前列腺癌相关成纤维细胞的分离、培养和表征

我们的目标是了解癌症相关成纤维细胞促进前列腺癌肿瘤进展的机制，目标是中和这种串扰作为一种治疗策略。在使用肿瘤和基质细胞通过各种作获得的 3D 类器官中，可以评估具有不同特性的不同 CAF 群体。我们的协议允许为这些目的可靠地生成 CAF。

主要挑战是从同一患者微环境中可靠分离肿瘤和正常细胞、异质性、缺乏特定 CAF 标志物、CAF 的可塑性以及概括 TME 复杂性的有限体外模型。通过类似的方法，我们表征了转录因子 STAT3 及其靶基因在小鼠乳腺癌 CAF 中的基本促肿瘤作用，证明了它们作为治疗靶点的疗效。使用少量组织从前列腺癌患者身上获得的根治性前列腺切除术标本的肿瘤和邻近正常区域的最佳分离成纤维细胞。

首先，在第一天称量天平上的组织样本以分离成纤维细胞。使用无菌镊子，将组织转移到六厘米的培养皿中。在四毫升冰冷的PBS中洗涤组织两次，在四毫升冰冷的完全DMEM中洗涤组织两次。

现在，将组织转移到冰上的六厘米板中。在板中加入一毫升补充抗生素的DMEM。然后用剪刀或刀片将组织切碎成小于一平方毫米的碎片。

将切碎的组织转移到含有 5 毫升冰冷完整 DMEM 的 15 毫升锥形管中。然后将悬浮液在754g下在4摄氏度下离心5分钟。使用 10 毫升移液器去除上清液。

将沉淀重悬于五毫升冰冷的完全DMEM中，然后再次离心。除去上清液后，将沉淀重悬于胶原酶II溶液中。将悬浮液转移到 1.5 毫升微管中。

用石蜡薄膜密封微管。然后将它们置于 37 摄氏度进行过夜消化，并连续摇晃 8 至 12 小时。第二天，将消化的样品转移到 15 毫升锥形管中。

移液5毫升冰冷的完全DMEM以灭活胶原酶。然后将悬浮液在754g下在4摄氏度下离心5分钟。移出上清液后，将沉淀重悬于一毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA中。

在 37 摄氏度下孵育五分钟，偶尔摇晃。接下来，将一毫升新鲜制备的DNase I溶液移液到样品中并充分混合。离心并除去上清液后，将沉淀重悬于五毫升冷完全DMEM中并再次离心。

将所得细胞重悬于补充有20%胎牛血清的完整DMEM中。将细胞接种并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳和 95% 湿度孵育至少三天。三天后，检查细胞的形态和活力。

一旦细胞达到汇合，将它们传代到含有完整DMEM和20%胎牛血清的10厘米培养皿中。在 12 孔板中以 70% 汇合度对癌症相关成纤维细胞或正常成纤维细胞进行平板分析。第二天，在无菌条件下将0.45克低熔点琼脂加入50毫升锥形管中的12.5毫升PBS中。

使用微波炉溶解混合物。将琼脂溶液冷却至37摄氏度。然后用预热的完全DMEM以1比4的比例稀释以制备工作溶液。

从 12 孔板中吸出培养基。将 500 微升工作琼脂溶液移液到每个孔中。在4摄氏度下孵育20分钟，使琼脂凝固。

同时，将剩余的琼脂溶液保持在37摄氏度。胰蛋白酶消化肿瘤细胞并制备每毫升20， 000个细胞的细胞悬液。混合等体积的肿瘤细胞悬液和琼脂溶液，以获得7毫升的最终体积，每个条件占3个技术重复。

上下移液多次，确保混合均匀。然后在每个孔的固化基层顶部分配 500 微升含有约 5， 000 个细胞的这种混合物。让琼脂在4摄氏度下凝固20分钟后，向每个孔中加入一毫升完整的DMEM。

每隔一天更换一次培养基，从孔边缘轻轻吸出并将新鲜培养基添加到中心。孵育直至菌落变得容易看到。一旦可见菌落，丢弃培养基。

然后用 200 微升硝基蓝四唑氯化物溶液对菌落进行染色。在加湿的培养箱中以37摄氏度孵育过夜。第二天，丢弃染色液。

使用体视显微镜获取染色菌落的图像。成功分离出纯成纤维细胞。在许多情况下，特别是在早期传代时，与正常成纤维细胞相比，癌症相关成纤维细胞表现出更像纺锤体的形态。

定量分析证实，用癌症相关成纤维细胞条件培养基处理的 DU145 细胞在 120 小时内的增殖显着高于用正常成纤维细胞条件培养基处理或未处理的细胞。与对照组相比，直接与癌症相关成纤维细胞和正常成纤维细胞共培养的 DU145 细胞在 96 小时内也显示出增殖增加。相应的生长曲线表明，随着时间的推移，与癌症相关和正常成纤维细胞共培养导致 DU145 增殖的类似增加。

条件培养基对 DU145 增殖的影响在癌症相关成纤维细胞和正常成纤维细胞对之间有所不同，早期传代对显示出明显比后期更强的影响。在软琼脂菌落形成测定中，与对照组相比，癌症相关和正常成纤维细胞都增加了 DU145 菌落的数量和大小，表明锚定非依赖性生长增强。由于技术问题而形成的分离成纤维细胞层阻止了某些重复中的菌落形成。

单独条件培养基不能促进 DU145 细胞中锚定非依赖性集落的形成。