Name: 光合微生物及其病毒的环境采样：从田间到实验室 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: 了解从海洋和淡水生态系统富光区采集光合微生物及其病毒的环境采样方法。学习使用电子显微镜、定量PCR和高通量测序技术分离单基因型病毒库并表征病毒-宿主动态，为病毒生态学预测模型提供数据支持。

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本研究部分得到了美国国家科学基金会（NSF）OISE项目编号1856091（项目负责人：Ceballos）和NSF DBI项目编号2119968（项目负责人：Ceballos）的资助。作者感谢泰国国王科技大学（Thonburi）的Chinnapong Wangnai博士和Chakrit Tachaapaikoon博士所做出的贡献，他们分别为环境采样提供了视频拍摄和野外支持。作者还感谢哥斯达黎加大学瓜纳卡斯特分校的Jorge Armando Leiva Sanabria博士，他在获取哥斯达黎加国家公园的采样许可以及地热池样本采集过程中提供了协助。作者同样感谢加利福尼亚大学默塞德分校的Enrique Marroquin, Jr. 先生和缅因大学（美国缅因州奥罗诺）的Alexia Maceda女士，他们分别协助完成了南加州海岸以及明尼苏达州北部湖泊的采样工作。作者感谢并致谢Socheata Hour女士提供的技术支持，她计算了φSBL14-SWII&#160;数据集的感染参数。

<ol><li>Zhang, D., You, F., He, Y., Te, S. H., Gin, K. Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+the+first+freshwater+cyanophage+infecting+Pseudanabaena%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of the first freshwater cyanophage infecting Pseudanabaena.</a> J Virol. 94 (17), 10-1128 (2020).</li>
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<li>Douterelo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+approaches+for+studying+the+microbial+ecology+of+drinking+water+distribution+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Methodological approaches for studying the microbial ecology of drinking water distribution systems.</a> Water Res. 65, 134-156 (2014).</li>
<li>Brandt, J. P., Flannigan, M. D., Maynard, D. G., Thompson, I. D., Volney, W. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+Canada%27s+boreal+zone%3A+ecosystem+processes%2C+health%2C+sustainability%2C+and+environmental+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Rev%22%5BJournal%5D)">An introduction to Canada's boreal zone: ecosystem processes, health, sustainability, and environmental issues.</a> Environ Rev. 21 (4), 207-226 (2013).</li>
<li>Ramanan, R., Kim, B. H., Cho, D. H., Oh, H. M., Kim, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Algae-bacteria+interactions%3A+evolution%2C+ecology+and+emerging+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Algae-bacteria interactions: evolution, ecology and emerging applications.</a> Biotechnol Adv. 34 (1), 14-29 (2016).</li>
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<li>Graham, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbes+as+engines+of+ecosystem+function%3A+when+does+community+structure+enhance+predictions+of+ecosystem+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbes as engines of ecosystem function: when does community structure enhance predictions of ecosystem processes.</a> Front Microbiol. 7, 214(2016).</li>
<li>Ceballos, R. M., Stacy, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+relative+virulence%3A+when+%C2%B5+max+fails+and+AUC+alone+just+is+not+enough%5BTitle%5D)+AND+%22J+General+Virol%22%5BJournal%5D)">Quantifying relative virulence: when µ max fails and AUC alone just is not enough.</a> J General Virol. 102 (1), 001515(2021).</li>
<li>Hour, S., Pierce, A. J., Heng, S. Y., Plymale, R., Ceballos, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Resilience+in+Single-Host%2FSingle-Virus+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Quantifying Resilience in Single-Host/Single-Virus Infections.</a> Appl Microbiol. 5 (1), 18(2025).</li>
<li>Ceballos, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+virus+host-ranges+of+the+Fuselloviridae+of+hyperthermophilic+Archaea%3A+implications+for+evolution+in+extreme+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differential virus host-ranges of the Fuselloviridae of hyperthermophilic Archaea: implications for evolution in extreme environments.</a> Front Microbiol. 3, 295(2012).</li>
<li>Ceballos, R. M., Drummond, C. G., Stacy, C. L., Padilla-Crespo, E., Stedman, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-dependent+differences+in+replication+strategy+of+the+Sulfolobus+spindle-shaped+virus+strain+SSV9+%28aka%2C+SSVK1%29%3A+infection+profiles+in+hosts+of+the+family+Sulfolobaceae%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Host-dependent differences in replication strategy of the Sulfolobus spindle-shaped virus strain SSV9 (aka, SSVK1): infection profiles in hosts of the family Sulfolobaceae.</a> Front Microbiol. 11, 1218(2020).</li>
<li>Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generic+assignments%2C+strain+histories+and+properties+of+pure+cultures+of+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of cyanobacteria.</a> Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).</li>
<li>Kliphuis, A. M., Janssen, M., van den End, E. J., Martens, D. E., Wijffels, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+respiration+in+Chlorella+sorokiniana%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Phycol%22%5BJournal%5D)">Light respiration in Chlorella sorokiniana.</a> J Appl Phycol. 23, 935-947 (2011).</li>
<li>Lea-Smith, D. J., Vasudevan, R., Howe, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+marked+and+markerless+mutants+in+model+cyanobacterial+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of marked and markerless mutants in model cyanobacterial species.</a> J Vis Exp. (111), e54001(2016).</li>
<li>Noroozi, M., Amozegar, M. A., Rahimi, R., Shahzadeh Fazeli, S. A., Bakhshi Khaniki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+isolation+and+preliminary+characterization+of+native+cyanobacterial+and+microalgal+strains+from+lagoons+contaminated+with+petroleum+oil+in+Khark+Island%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+J+Microorg%22%5BJournal%5D)">The isolation and preliminary characterization of native cyanobacterial and microalgal strains from lagoons contaminated with petroleum oil in Khark Island.</a> Biol J Microorg. 5 (20), 33-41 (2017).</li>
<li>Nübel, U., Garcia-Pichel, F., Muyzer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+primers+to+amplify+16S+rRNA+genes+from+cyanobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">PCR primers to amplify 16S rRNA genes from cyanobacteria.</a> Appl Environ Microbiol. 63 (8), 3327-3332 (1997).</li>
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<li>Bratchkova, A., Kroumov, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microalgae+as+producers+of+biologically+active+compounds+with+antibacterial%2C+antiviral%2C+antifungal%2C+antialgal%2C+antiprotozoal%2C+antiparasitic+and+anticancer+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Microbiol+Bulgarica%22%5BJournal%5D)">Microalgae as producers of biologically active compounds with antibacterial, antiviral, antifungal, antialgal, antiprotozoal, antiparasitic and anticancer activity.</a> Acta Microbiol Bulgarica. 36 (3), 79-89 (2020).</li>
<li>Storms, Z. J., Teel, M. R., Mercurio, K., Sauvageau, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+virulence+index%3A+a+metric+for+quantitative+analysis+of+phage+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Phage%22%5BJournal%5D)">The virulence index: a metric for quantitative analysis of phage virulence.</a> Phage. 1 (1), 27-36 (2020).</li>
<li>Omata, T., Murata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+three+types+of+membranes+from+the+cyanobacterium+%28blue-green+alga%29+Synechocystis+PCC+6714%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of three types of membranes from the cyanobacterium (blue-green alga) Synechocystis PCC 6714.</a> Arch Microbiol. 139, 113-116 (1984).</li>
<li>Wilson, W. H., Joint, I. R., Carr, N. G., Mann, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+molecular+characterization+of+five+marine+cyanophages+propagated+on+Synechococcus+sp.+strain+WH7803%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Isolation and molecular characterization of five marine cyanophages propagated on Synechococcus sp. strain WH7803.</a> Appl Environ Microbiol. 59 (11), 3736-3743 (1993).</li>
<li>Grasso, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+cyanophage-host+relationships%3A+Highlighting+cyanophages+as+a+potential+cyanobacteria+control+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">A review of cyanophage-host relationships: Highlighting cyanophages as a potential cyanobacteria control strategy.</a> Toxins. 14 (6), 385(2022).</li>
<li>Srivastava, A., Gupta, N., Mishra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyanophages%3A+interacting+mechanism+and+evolutionary+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Cyanobacteria%22%5BJournal%5D)">Cyanophages: interacting mechanism and evolutionary significance.</a> Cyanobacteria. , 255-282 (2024).</li>
<li>Cai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundant+and+cosmopolitan+lineage+of+cyanopodoviruses+lacking+a+DNA+polymerase+gene%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Abundant and cosmopolitan lineage of cyanopodoviruses lacking a DNA polymerase gene.</a> ISME J. 17 (2), 252-262 (2023).</li>
<li>Komárek, J., Kaštovský, J., Mareš, J., Johansen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+classification+of+cyanoprokaryotes+%28cyanobacterial+genera%29+2014%2C+using+a+polyphasic+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Preslia%22%5BJournal%5D)">Taxonomic classification of cyanoprokaryotes (cyanobacterial genera) 2014, using a polyphasic approach.</a> Preslia. 86 (4), 295-335 (2014).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

病毒圈极为广阔且多样化，因此研究不同的病毒系统需要采用不同的实验方法。这包括从不同环境中分离病毒及其宿主的不同策略，以及采用不同的处理方法，以确保能够从原始样品中获得宿主及其病毒的纯培养物。这些纯培养物可用于固相培养基和液体培养中的病毒-宿主（SVSH）感染实验，从而实现对系统特征及病毒-宿主动态关系的定量分析。在本报告中，我们描述了一种标准但可调整的工作流程，用于从海洋、湖泊、冰盖下水体以及其他水生环境（例如地热池和温泉）中采集样品。该工作流程详细说明了样品在运回实验室前的现场预处理步骤，这对于确保有活性的微生物群能够成功运抵实验室并进行更深入的分析至关重要。通过一系列不同孔径的滤膜对原始样品进行过滤和滤膜浓缩，分离样品中的不同组分，并避免样品暴露于阳光（即紫外线辐射）和极端温度等不利因素，是该工作流程第一步的关键环节（图8）。
进入实验室后，可将0.45 µm滤液直接进行离心浓缩，或先将0.45 µm滤液通过0.22 µm滤膜截留生物量后再对截留物进行离心浓缩，从而富集真核病毒或较大的原核病毒（例如噬菌体、古菌病毒）。...

阐明蓝藻噬菌体及其宿主的感染动态和进化关系，对于理解当前及未来海洋和淡水生态系统的状态至关重要。先进的高通量测序技术与现代分析方法使得蓝藻噬菌体（及宿主）基因组能够快速测序，从而研究病毒-宿主之间的相互关系1,2。然而，研究流程始于环境采样，以分离和鉴定病毒及其宿主3,4,5。由于病毒圈的多样性，目前尚无一种通用的方案可用于采样和表征所有病毒及细菌噬菌体。事实上，每种病毒-宿主系统都具有其独特的特征。尽管如此，无论研究何种病毒系统，其基本目标均相似：分离病毒；确定宿主范围；在一个或多个宿主中证明 productive 感染；利用定性和定量方法对病毒、宿主以及病毒-宿主感染动态进行表征。通过扰动系统，可进一步深入理解病毒系统。改变感染复数（MOI）6、温度、pH、宿主菌株，或施加药物以观察系统响应，可进一步揭示病毒-宿主动态的本质。更高级的操作，例如定向进化，可提供有关该系统潜在进化轨迹的信息，并揭示共进化终点可能如何影响更大范围的微生物群落及整个生态系统。
本研究提供了一种模型化（但易于调整）的环境采样方案，用于采集在海洋、淡水及其他水生生态系统中参与营养循环和初级生产的光合微生物，如蓝细菌和微藻7,8,9,10,11。该工作流程聚焦于从海洋和淡水环境的真光层中分离宿主及其病毒和噬菌体，这些病毒和噬菌体是这些生态系统中的关键驱动因素12。病毒和噬菌体均影响真核生物和原核生物的种群结构，并显著影响生态系统的多样性与生产力13。因此，本研究的目标是提供一套采样方案及采样后的操作流程，以促进宿主和病毒的富集，进而开展以下研究：单病毒-单宿主、多病毒-单宿主、单病毒-多宿主以及多病毒-多宿主之间的相互作用动态；揭示病毒-宿主感染动态背后的组学（-omics）研究基质；以及探索影响所研究病毒-宿主系统及其来源更大生态系统的潜在共进化路径与进化终点。
具体而言，我们描述了一种用于环境采样、样品的野外预处理（即在到达实验室之前）、噬菌体（及病毒）分离的后续处理、富集混合微生物培养物以鉴定敏感宿主、获得潜在宿主的单菌落分离物以及验证宿主的流程。 真正 病毒-宿主关系（即 productive infection），并表征基本的感染特性（如毒力）。感染实验不仅允许计算相对毒力（VR)14 以及宿主的恢复力（RR)15 但还包括在关键时间点提取培养样品的步骤，用于研究观察到的生理现象背后的组学底物（即病毒-宿主相互作用动态）。最后，我们讨论了潜在的陷阱、故障排除方法与解决方案，以及如何修改特定步骤以针对特定分类群。该工作流程适用于蓝藻噬菌体-蓝细菌、藻类DNA病毒-微藻以及嗜热斐氏病毒-古菌系统。16,17，证明了其在表征细菌域、真核生物域和古菌域这三类生命体中的病毒方面的实用性。

<table><tbody><tr><td>1 马力不锈钢转子泵&amp;nbsp;</td><td>Utilitech, Charlotte, NC, USA</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>www.eppendorf.com</td><td>30123611</td><td></td></tr><tr><td>10K NMWL Centricon Plus 70 离心浓缩管&amp;nbsp;</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>UFC701008</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 带挡板锥形瓶&amp;nbsp;</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>CLS4450250</td><td></td></tr><tr><td>3800 瓦逆变发电机&amp;nbsp;</td><td>WEN Products, West Dundee, IL, USA</td><td>WEN 56380i</td><td></td></tr><tr><td>3K NMWL Amicon 15 mL 离心浓缩管&amp;nbsp;</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>UFC800308</td><td></td></tr><tr><td>500 mL 带挡板锥形瓶&amp;nbsp;</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>CLS4450500</td><td></td></tr><tr><td>5 加仑水桶&amp;nbsp;</td><td>www.homedepot.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>80 英尺长，0.5&amp;rdquo; 直径，尼龙材质&amp;nbsp;</td><td>https://facomex.mx/producto/combo/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>一艘 26 英尺深 V 型中控台 Sailfish 2660 船，配备两台 150 马力雅马哈舷外发动机&amp;nbsp;</td><td>https://yamahaoutboards.com/</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>乙酸铵 (CH3CO2NH4)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>631618</td><td></td></tr><tr><td>硼酸 (H3BO3)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>10043353</td><td></td></tr><tr><td>二水氯化钙 (CaCl2·2H2O)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>10035048</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5920&amp;nbsp;R 离心机</td><td>www.eppendorf.com</td><td>5948000107</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸 (C6H8O7)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>77929</td><td></td></tr><tr><td>六水合硝酸钴(II) [Co(NO3)2·6H2O]</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>10026229</td><td></td></tr><tr><td>抗塌陷橡胶软管&amp;nbsp;</td><td>swanhose.com</td><td>CELTF58050</td><td></td></tr><tr><td>五水硫酸铜(II) (CuSO4·5H2O)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>7758998</td><td></td></tr><tr><td>Corning 50 mL 离心管&amp;nbsp;</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>CLS430291</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钾 (K2HPO4)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>7758114</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸二钠 (Na2EDTA)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>6381926</td><td></td></tr><tr><td>DS-11 FX+_微量分光光度计和荧光计</td><td>www.denovix.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>封箱胶带&amp;nbsp;</td><td>www.homedepot.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>EP022364120</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>64175</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸 (EDTA)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>60004</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸铁铵 (C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;&amp;middot;xFe&lt;sup&gt;3+&lt;/sup&gt;&amp;middot;yNH&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>1185575</td><td></td></tr><tr><td>Flex-plus 蓝色 PVC 软管&amp;nbsp;</td><td>www.carlonsales.com</td><td>12008-750</td><td></td></tr><tr><td>Innova S44i - 可堆叠恒温摇床</td><td>www.eppendorf.com</td><td>2231001081</td><td></td></tr><tr><td>LVEM5 台式电子显微镜_透射电子显微镜 (TEM)</td><td>delongamerica.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁 (MgSO4·7H2O)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>10034998</td><td></td></tr><tr><td>四水氯化锰(II) (MnCl2·4H2O)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>13446349</td><td></td></tr><tr><td>蘑菇锚，黑色乙烯基涂层，30 磅</td><td>www.homedepot.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>聚苯乙烯培养皿</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>P5481</td><td></td></tr><tr><td>带 0.22 mm 聚醚砜 (PES) 膜滤杯</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>Z358193-1CS</td><td></td></tr><tr><td>带 0.45 mm 聚醚砜 (PES) 膜滤杯</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>Z370622-1CS</td><td></td></tr><tr><td>乙基黄原酸钾 (C2H5OCSSK)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>140896</td><td></td></tr><tr><td>碳酸钠 (Na2CO3)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>497198</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠 [CH3(CH2)11OSO3Na]</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>151213</td><td></td></tr><tr><td>二水钼酸钠 (Na2MoO4·2H2O)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>10102406</td><td></td></tr><tr><td>硝酸钠 (NaNO3)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>7631994</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)甲基-2-氨基乙磺酸 (TES) (C6H15NO6S)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>7365448</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐 (Tris-HCl)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>1185531</td><td></td></tr><tr><td>真空/压力泵&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer; Vernon Hills, IL, USA</td><td>EW-79204-00</td><td></td></tr><tr><td>乙烯基软管&amp;nbsp;</td><td>www.homedepot.com</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸锌 (ZnSO4·7H2O)</td><td>www.sigmaaldrich.com</td><td>7446200</td><td></td></tr></tbody></table>

环境采样光合微生物及其病毒：从野外到实验室

Environmental Sampling of Photosynthetic Microbes and Their Viruses: From Field to Lab

对光合微生物及其病毒的环境采样，在理解当前海洋和淡水生态系统生物多样性、生态系统动态以及气候变化相关因素（如温度升高和酸化）对物种进化轨迹和群落组成的影响方面发挥着关键作用。然而，病毒圈的多样性决定了无法采用单一通用的采样与实验流程。事实上，每种病毒系统都具有独特的特征，需要对病毒学中的标准操作流程进行相应调整，才能实现研究目标。尽管病毒的发现与表征需依赖针对特定目标系统的策略，但对于所有病毒而言，研究目标是相似的：分离病毒、确定宿主范围、确认 productive 感染，并对病毒、宿主以及病毒-宿主相互作用关系进行表征。对病毒-宿主系统的可靠描述至少应包括形态学、生理学、生物化学以及组学（omics）特征的阐明。通过改变感染复数、温度、pH、宿主转换、定向进化或施加药物以观察病毒-宿主系统的响应，还可获得进一步的信息。本实验室研究涵盖生命三域（古菌、细菌和真核生物）中的病毒。在本报告中，我们详细描述了从淡水和海洋环境的真光层中采样光合微生物的方法，并重点聚焦于分离感染蓝细菌的噬菌体（即蓝藻噬菌体）。蓝细菌是这些水生生态系统中初级生产力和营养循环的关键物种。本文所述流程涵盖从不同水深采水，到利用液体和固体培养基培养、先进的分子/遗传学方法以及分析手段对病毒-宿主系统特征进行表征的全过程。所描述的方法可适用于跨生命三域的噬菌体及其他病毒发现研究中的病毒-宿主系统研究。

使用便携式汽油动力发电机、水体转移泵及抗压塌软管，可有效从海洋、湖泊、冰封湖泊及其他水体环境（如泻湖）的特定深度提取水样（图1，前三行）。对于地热温泉、池塘和泥浆池等高温酸性水体，需要使用其他设备，其pH值可能具有 &lt; 4 且温度高于 90 °C一根长竹竿或可伸缩的铝合金泳池清洁杆，其末端可固定250 mL瓶子或50 mL离心管，可用于从这些极端环境中采集水样（图1，底行）。在所有情况下，均记录水样的基线数据，包括温度、pH、盐度和GPS坐标。图1，底行，中左。
水样应从采样现场立即运送至野外工作站或实验室内，以便完成样品的预处理（见图8A，灰色框；步骤1.2）。在预处理过程中，使用野外显微镜验证微生物是否存活（见图2D）。
...

本文介绍了从海洋和淡水生态系统的真光层采样的方法，以分离蓝藻噬菌体（及其宿主），以及采样后富集单一基因型并表征病毒-宿主相互作用动态的过程。

对光合微生物及其病毒的环境采样在理解现代海洋和淡水生态系统中起着关键作用……

这些项目的目标是对病毒感染中的生理参数进行量化，然后将组学底物与观察到的生理现象进行关联，从而建立可预测病毒-宿主动态变化的病毒学模型或规律。随着高通量测序技术的发展和生物信息学流程的优化，多组学分析已变得易于实现，这为将生理现象解释为特定组学底物的函数提供了机会。通过实验性感染、电子显微镜、定量PCR、下一代测序以及可靠的生物信息学分析流程，网络分析能够识别组学数据与生理变量之间的关系，进而推动预测模型的构建。最大的挑战是产生具有准确滴度的纯单基因型病毒毒株，以便确定实验感染中的感染复数。滴度测定在病毒学中仍然是一个难题。我们已开发出相应的指标，用于计算在单宿主/单病毒感染情况下，两种病毒感染同一宿主或一种病毒感染不同宿主时的相对毒力。我们已标准化了一种适用于多种病毒系统的实验流程。 首先，在南加州海岸线以外海域进行环境采样。将一根长10英尺、抗压的橡胶软管连接到泵的出口端。将转运泵的电源线插入逆变发电机。组装完成后，对转运泵进行引水排气，并测试以确保泵系统正常运行。将一根长25米、直径为1.25厘米的尼龙船用绳一端固定在14公斤重的蘑菇形锚的吊环上。每隔三米使用胶带将绳索固定在蓝色PVC管上。当水流稳定输送后，将一到两管体积的水排回海洋，以确保来自目标深度的水正在流经水泵。使用20升的水桶收集水样，并运送到野外工作站。将水样通过滤杯组件过滤，然后使用透明乙烯基管将滤杯连接至便携式隔膜真空泵。将样品转移至滤杯中并开始过滤。过滤完成后，将滤液转移至水样收集瓶中，并贴上标签。现在使用手术刀从滤杯组件中切割出滤膜，将其切成两半后转移至一个50毫升离心管中。将50毫升过滤后的海水转移至同一离心管中。为浓缩混合样品，针对每个站点的每个采样深度，将含有细胞碎片的0.45微米滤膜及超滤液运回实验室并进行离心。取60毫升滤液转移至离心滤膜管中，在6,000 g条件下离心10至20分钟以实现浓缩。重复离心操作，直至获得1.5至2毫升的病毒或噬菌体悬液浓缩物。将所得浓缩物转移至一个2毫升的Eppendorf管中，用于后续对处理后的环境样本中的病毒或噬菌体进行透射电子显微镜成像。将环境样本划线接种至已制备的琼脂平板上。为了分离疑似病毒或噬菌体宿主的单菌落，使用无菌接种环将一个菌落转移至新的平板。然后使用同一接种环挑取另一个菌落，并将其转移至含有液体培养基的锥形瓶中。在含有5毫升BG-11培养基的20毫升培养管中，制备10份种子培养物。加入五毫升来自采样点的超滤液与BG-11培养基的混合液。用无菌牙签从培养平板上挑取单个菌落分离物，然后通过将一根牙签投入每根试管中，分别接种每根试管。一旦检测到阳性种子培养物生长，重复划线操作，直至平板上仅出现单一菌落表型。当液体培养和固体培养基平板操作的循环获得单细胞表型后，利用光学显微镜对微生物形态类型进行表征。为检测病毒活性，从工作菌种中在BG-11琼脂平板上培养疑似宿主的蓝细菌或微藻菌苔。当点样或涂布病毒悬液后平板上出现单个噬菌斑时，使用无菌接种环刮取单个噬菌斑。将接种环在10毫升宿主种子培养物中轻轻旋转混匀。为确定宿主范围，制备来自环境样品分离、其他实验室或菌种保藏中心获得的多种潜在宿主的菌苔。通过在规律的时间间隔测量感染与未感染培养物在730纳米处的光密度值，绘制宿主生长曲线。在光学显微镜下，光合微生物的纯培养物表现出不同的形态特征。根据形态学特征以及16S rRNA测序和系统发育分析结果，该分离株被鉴定为属于聚球藻科（Merismopediaceae）的蓝细菌物种。另一种分离株呈现卵圆形绿色细胞，提示可能为集胞藻属（Synechococcus）。集胞藻样菌株 SWII 在 BG-11 琼脂平板上形成致密且均匀的菌苔，非常适合基于平板的噬菌斑检测。phiSBL-14 感染在涂布菌苔的系列稀释噬菌斑检测中引起明显的噬菌斑透明区，并抑制了 SWII 菌株在液体培养中的生长。生长曲线显示，接种高浓度 phiSBL-14 悬液的 SWII 菌株其光密度增长速度明显慢于低浓度噬菌体悬液组和未感染的对照组。未感染的SWII培养物中最大比生长速率最高。感染SWII培养物的透射电子显微镜观察显示存在细胞病变效应，包括膜增厚、胞内颗粒以及膜出泡，而未感染的对照组中未见上述现象。

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Research

科研

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Biology

生物学

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