前列腺癌相关成纤维细胞的分离、培养与表征
2025年8月1日
本方案提供了从根治性前列腺切除术标本中分离、扩增和永生化成纤维细胞的完整操作流程。此外，还介绍了利用条件培养基处理和共培养技术评估成纤维细胞与肿瘤细胞之间相互作用功能效应的实验方法。
我们的目标是阐明癌症相关成纤维细胞（CAF）在前列腺癌中促进肿瘤进展的作用机制，并致力于通过阻断这种细胞间串扰来开发治疗策略。通过使用肿瘤细胞和间质细胞在不同干预条件下构建的三维类器官，可以评估具有不同特性的CAF亚群。本方案可稳定地生成适用于上述研究的CAF细胞。
主要挑战在于从同一患者的微环境中可靠地分离肿瘤细胞和正常细胞、肿瘤异质性、缺乏特异性的癌相关成纤维细胞（CAF）标志物、CAF的可塑性，以及现有体外模型难以充分模拟肿瘤微环境（TME）的复杂性。通过类似的方法，我们阐明了转录因子STAT3及其靶基因在小鼠乳腺癌CAF中的关键促肿瘤作用，并证实其作为治疗靶点的有效性。本研究采用少量组织，从前列腺癌患者根治性前列腺切除标本的肿瘤组织及邻近正常区域中，实现了成纤维细胞的高效分离。
首先，在第一天使用天平称量组织样本，以进行成纤维细胞的分离。用无菌镊子将组织转移至6厘米培养皿中。先后用4毫升冰浴PBS和4毫升冰浴完全DMEM各清洗组织两次。
现在，将组织转移至一个置于冰上的六厘米培养皿中。向培养皿中加入一毫升添加了抗生素的DMEM培养基。然后使用剪刀或刀片将组织剪碎成小于一平方毫米的碎片。
将切碎的组织转移至含有5毫升冰冻完全DMEM的15毫升锥形管中。然后在4°C下以754 ×g离心5分钟。使用10毫升移液管吸除上清液。
将沉淀重悬于5毫升冰上预冷的完全DMEM培养基中，再次离心。去除上清液后，将沉淀重悬于II型胶原酶溶液中。将悬液转移至1.5毫升微量离心管中。
用石蜡膜密封微量离心管，然后在37摄氏度下孵育过夜，持续振荡消化8至12小时。次日，将消化后的样品转移至15毫升锥形管中。
用移液器加入5毫升冰上预冷的完全DMEM以灭活胶原酶。随后在4°C下以754 ×g离心5分钟。弃去上清液后，将沉淀物重悬于1毫升0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液中。
在37摄氏度下孵育五分钟，期间偶尔振荡。接着，向样品中加入一毫升新鲜配制的DNase I溶液，充分混匀。离心后弃去上清液，将沉淀物重悬于五毫升冷的完全DMEM中，再次离心。
将所得细胞重悬于添加了20%胎牛血清的完全DMEM培养基中。接种细胞，并在37°C、5%二氧化碳和95%湿度条件下培养至少三天。三天后，观察细胞的形态和活力。
待细胞达到汇合状态后，将其传代至含有添加20%胎牛血清的完全DMEM培养基的10厘米培养皿中。将肿瘤相关成纤维细胞或正常成纤维细胞以70%汇合度接种于12孔板中。次日，在无菌条件下，将0.45克低熔点琼脂加入含有12.5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）的50毫升锥形管中。
使用微波炉溶解该混合物。将琼脂溶液冷却至37摄氏度。然后与预热的完全DMEM培养基按1:4的比例稀释，以制备工作溶液。
从12孔板中吸除培养基。用移液器将500微升工作浓度的琼脂溶液加入每个孔中。在4摄氏度下孵育20分钟，使琼脂凝固。
同时，将剩余的琼脂溶液保持在 37 摄氏度。对肿瘤细胞进行胰蛋白酶消化，并制备浓度为每毫升 20,000 个细胞的细胞悬液。取等体积的肿瘤细胞悬液与琼脂溶液混合，得到最终体积为 7 毫升的混合液，以满足每种条件设置三个技术重复的要求。
反复吹打数次以确保混合均匀。然后在每个孔中已凝固的基底层上方加入500 µL含有约5,000个细胞的混合液。在4 °C条件下静置20分钟使琼脂凝固后，向每孔加入1 mL完全DMEM培养基。
每隔一天更换一次培养基，从孔的边缘轻轻吸出旧培养基，并向孔中央加入新鲜培养基。继续培养至克隆清晰可见。当克隆可见后，弃去培养液。
然后用 200 微升氯化硝基蓝四唑溶液对菌落进行染色。在湿润的培养箱中 37 摄氏度孵育过夜。次日，弃去染色液。
使用体视显微镜获取染色菌落的图像。成功分离出纯的成纤维细胞。在许多情况下，尤其是早期传代时，癌相关成纤维细胞相较于正常成纤维细胞表现出更明显的梭形形态。
定量分析证实，经癌相关成纤维细胞条件培养基处理的DU145细胞在120小时内增殖水平显著高于经正常成纤维细胞条件培养基处理或未处理的细胞。与癌相关成纤维细胞和正常成纤维细胞直接共培养的DU145细胞在96小时内相较于对照组也显示出增殖增加。相应的生长曲线表明，与癌相关成纤维细胞及正常成纤维细胞共培养均随时间推移对DU145细胞增殖产生相似的促进作用。
条件培养基对DU145细胞增殖的影响在不同癌相关成纤维细胞与正常成纤维细胞配对样本中存在差异，早期传代的成纤维细胞对DU145细胞的影响显著强于晚期传代样本。在软琼脂克隆形成实验中，与对照组相比，癌相关成纤维细胞和正常成纤维细胞均增加了DU145克隆的数量和大小，表明其锚定非依赖性生长能力增强。由于技术问题导致成纤维细胞层脱落，部分重复实验中克隆形成受到抑制。
单独使用条件培养基不能促进DU145细胞的非贴壁依赖性集落形成。
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概述
本方案概述了一种从根治性前列腺切除术标本中分离、扩增和永生化癌症相关成纤维细胞（CAFs）的方法。同时详细描述了用于评估成纤维细胞与肿瘤细胞之间功能相互作用的实验方法。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 肿瘤学
- 细胞生物学
背景
- 癌症相关成纤维细胞在前列腺癌的肿瘤进展中起着重要作用。
- 不同的癌症相关成纤维细胞群体表现出不同的特性。
- 挑战包括从复杂的肿瘤微环境中分离细胞。
- 现有模型可能无法完全模拟肿瘤微环境。
研究目的
- 了解癌症相关成纤维细胞（CAFs）促进前列腺癌进展的机制。
- 阻断成纤维细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，作为一种潜在的治疗策略。
- 为实验目的生成可靠的癌症相关成纤维细胞（CAFs）。
使用的方法
- 从肿瘤及邻近正常组织中分离成纤维细胞。
- 利用三维类器官评估癌相关成纤维细胞（CAF）特性。
- 对癌相关成纤维细胞中转录因子（如STAT3）进行表征。
- 检测成纤维细胞与肿瘤相互作用功能效应的实验方法。
主要结果
- 从前列腺癌标本中稳定生成癌相关成纤维细胞（CAFs）。
- 鉴定在肿瘤进展中具有不同作用的 distinct CAF 亚群。
- 揭示 STAT3 在 CAFs 中的促肿瘤作用。
- 为前列腺癌治疗提供潜在治疗靶点的见解。
结论
- 该方案可实现对前列腺癌中癌症相关成纤维细胞（CAFs）的研究。
- 深入了解CAFs与肿瘤之间的相互作用可能有助于开发新的治疗方法。
- 尚需进一步研究以应对CAFs表征中的各项挑战。
常见问题
行业重要性概述
可靠地分离和表征前列腺癌相关成纤维细胞（CAFs）及其相应的正常对照细胞，有助于系统性地降低间质对肿瘤进展贡献的机制性风险。这一成对研究体系可提高靶点验证以及肿瘤-间质相互作用功能研究的可预测性，直接影响早期发现和转化研究的关键节点。该方法为评估不同肿瘤研究项目中由CAFs驱动的致癌机制及治疗靶向性提供了可重复使用的平台。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 能够对同一患者的癌相关成纤维细胞（CAFs）与正常成纤维细胞进行直接比较，实现可靠的靶点验证。
- 支持对影响肿瘤细胞增殖和迁移的基质因子进行机制性风险评估。
- 有助于在肿瘤微环境中对候选靶点（如STAT3）进行功能评价。
- 提供配对实验系统，以阐明特定信号通路在肿瘤发生中的作用贡献。
筛选与检测方法开发
- 提供经过验证的原代细胞系统，用于下游功能检测和化合物筛选。
- 支持可重复的共培养和条件培养基实验，以定量分析肿瘤细胞反应。
- 支持锚定非依赖性生长和增殖检测指标的标准化，适用于筛选工作流程。
- 可在评估针对基质相互作用的多种治疗假设时实现扩增和重复使用。
转化与临床前研究
- 将体外研究结果与疾病相关的间质生物学相结合，推动转化生物标志物的探索。
- 支持从发现到针对癌症相关成纤维细胞（CAF）干预措施的临床前验证的连续性研究。
- 通过量化间质对肿瘤发生表型的影响，支持基于风险调整的推进决策。
- 揭示CAF驱动肿瘤发生的机制，为临床前模型优化提供理论依据。
流程与工作流整合
该方法通过实现对前列腺癌及其他潜在肿瘤类型中基质靶点的假设验证、功能筛选和转化验证，融入了从发现到临床前研究的连续过程。
- Discovery Biology：支持对癌症相关成纤维细胞（CAF）介导的肿瘤细胞行为及通路激活效应进行无效假设检验。
- Screening：为检测方法开发提供定量的细胞增殖和非贴壁依赖性生长输出结果。
- Analytics：可在多种条件下对配对的癌症相关成纤维细胞与正常成纤维细胞效应进行统计学比较。
- Translational Research：将体外机制研究结果与疾病相关的间质生物学相衔接，以实现生物标志物的匹配。
- Enterprise Reuse：建立标准化、可重复使用的平台，用于在多个肿瘤学项目中评估间质靶点。
运营与企业影响
- 科学价值：提高对间质靶点验证的预测可信度，并减少肿瘤-间质相互作用中的机制模糊性。
- 操作价值：通过使用原代人源细胞增强功能性检测的标准化、可重复性和可扩展性。
- 战略价值：通过明确间质在肿瘤进展中的作用，改善决策流程中的立项或终止决策，并提升资本使用效率。
- 项目组合影响：实现对癌症相关成纤维细胞（CAF）靶向及间质调节治疗策略的风险校准优先排序。
实施注意事项
- 需要具备原代细胞分离、培养及功能检测执行方面的专业知识。
- 需要获取患者来源的组织样本以及相应的分析基础设施。
- 需要跨团队对实验方案进行标准化，以确保可重复性和数据可比性。
- 根据间质异质性，可能需要针对其他肿瘤类型或模型系统进行适应性调整。
- 技术局限性包括成纤维细胞的可塑性、缺乏通用的癌相关成纤维细胞（CAF）标志物，以及体外模型的复杂性。
