Name: 荧光引导基质辅助激光解吸/电离与激光诱导位置电离质谱法对单个大鼠神经细胞进行检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 了解单细胞MALDI-2质谱技术用于大鼠神经细胞的高通量分子分析。该方法结合荧光引导成像与计算配准，揭示脂质异质性并关联细胞身份与功能。

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S.W.C. 感谢 Peixin He 和 Xiaoming Chen 博士奖学金（PhD4 Fellowship）以及伊利诺伊大学资助奖学金（University of Illinois Block Grant Fellowship）提供的支持。本工作还获得了美国国家药物滥用研究所（National Institute on Drug Abuse）资助号 P30DA018310、美国国家老龄化研究所（National Institute on Aging）资助号 R01AG078797，以及美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）主任办公室资助号 S10OD032242 的支持。

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<li>Krestensen, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Glioblastoma+Patient-Derived+Single+Cells+Using+Combined+MALDI-MSI+and+MALDI-IHC%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Glioblastoma Patient-Derived Single Cells Using Combined MALDI-MSI and MALDI-IHC.</a> Anal Chem. 97 (7), 3846-3854 (2025).</li>
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<li>Xie, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-Driven+and+Machine+Learning-Based+Framework+for+Image-Guided+Single-Cell+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Data-Driven and Machine Learning-Based Framework for Image-Guided Single-Cell Mass Spectrometry.</a> J Proteome Res. 22 (2), 491-500 (2023).</li>
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</ol>

作者无任何竞争利益需要披露。

高通量、图像引导的单细胞基质辅助激光解吸电离质谱（MALDI MS）是研究单细胞尺度化学异质性的有力工具。引入激光诱导后电离技术（MALDI-2）可实现更全面的分析物覆盖，这对于哺乳动物单细胞等质量与体积受限的样品尤为关键。
尽管已发表的单细胞脂质和代谢物质谱工作流程绝大多数使用培养细胞，但我们的方法应用于相对较快分离的原代细胞。这一区别至关重要，因为培养细胞仅在数天的培养过程中，其代谢物和脂质含量即表现出显著变化23,31。在大多数情况下，酶法细胞分离会导致轴突、树突和星形胶质细胞突起等精细细胞结构的丢失。因此，所观测到的分析物信号主要来源于细胞胞体。尽管如此，仍可成功实现按细胞类型4和脑区进行分类12。这表明，许多特异于不同类型细胞的脂质位于胞体中。
基质施加方法上的微小差异可能对最终的分析物信号产生显著影响。我...

脂质和代谢物是细胞功能的基础，作为细胞膜、能量来源以及信号分子的必需组分1,2。然而，它们的组成和丰度在单个细胞之间可能存在显著差异，反映出细胞类型以及发育和功能状态的不同3,4,5。分析这些差异对于理解生物变异性以及识别不同的细胞亚群至关重要。单细胞测量技术（如RNA测序）可提供有用的细胞特异性转录谱6。然而，转录水平的测量并不能直接反映脂质和代谢物在细胞内的实际含量，因为基因表达水平并不总是与这些分析物的实际丰度相关。因此，需要专门的方法对脂质和代谢物进行直接测量，以全面分析单个细胞及其群体的化学组成。
基质辅助激光解吸/电离（MALDI）质谱成像（MSI）是一种用于原位无标记空间定位内源性生物分子的首选工具in situ7,8。通常，在MALDI中，使用紫外激光从与有机基质共结晶的薄样品层中消融材料，形成离子和中性分子的羽流。生成的离子随后由质谱分析器分离，并在质谱仪中被检测。由于现代质谱仪载物台具有精确定位能力，激光可被定位以靶向特定样品区域，或逐点扫描区域，从而通过MSI生成分子图像。利用聚焦激光束和精确的载物台移动，实现细胞或亚细胞空间分辨率（&#60; 10 µm）的MSI可用于获取单个细胞的化学信息9,10。然而，在该尺度下的MSI测量效率较低，特别是在目标细胞密度较低的样品中，因为大量时间被用于对细胞间空白区域成像。此外，由于采样体积小，许多分析物的可检测性受到限制。为克服这些挑战，我们开发了一种基于图像引导的MALDI质谱方法，用于高通量单细胞分析11,12。在该方法中，分散细胞的位置通过全片荧光图像程序化确定，并用于引导质谱仪载物台移动至具有特定参数（如大小和形状）的单个细胞所在位置，随后通过MALDI激光照射进行分析。此前利用该靶向方法的研究已用于表征异质细胞群体中的脂质、肽段及其他生物分子5,13。
由于单细胞的样品量极为有限，此类样本中可检测到的分析物数量通常少于直接从组织中检测到的数量。因此，为了提高单细胞质谱分析中分析物的覆盖范围，提升分析物的检测灵敏度至关重要。近年来发展出的一种有助于克服这一检测挑战的方法是基质辅助激光解吸电离结合激光后电离技术（MALDI-2），该技术已被证明可显著增强多种分析物的检测灵敏度9,14,15,16。因此，MALDI-2 能够生成更全面的单细胞数据集，并在样品量受限的样本（如分离的单细胞）中实现更深入的分子覆盖。
本方法的目标是从数千个单个细胞中获取脂质测量数据。为此，我们描述了一种工作流程，可实现高通量的单细胞基质辅助激光解吸电离二级质谱（MALDI-2）分析，并且该流程通常可扩展至任何具有精确载物台控制的基于探针的质谱分析方法17。在此工作流程中，首先分离出感兴趣脑区的组织，然后通过木瓜蛋白酶消化法从组织中获得单个细胞。细胞经核染料标记后，被分散至刻有基准标记的导电玻璃载玻片上，使其贴附。接着，使用荧光显微镜对整个载玻片进行成像。通过升华法沉积基质，在载玻片表面形成可重复的均匀晶体层，从而为单细胞质谱分析提供高信噪比。利用开源软件microMS11，将显微图像中细胞位置的相对坐标与质谱仪载物台坐标进行映射和对齐，该过程通过载玻片上刻有的基准标记实现点集配准。最后，基于这些信息，对每个单个细胞进行精确定位的质谱采集，从而可在一次运行中完成对数千个细胞的分析（&#60;1 h）12,13。

<table><tbody><tr><td>2',5'-二羟基苯乙酮</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D107603</td><td>DHAP，纯度97%</td></tr><tr><td>乙酸铵</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238074</td><td>ACS级试剂，&amp;ge;97%</td></tr><tr><td>Axio M2 Imager</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>活检打孔器，2 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-460-399</td><td>integra miltex标准活检打孔器，2 mm</td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4901</td><td>无水，粉末，&amp;ge;97%</td></tr><tr><td>Eppendorf离心机</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EP5405000441</td><td>5425型离心机，配FA-24x2转子</td></tr><tr><td>庆大霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1272</td><td>液体，BioReagent级</td></tr><tr><td>玻璃蚀刻笔</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z225568</td><td>碳化钨头，每包1支</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7893</td><td>ACS级试剂，&amp;ge;99.5%</td></tr><tr><td>HEPES缓冲液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>&amp;ge;99.5%（滴定法）</td></tr><tr><td>Hoechst 33258溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94403</td><td>1 mg/mL水溶液，&amp;ge;98.0%（HPLC）</td></tr><tr><td>在线HEPA过滤器</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA67225001</td><td>VACU-GUARD 60 mm圆盘，0.45 μm PTFE外壳</td></tr><tr><td>ITO涂层显微镜载玻片</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-90IN-S115</td><td>电阻70–100&amp;Omega;</td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>无水，&amp;ge;98%</td></tr><tr><td>硫酸镁</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208094</td><td>无水，&amp;ge;97%</td></tr><tr><td>微量离心管</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323K</td><td>管容量1.5 mL，每包500个</td></tr><tr><td>木瓜蛋白酶解离系统</td><td>Worthington Biochemical&amp;nbsp;</td><td>LK003150</td><td>一盒，含5个一次性使用小瓶</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4458</td><td>液体，BioReagent级</td></tr><tr><td>氯化钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>529552</td><td>分子生物学级</td></tr><tr><td>磷酸二氢钾</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td>Reagent Plus级</td></tr><tr><td>碳酸氢钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014</td><td>ACS级试剂，&amp;ge;99.7%</td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888</td><td>ACS级试剂，&amp;ge;99%</td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>221465</td><td>ACS级试剂，&amp;ge;97%，颗粒状</td></tr><tr><td>磷酸氢二钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9763</td><td>ACS级试剂，&amp;ge;99%</td></tr><tr><td>升华物</td><td>HTX</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>timsTOF FleX MALDI-2</td><td>Bruker</td><td>N/A</td><td>支持microGRID</td></tr><tr><td>真空管路&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>8701-0080</td><td>Nalgene无邻苯二甲酸酯PVC管路&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

荧光引导的基质辅助激光解吸/电离结合激光诱导后电离质谱分析单个大鼠神经细胞

Fluorescence-Guided Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization with Laser-Induced Postionization Mass Spectrometry of Individual Rat Neural Cells

单细胞测量对于理解大脑丰富的空间化学异质性至关重要。基质辅助激光解吸电离（MALDI）质谱（MS）能够无需标记、高通量地表征单个细胞内的内源性分子。近年来，配备激光诱导后电离（MALDI-2）技术的MALDI质谱仪在多种脂质及其他小分子的检测灵敏度方面实现了显著提升。然而，对于大多数应用而言，利用MALDI-2在细胞分辨率下对大样本进行质谱成像的速度过于缓慢，难以实现。在本实验方案中，将原代细胞分离并分散至导电载玻片上，通过全片荧光显微镜确定各细胞的相对位置，随后精确地将显微镜坐标与MALDI-2质谱仪的载物台坐标进行共定位配准。仅针对细胞位置进行靶向质谱分析，相比对整个样本进行质谱成像，可实现高通量的单细胞测量，具有更高的分析物覆盖率并显著减少数据量。本文详细描述了单细胞制备、全片荧光成像、基质涂布以及MALDI-2质谱分析所必需的关键步骤。

荧光引导的单细胞MALDI-2质谱工作流程概览如图1所示。首先，从目标脑区分离的组织（图1A）被解离为单个细胞，并沉积到导电的ITO涂层显微镜载玻片上（图1B）。通过全片荧光成像确定细胞位置（图1C），随后进行MALDI基质涂布（图1D）、微质谱辅助的MALDI-2质谱分析（图1E）以及数据分析（图1F）。利用该工作流程，可在单个细胞内初步鉴定出数十至数百种脂质，质荷比准确度优于10 ppm（使用MALDI-2 timsTOF仪器）。
质谱成像可用于小范围感兴趣区域，以评估细胞制备和基质涂布的质量。图2A展示了...

本方案概述了微MS（microMS）在荧光引导下单细胞MALDI-2质谱分析中的应用，可实现对原代大鼠神经元细胞的增强型分子谱分析。

单细胞测量对于理解大脑丰富的空间化学异质性至关重要。基质辅助激光解吸电离……

我们的研究致力于开发高通量、图像引导的单细胞基质辅助激光解吸电离质谱工作流程，以揭示细胞异质性，并将分子谱型与复杂系统中细胞的身份、功能及响应相联系。先进的仪器，例如 MALDI-2 和高空间分辨率质谱仪，能够实现对单个细胞的靶向、空间分辨分析，从而提高灵敏度，并扩展复杂组织中分子谱分析的应用范围。当前面临的挑战包括灵敏度有限、样品间重复性差以及数据分析复杂。MALDI 数据通常稀疏，且包含数千个细胞和数百种分子的大型数据集需要强大的计算工具。本方案填补了高通量分析单个细胞甚至细胞器的方法学空白，能够对异质性进行极为细致的研究，并深入揭示分子与细胞生物学及其功能的机制。该方案可实现对分散在载玻片上的细胞进行快速靶向分析，无需细胞操作或全区域扫描，显著提高了通量。[旁白] 首先，用2至3毫升150毫摩尔的醋酸铵溶液冲洗每张载玻片，以去除可能干扰显微镜观察和MALDI基质涂布的甘油和盐晶体，然后在温和的氮气流下干燥载玻片，或让其完全自然晾干。将干燥后的载玻片装入显微镜载物台。使用至少10个均匀分布在整张载玻片上的支撑点进行显微镜聚焦。使用适合DAPI和明场成像的滤光片，在5倍至10倍放大倍数下获取整张载玻片的拼接荧光图像，确保图像中清晰捕获到载玻片上的定位标记。使用显微镜软件（例如ZEN ZEISS）对拼接图像进行拼合。验证垂直相邻的图像瓦片之间无偏移。使用显微镜软件将每张拼合后的图像处理并导出为BigTIFF文件；若最终图像大小小于2吉字节，也可导出为标准TIFF格式。将20毫克2,5-二羟基苯乙酮溶解于1.5毫升丙酮中。将载玻片放入升华室的支架中，然后将支架置入升华装置内。用移液器将溶解的基质溶液滴加到陶瓷晶片上，待丙酮完全蒸发后，关闭升华室并密封。在冷却室中加入冰水混合物，并将其牢固地放置在升华室顶部。开启真空泵，使系统平衡5分钟。通过将室温加热至200摄氏度并维持5分钟，开始升华过程。5分钟后，从装置上移除冰水浴。将温度调至25摄氏度，并在室顶部放置散热片。缓慢释放升华室内的压力。打开升华室，小心取出载玻片。打开MicroMS软件，使用“图像组”选项对BigTIFF显微图像进行降采样，以同时兼容明场和荧光通道。进入“Blob Options”工具，调整最大和最小斑点尺寸，以定义可接受的斑点尺寸范围。设置荧光通道的阈值以用于斑点检测。设定圆形度值，以定义被识别细胞所需具备的圆形程度，并选择颜色。使用“Blob Find”选项检测斑点。当系统提示时，将斑点列表以所需名称保存。使用“Distance Filter”工具设置每个细胞之间的最小距离。通过测试点检验误差，以准确确定偏移误差。使用MTP Slide Adapter II将载玻片装入仪器。返回运行MicroMS的计算机后，通过远程桌面应用程序访问质谱仪计算机。若为首次使用该仪器，需通过依次点击“Tools”和“Instrument Settings”来验证其位置。在弹出窗口中查看包含X和Y坐标的坐标集，并在MTP Slide Adapter II的几何结构上选择这些特定点。在MicroMS窗口中更新X和Y坐标。利用质谱仪的摄像头和载物台控制功能，导航至载玻片上一个易于识别的位置，并复制仪器坐标。在MicroMS中，在显微图像中找到相同位置，右键单击，并将坐标输入弹出窗口中。将坐标四舍五入至最接近的整数，并以空格分隔。当添加了三个配准点后，其中一个圆圈将变为红色，表示其相对于配准位置偏差最大。使用Control + 右键单击删除该配准点，然后重新尝试。在“File”菜单下，选择“Save”，然后选择“Registration”以保存配准文件。在载玻片上显示斑点后，进入“File”、“Save”，然后选择“instrument positions”以保存仪器位置文件，再通过远程桌面软件将此文件传输至仪器计算机。打开自定义XEO文件，并将其内容复制到仪器计算机上的MTP Slide Adapter II .XEO文件中。保存该文件，以使用细胞位置信息更新此几何文件。点击“Automation”标签页，选择“New”以创建新的自动运行任务。在显示的样本区域上拖动以选择细胞，右键单击将其添加到分析列表中。保存自动运行任务，然后点击“Start Automatic Run”以开始数据采集。该图展示了单细胞MALDI-2质谱分析如何揭示不同及同一脑区内的脂质基础细胞异质性。均匀流形近似与投影（UMAP）分析按脑区对细胞进行分离，在纹状体、海马和皮层中形成明显的聚类。Leiden聚类揭示了四种基于脂质的细胞亚群。此外，观察到各聚类特异性的脂质特征，不同注释脂质的强度分布具有明显差异。来自六张皮层载玻片的质谱数据也显示出跨载玻片一致的脂质检测结果。此外，来自不同载玻片的皮层细胞表现出重叠的UMAP分布，表明批次效应极小。

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荧光引导基质辅助激光解吸/电离与激光诱导位置电离质谱法对单个大鼠神经细胞进行检测

使用左旋多巴（L-DOPA）进行多巴胺替代药物治疗是帕金森病最常用的对症治疗方法，但伴随有包括称为运动障碍的不自主异常运动等副作用1。本文介绍了一种基质辅助激光解吸电离成像质谱技术（MALDI成像质谱）的实验方案，可用于检测与运动障碍相关的神经肽在大鼠脑内水平的变化。...

帕金森病中神经肽的基质辅助激光解吸电离成像质谱分析

来源：Hare, D. J., 等. 利用激光剥蚀-电感耦合等离子体质谱法（LA-ICP-MS）对脑组织中的金属进行成像。 J. Vis. Exp.

激光消融-电感耦合等离子体质谱法可视化小鼠脑组织中的金属元素

我们介绍了如何使用激光显微切割技术（LCM），从损伤大鼠脑组织的冷冻切片中分离富集的海马神经元或单个神经元，以用于后续通过定量实时PCR和/或全基因组微阵列进行基因表达分析。...

激光捕获显微切割富集的神经元群体或单个神经元用于创伤性脑损伤后基因表达分析

在增殖条件下扩增人神经前体细胞（NPCs）。在多种神经营养因子联合存在的情况下，将NPCs分化为富含神经元的培养物。通过免疫荧光染色检测神经元标志物。为了分离出纯度较高的神经元群体，将NPCs在PEN膜载玻片上进行分化，并进行激光显微切割分离。...

从培养的人类神经前体细胞分化获得的神经元进行激光显微切割分离

本方案描述了一种用于在清醒大鼠中监测皮层下脑区神经元活动的头部固定装置的设计与外科植入方法。该方案详细说明了通过邻细胞记录配置分离单个神经元并有效确定其解剖位置的操作步骤。...

清醒且头部固定的雄性大鼠皮层下脑区单个神经元的紧密细胞外记录与定位

关键词：紧密细胞外记录，单神经元记录，皮层下脑结构，清醒动物，头部固定，大鼠

本文演示了使用激光捕获显微切割技术，通过直接或间接免疫组织化学方法分离单个多巴胺能神经元或腹侧被盖区。讨论了使用红外激光从玻璃载玻片上分离组织，以及结合红外和紫外激光从膜载玻片上分离组织的参数。...

激光捕获显微切割——分离单个多巴胺能神经元及完整腹侧被盖区的示范操作

对特定组织中部分细胞的基因表达进行分析是一项重大挑战。本文介绍了如何通过将快速免疫标记方法与激光显微切割技术相结合，从特定细胞群体中分离高质量的总RNA。...

使用激光捕获显微切割结合快速免疫标记法从特定细胞亚群中分离RNA

本实验方案的目的是利用荧光激活细胞分选（FACS）技术分选出特定类型的神经细胞，以便后续分析细胞类型特异性的基因表达、表观遗传标记和/或蛋白质表达。...

利用荧光激活细胞分选技术分析大鼠脑组织中特定细胞类型的基因表达

我们介绍一种通过向脑核团注射顺行或逆行示踪剂来标记神经元及其突起的技术，该技术使用一种 体外 制备。我们改进了一种现有的i体外...

脑组织离体标本中的激光引导神经元示踪

本文介绍了一种在大鼠脑组织上沉积DAN基质的升华方案，用于通过基质辅助激光解吸电离成像质谱技术检测神经节苷脂。...

用于MALDI成像质谱分析大鼠脑组织中神经节苷脂检测与可视化的DAN基质升华法

本方案介绍了如何使用激光显微切割技术，从杏仁核中央核中高精度、高解剖特异性地分离单个神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞。此外，我们还阐述了如何利用微流控RT-qPCR技术检测这些细胞部分转录组的表达情况。...

结合激光捕获显微切割与微流控qPCR分析单细胞转录谱：一种研究阿片类药物依赖的系统生物学方法

了解单细胞MALDI-2质谱技术用于大鼠神经细胞的高通量分子分析。该方法结合荧光引导成像与计算配准，揭示脂质异质性并关联细胞身份与功能。

荧光引导的基质辅助激光解吸/电离结合激光诱导后电离质谱分析单个大鼠神经细胞

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