激活细胞分选（FACS）从新鲜组织中分离正常成纤维细胞和癌相关成纤维细胞

本文介绍了研究肺泡巨噬细胞在癌症转移中功能的模型和方法。为了阐明这些细胞在转移过程中的作用，采用了同源性乳腺癌（4T1）模型，并结合使用氯膦酸盐脂质体耗竭肺泡巨噬细胞。...

研究肺泡巨噬细胞在乳腺癌转移中的作用

提供了一种共注射癌细胞和成纤维细胞并随时间监测肿瘤生长的实验方案。该方案可用于理解成纤维细胞作为肿瘤生长调控因子的分子基础。...

一种用于研究肿瘤相关成纤维细胞在肿瘤生长中作用的小鼠模型

本文旨在提供一种从三阴性乳腺癌同源小鼠模型中分离和培养原代癌症相关成纤维细胞的实验方案，并介绍其在针对肿瘤微环境的新型纳米颗粒临床前研究中的应用。...

从小鼠同源性乳腺癌模型中分离原代癌症相关成纤维细胞用于靶向纳米颗粒研究

采用肺腺癌细胞、成纤维细胞和单核细胞制备多细胞三维肿瘤球体，随后从这些球体中分离出肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）。将分离得到的CAFs与正常成纤维细胞进行比较，通过检测线粒体膜电位、活性氧水平及酶活性来评估线粒体功能状态。...

评估从三维多细胞肺癌球体中分离出的肿瘤相关成纤维细胞的线粒体健康状况

我们建立了一种方法，可成功地将原本以整体封片方式固定的乳腺组织进行取材、处理、切片和染色，用于组织病理学评估。该方法可能促进在生殖和发育毒性试验指南研究中对乳腺腺体整体封片的采集与评估。...

切片乳腺组织整体标本以识别病灶

本方案描述了一种简单且实用的方法，用于保存外周血和血清/血浆，以便进行后续分析，如单核苷酸多态性（SNP）检测和ELISA实验。...

干燥血液和血清斑点作为评估癌症生物标志物样本储存的有用工具

本实验方案的目的是建立一种三维体外模型，用于在类似肿瘤组织的环境中研究癌相关成纤维细胞（CAFs）的分化过程，该模型可应用于多种分析系统，如免疫荧光、转录分析和活细胞成像。...

一种更接近生理条件的三维球体模型用于癌相关成纤维细胞分化与侵袭的体外研究

探索癌症相关成纤维细胞在乳腺癌进展中的作用机制，利用分子生物学、体外体内实验及计算方法分析肿瘤微环境。本研究结合转录组学和肿瘤类器官技术，揭示STAT3转录因子及其靶基因在CAF功能中的关键作用，为靶向治疗提供新策略。

小鼠乳腺肿瘤来源的癌症相关成纤维细胞作为分子与计算研究的工具

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