荧光引导基质辅助激光解吸/电离与激光诱导位置电离质谱法对单个大鼠神经细胞进行检测

我们的研究重点是开发高通量、图像引导、单细胞 MALDI 质谱工作流程，以揭示细胞异质性，并将分子谱与复杂系统中的细胞身份、功能和响应联系起来。

MALDI-2 和高空间分辨率质谱仪等先进仪器能够对单细胞进行有针对性的空间分辨分析，从而提高灵敏度并扩大复杂组织中分子谱分析的范围。当前的挑战包括灵敏度有限、样品间的可重复性和复杂的数据分析。MALDI 数据通常是稀疏的，包含数千个细胞和数百个分子的大型数据集需要强大的计算工具。

该协议解决了分析单个细胞甚至细胞器的高通量方法的差距，从而能够对异质性进行非常详细的研究，并深入了解分子和细胞生物学和功能。

该协议允许对分散在载玻片上的细胞进行快速靶向分析，无需细胞作或全区域扫描，并显着提高通量。

[旁白]首先，用两到三毫升 150 毫摩尔乙酸铵冲洗每张载玻片，以去除可能干扰显微镜和 MALDI 基质应用的甘油和盐晶体，然后在温和的氮气流下干燥载玻片或让它们完全风干。将干燥的载玻片装入显微镜载物台。使用均匀分布在整个载玻片上的至少 10 个支撑点聚焦显微镜。使用适用于 DAPI 和明场成像的滤光片，以 5 倍至 10 倍的放大倍率获取整个载玻片的平铺荧光图像，确保显微镜载玻片上的基准标记在图像中清晰捕获。使用显微镜软件（例如 ZEN ZEISS）拼接平铺图像。验证垂直相邻的图块是否未偏移。使用显微镜软件处理每个拼接的图像并将其导出为 BigTIFF 文件，如果最终图像大小小于 2 GB，则将其导出为标准 TIFF。将 20 毫克 2,5-二羟基苯乙酮溶解在 1.5 毫升丙酮中。将载玻片放入升华室的支架中，然后将支架放入升华装置中。将溶解的基质溶液移液到陶瓷晶圆上，让丙酮完全蒸发，然后关闭升华室以密封。用冰水泥填充冷却液室，并将其牢固地放在升华室的顶部。打开真空泵，让系统平衡五分钟。将腔室加热至 200 摄氏度五分钟开始升华。五分钟后，从腔室中取出冰水浴。将温度调至 25 摄氏度，并在腔室顶部放置散热器。慢慢排气升华室以释放压力。打开腔室并小心地取下载玻片。打开 MicroMS 并使用图像组选项抽取 BigTIFF 显微镜图像，以适应明场和荧光通道。导航到“Blob 选项”工具，然后调整最大和最小 blob 大小以定义可接受的 blob 大小范围。设置斑点检测的荧光通道阈值。指定圆度值以定义已识别的单元格需要考虑的圆形程度，然后选择颜色。使用 Blob 查找选项检测 Blob。出现提示时，将 blob 列表保存在所需的名称下。使用距离过滤器工具设置每个单元格之间的最小距离。通过测试点测试误差，以准确确定偏移误差。使用 MTP Slide Adapter II 将载玻片加载到仪器中。使用 MicroMS 返回计算机后，通过远程桌面应用程序访问质谱仪计算机。如果是第一次使用仪器，请导航到“工具”，然后导航到“仪器设置”来验证其位置。在弹出窗口中，查看坐标集及其 X 和 Y 位置，并在 Slide Adapter II 几何体上选择每个特定点。更新 MicroMS 窗口中的 X 和 Y 位置。使用质谱仪的相机和载物台控件，导航到载玻片上易于识别的位置并复制仪器坐标。在MicroMS中，在显微镜图像中找到相同的位置，右键单击，然后在弹出窗口中输入坐标。将坐标四舍五入到最接近的整数，并用空格分隔。添加三个注册点后，其中一个圆圈将变为红色，表示它是与注册最偏离的位置。使用 Control + 右键单击删除注册点，然后重试。在“文件”下，转到“保存”，然后转到“注册”以保存注册文件。在幻灯片上可见斑点的情况下，转到文件、保存，然后转到仪器位置以保存仪器位置文件，然后使用远程桌面软件将此文件传输到仪器计算机。 打开自定义 XEO 文件并将其内容复制到 MTP Slide Adapter II 中。XEO 文件。保存文件以使用单元的位置更新此几何文件。单击“自动化”选项卡，然后选择“新建”以创建新的自动运行。在显示的样本区域上拖动以选择单元格，然后单击鼠标右键以将其添加到分析列表中。保存自动运行，然后单击开始自动运行开始采集。该图说明了单细胞 MALDI-2 质谱分析如何揭示不同大脑区域和内部基于脂质的细胞异质性。均匀流形近似和投影或 UMAP 分析按大脑区域分离细胞，形成纹状体、海马体和皮层的不同簇。莱顿聚类揭示了四个基于脂质的细胞亚群。此外，还观察到簇特异性脂质特征，在带注释的脂质中具有不同的强度曲线。来自六个皮质细胞的质谱也显示出载玻片中一致的脂质检测。此外，来自不同载玻片的皮质细胞显示出重叠的 UMAP 分布，表明批次效应最小。