透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术

我们致力于研究神经可塑性，特别是突触、神经元和胶质细胞可塑性的昼夜节律性变化。我们试图回答突触在昼夜周期以及病理条件下如何发生转变这一科学问题。近年来，本领域的重要进展包括利用多种遗传学工具调控基因表达，结合脑内变化的可视化技术，同时用于研究神经退行性疾病的动物模型也日益增多。我们通过透射电子显微镜发现，小鼠桶状皮层中突触的数量在昼夜周期中发生变化。这种节律具有昼夜节律特征，至少在抑制性突触中是如此：抑制性突触的数量在夜间增加，而兴奋性突触的数量则在白天增加。我们在果蝇脑中也观察到了类似的变化，即该物种的突触数量同样呈现昼夜波动。此外，我们还发现了神经元和胶质细胞形态的结构变化。

[旁白] 首先，取小鼠的小脑，将脑组织分为两个半球。选择其中一个半球，并将其定向，以便能够沿桶状皮层切向切片。然后以60微米的厚度切片，并将切片转移至含有0.1摩尔磷酸盐缓冲液与固定剂按1:5比例配制的溶液中。在光学显微镜下观察切片，仅收集那些清晰显示桶状皮层区域的切片。使用画笔将切片轻柔地转移至小型玻璃培养皿中。用0.1摩尔卡可基二酸缓冲液冲洗脑切片。随后，在含有1.5%铁氰化钾的0.1摩尔卡可基二酸缓冲液中，用1%四氧化锇对切片进行固定。当切片经蒸馏水冲洗后，使用带有25毫米滤器的注射器，缓慢将含1%醋酸铀的70%乙醇逐滴加入各含组织的培养皿中。在4摄氏度条件下于70%乙醇中孵育过夜后，依次用80%、90%和100%乙醇洗涤组织。接着，用丙烯氧化物洗涤组织两次，每次10分钟。下一步，用两毫升Poly/Bed树脂与丙烯氧化物按1:1比例配制的混合液取代丙烯氧化物。盖上盖子，孵育40分钟。将脑切片包埋于两毫升Poly/Bed树脂与丙烯氧化物按3:1比例配制的混合液中。盖上盖子，静置1.5小时。然后，将ACLAR膜裁剪成与标准玻片大小相匹配的片状。使用塑料移液管，将少量树脂滴加至每片ACLAR膜上。用画笔将脑切片从培养皿转移至ACLAR膜上的树脂中。将每一片切片夹在两片ACLAR膜之间，并进行孵育以完成聚合。使用配备2倍物镜的光学显微镜对包埋后的脑切片进行拍照。打开图像时，点击“文件”并选择“打开”，按住Shift键选择多张图像后点击“打开”。从皮层开始进行图像堆叠。在每张图像的“图层1”上右键点击，选择“复制图层”，并在对话框中输入图像编号作为名称。选择其中一张图像作为目标文件，点击“确定”。接下来，使用移动工具手动对齐图像，并根据需要通过“编辑”→“变换”→“旋转”或“翻转”调整方向。如需更精细的调整，可使用“编辑”→“变换”→“扭曲”，单独移动各角点以匹配解剖标志。在图层面板中，将顶层图层的混合模式设置为“叠加”，以辅助对齐。在每张显示桶状皮层的切片中，使用体视显微镜识别选定的桶状结构，并用剃刀将其连同相邻结构一并切下。将切片包埋于树脂块后，将超薄切片收集至涂有Formvar膜的单槽镍网上。在按照前述方法对透射电子显微镜（TEM）图像堆叠进行对齐后，定义分析区域。点击“图层”→“新建”→“图层”，然后点击“确定”。选择矩形工具，进入“图层”→“图层样式”→“描边”。设置描边颜色、宽度及位置为“内部”，然后点击“确定”。绘制一个矩形以定义分析边界，并将填充设置为0%。为添加注释图层，选择“图层”→“新建”→“图层”，然后点击“确定”。使用画笔工具在该图层上标记突触。使用缩放工具和抓手工具，确保注释过程中的精确性。现在，打开用于三维重建的图像堆栈。选择裁剪工具，在整个堆栈中标记包含树突棘的区域，然后按Enter键对所有可见图层裁剪该区域。为实现每次仅显示一个图层，可在图层面板中切换眼睛图标。点击“文件”→“另存为”，命名文件，选择JPG格式，然后点击“确定”，将每张裁剪后的图像单独保存。打开三维重建软件。上传前，点击导航控件中的Z轴或按小键盘7键，以对齐视口视角。接下来，为上传图像，点击“添加”→“图像”→“参考”，然后选择第一张图像并双击确认。为将最终的TEM图像沿z轴定位，点击该图像。在右侧边栏的“对象属性”面板中，在“位置Z”字段输入相应数值。为使所有图像沿z轴均匀分布，选择所有图像对象。按End键打开End面板。进入“编辑”选项卡，点击“Z轴分布”，系统将根据切片厚度自动均匀排布图像。为在每张TEM图像上使用单条曲线手动勾勒树突棘的轮廓，点击“添加”→“曲线”→“圆形”。移动圆形时，按住g键拖动鼠标，然后点击确认位置。按住s键调整大小，再点击确认。接下来，缩放对象以匹配树突棘的形状。随后，修改曲线形状以贴合棘的边界。选择一个控制点，按g键移动该点，点击确认。根据需要使用g或s键调整控制柄点，优化曲线的方向和曲率。为增加细节，按住Shift键选择两个相邻的控制点，右键点击并选择“细分”，以在两者之间插入新点。当曲线准确勾勒出棘的轮廓后，进入“布局”选项卡，右键点击贝塞尔圆形对象，选择“复制对象”且不移动鼠标。为连接合并对象的边缘并形成封闭网格，进入“建模”选项卡。按2键切换至边选择模式。点击“选择”→“全选”，右键点击并选择“桥接边环”以连接各边环。为填补对象顶部的空隙，先点击空白区域取消所有选择。按住Alt键并点击顶部边缘的一条边，以选中整个环。右键点击并选择“挤出边”，沿z轴向上拖动。然后按s键，向内移动鼠标以缩小新环，点击确认。保持该环选中状态，右键点击并选择“由边生成新面”。为平滑最终结构，进入右侧边栏的“修改器”选项卡。点击“添加修改器”，进入“生成”类别，选择“细分曲面”。将视口和渲染层级均设为1，以实现一致的平滑效果。为给各个结构分配颜色，选择目标对象。打开右侧边栏的“材质”选项卡，点击“新建”，并设置基础颜色。选择光源对象以调整场景照明。按住g键并移动鼠标以重新定位光源，点击确认其新位置。为设置渲染用摄像机的位置，调整视口方向，使其正对树突棘，呈现最终输出所需视角。按Ctrl + Alt + 小键盘0键，将摄像机对齐至当前视图。通过选择摄像机，按住g键并移动，以优化构图。即使在未染色的脑切片中，小鼠体感皮层仍可被识别，且尽管各个桶状结构分布在多个切片中，整个桶状皮层区域仍可通过数字工具完成重建。连续的超薄TEM图像使得基于连续视觉证据可靠地将突触分类为兴奋性或抑制性类型成为可能。通过连续切片对树突棘进行三维重建，可实现对棘形态的可视化，揭示出细长型、蘑菇型、短粗型及中间型等多种形态。根据棘长度、颈长度以及棘头和棘颈直径等测量参数，对棘的形态进行了量化分析。