使用长读长测序技术进行扩增子测序
2025年8月29日
该协议针对使用长读长测序平台对 结核分枝 杆菌中 18 个耐药区域进行靶向深度测序进行了优化，然后使用专为长读长数据设计的结核病特异性生物信息学管道进行分析。
我研究便携式长读长测序是否能在资源有限的环境中以与金标准方法相当的准确率提供结核病耐药性易感结果，推动结核病诊断的普及和高质量。利用靶向下一代测序作为耐药结核病诊断工具，直接从临床样本中提供全面的耐药性剖析，无需生物信息学专业知识。我们采用长读长测序的方案有望提供比实时耐药检测更快的周转时间、更简单的工作流程，促进全面的结核病诊断，并在资源有限且基础设施有限的环境中增强疫情追踪。
首先，根据浓度计算每个扩增子样品的100纳克，并将所需体积转移到干净的PCR管中。要确定样品中扩增子的总质量，请使用给定的公式。使用无核酸酶水将每个样品的总体积调整为12.5微升。
通过移液机上下搅拌10次，并在微离心机中短暂旋转样品，轻柔混合。接着，向每个样品加入1.75微升末端修复和腺苷酸化反应缓冲液，随后加入0.75微升末端修复和腺苷酸化酶混合物。混合并旋转样品后，将管子放入热循环器中，温度为25摄氏度，冷却30分钟，随后在65摄氏度加热30分钟。
对于原生条码连接，将屏幕上显示的组分添加到新的PCR管中。通过移液轻柔混合反应，并用微型离心机短暂旋转。接着，每根管子加入一微升EDTA。
然后彻底搅拌，像前面展示的那样短暂旋转。将条码样本拉入1.5毫升微离心管。通过漩涡，DNA清理珠，使其完全重新悬浮，并增加体积，体积是样本体积的0.7倍。
将珠状样品溶液混合，在室温的Hula搅拌机上孵育10分钟。接下来，为制备两毫升80%乙醇，将1,600微升纯乙醇与400微升无核酸酶水混合。将管子放在磁性架上，放置五分钟，直到洗脱液变得清澈无色。
然后，在不扰动沉淀的情况下取出并丢弃上清液。用700微升新制备的80%乙醇清洗珠子，并短暂离心管。将管子放在磁性机架上后，去除残留的乙醇。
现在，把管子从磁性机架上取下。将珠子轻轻弹动，重新悬浮在35微升无核酸酶水中，并在37摄氏度下孵育10分钟。将管子放回磁性架，直到洗出液变得透明且无色。
然后，将35微升洗脱液转移到一个干净的1.5毫升微离心管中，以便进一步使用。接头连接时，将给定组分混合在1.5毫升低结合微离心管中。短暂离心管，并在室温下孵育20分钟。
漩涡，DNA清理珠，使其完全重新悬浮。在管子中加入20微升珠子，轻轻搅拌。在室温下用Hula搅拌机孵育10分钟。
然后将管子放在磁性架上，沉淀出珠子，并吸取上清液而不扰动沉淀。加入125微升短片段缓冲液，轻轻弹动管子以重新使珠子悬浮。短暂离心，然后将管子放回磁性机架。
珠子沉淀后再次抽取上清液。现在，将管子从磁性架上取下，通过轻柔移液或弹动将珠子重新悬浮在15微升的洗脱缓冲液中。短暂离心管收集内容物，然后在37摄氏度孵育10分钟以洗脱DNA。
将管子放在磁性架上，直到洗脱液透明无色。然后，抽取15微升洗脱液，转移到一个干净的1.5毫升微型离心管中。准备流细胞引水溶液时，需充分混合所给成分。
打开流速槽的引气口，吸入约20微升缓冲液以去除气泡，然后在不引入气泡的情况下将800微升的引气混合液注入进口。准备DNA文库时，请彻底混合屏幕上显示的成分。轻轻掀开流体的样品口盖，将200微升的引气混合液注入引水口，且不引入气泡。
混合制备好的DNA文库后，将75微升文库滴入测序流细胞样本端口。关闭流样单元样品口盖，确保塞子稳固进入样品口，然后紧闭引水口。凝质电泳确认了几乎所有样品的扩增子完整性，但样本89和136的通道显示出淡弱或缺失的带状。
样本89和136的扩增子浓度不足，因此被排除在长读序列测序之外。在所有靶向基因中，长读长和短读长平台均实现了较高的覆盖深度，EIS基因平均值最高，RRS基因覆盖深度最低。尽管覆盖深度差异较大，两个平台在所有抗性相关基因中均保持了99.9%的高覆盖范围。
乙胺丁醇、氟喹诺酮、卡那麦素、阿米卡辛和卡普霉素的耐药性变异在短读长测序平台上均100%一致。无论采用哪种测序方法，均未发现利奈唑胺、贝达喹啉和氯非齐明的耐药相关突变。链霉素耐药检测显示平台间的一致性较低，仅为71.43%。
关键基因rpoB、katG/fabG1/ahpC/inhA、fabG1/inhA和pncA的检测灵敏度在不同平台间介于89.47%至96.77%。
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概述
本研究调查了在资源有限的环境中使用便携式长读长测序来确定耐药结核病（TB）的药物敏感性。该协议旨在提供与黄金标准方法相当的准确结果，提高TB诊断的可及性。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 基因组学
- 传染病学
背景
- 耐药结核病是一个重大的全球健康挑战。
- 传统诊断方法在资源贫乏的环境中可能受到限制。
- 长读长测序在准确性和周转时间上提供了潜在优势。
- 生物信息学专业知识常常是有效诊断的障碍。
研究目的
- 评估长读长测序在TB诊断中的有效性。
- 从临床样本中提供全面的耐药性概况。
- 简化药物耐药性检测的工作流程。
使用的方法
- 针对18个药物耐药区域的目标下一代测序。
- 使用结核病特异性生物信息学管道。
- 样品制备涉及精确测量扩增子。
- 调整样品体积以获得最佳测序结果。
主要结果
- 长读长测序展示了与黄金标准相当的准确性。
- 相比传统方法，实现了更快的周转时间。
- 该协议促进了全面的TB诊断。
- 在资源有限的环境中，实现了更强的暴发情况追踪。
结论
- 便携式长读长测序可以改善低资源环境中的TB诊断。
- 该方法减少了对广泛生物信息学专业知识的需求。
- 这种方法有潜力转变TB管理和控制策略。
常见问题
Executive Industry Relevance
Portable long-read amplicon sequencing enables rapid, comprehensive detection of drug resistance mutations in tuberculosis directly from clinical samples, addressing critical diagnostic gaps in resource-limited settings. This approach supports predictive confidence in resistance profiling and accelerates actionable insights for infectious disease portfolio management. Its deployment can de-risk early diagnostic decisions and expand access to high-quality molecular testing across diverse geographies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of resistance-associated genetic variants in clinical isolates.
- Supports functional validation of resistance mechanisms for target prioritization.
- Facilitates mechanistic de-risking by confirming variant-drug associations.
- Improves predictive confidence in resistance marker selection for diagnostic development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated amplicon panels for high-throughput resistance screening workflows.
- Delivers quantitative variant frequency data to inform assay sensitivity thresholds.
- Supports reproducible detection of high-frequency resistance mutations across platforms.
- Enables scalable deployment of portable sequencing for decentralized testing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns resistance variant detection with translational biomarker strategies for infectious disease programs.
- Ensures continuity from discovery of resistance markers to preclinical validation of diagnostic assays.
- Provides risk-adjusted data for advancing diagnostic candidates targeting drug-resistant TB.
- Supports outbreak tracking and surveillance in translational research settings.
Pipeline & Workflow Integration
This sequencing protocol bridges early discovery, assay development, and translational research by enabling rapid, field-deployable resistance profiling and supporting data-driven advancement of diagnostic assets.
- Discovery Biology: Confirms resistance mechanisms and variant-drug relationships in clinical samples.
- Screening: Provides quantitative, reproducible variant detection for assay optimization.
- Analytics: Generates high-coverage, cross-platform concordant data for resistance-associated genes.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and outbreak surveillance in preclinical pipelines.
- Enterprise Reuse: Offers a portable, scalable sequencing capability adaptable to multiple infectious disease targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in resistance profiling and target validation.
- Operational Value: Reduces infrastructure requirements and enables rapid, decentralized testing.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions for diagnostic development and deployment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of diagnostic assets for drug-resistant pathogens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in amplicon preparation and sequencing workflow execution.
- Needs access to portable long-read sequencing instrumentation and bioinformatics pipelines.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data analysis.
- Must adapt protocols for variable sample quality and amplicon yield.
- Detection of low-frequency variants may be limited compared to high-accuracy short-read platforms.
