Name: 透射电子显微镜作为分析小鼠桶状皮层昼夜节律突触可塑性的可视化技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 了解透射电子显微镜技术在小鼠桶状皮层中分析昼夜节律突触可塑性的应用。该方法可量化突触数量和树突棘形态在昼夜间的动态变化，揭示抑制性和兴奋性突触的不同节律模式。

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本工作获得了波兰国家科学中心（NCN OPUS20，项目编号 UMO-2020/39/B/NZ7/03366，授予 EP）以及雅盖隆大学医学院（项目编号 N41/DBS/001129，授予 MJ）的资助。

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<li>Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+relationships+between+sleep+and+amyloid-beta+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus.</a> Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).</li>
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作者声明无任何利益冲突。

本文介绍了用于研究小鼠桶状皮层中突触的昼夜可塑性及树突棘重建的方法学。为确保结果可靠，昼夜可塑性研究应至少包含四个时间点。我们的研究表明，在LD 12:12条件下，分别于休息期（白天）和活动期（夜间）采集的两个时间点的数据，能够反映动物在每日不同活动阶段之间的差异。总的突触密度（包括兴奋性和抑制性突触）在休息期（睡眠期间）比活动期（运动活动期间）高出21%。此外，与活动期相比，休息期的兴奋性突触数量增加了约40%，而抑制性突触在活动期则更为丰富，高出26%5。
将分析扩展到四个时间点，能够识别出突触可塑性的日节律模式。总突触密度在一天开始后逐渐下降，在ZT18时达到最低水平，对应夜间中期。兴奋性突触也表现出类似趋势，且下降更为显著。相反，抑制性突触则呈现相反的模式，从ZT0到ZT18期间逐步增加6。
在不同光照条件下（LD 12:12 和 DD）分析突触变化也非常重要，因为比较这些结果可以推断出内在因素和光照对正在进行过程的影响。在...

昼夜节律由生物体内几乎所有生理过程中的生物钟产生。在动物和人类中，昼夜节律已在分子、细胞以及整个生物体水平上被检测到，并体现在其行为中。生物体的昼夜系统由主生物钟（起搏器）和外周生物钟组成。所有生物钟均通过钟控基因的周期性表达产生昼夜振荡，而这些基因的表达又受到其编码蛋白的调控。生物钟的分子机制所产生的节律周期约为1天（可能长于或短于24小时），但在昼夜交替的条件下，内源性节律的周期会被同步为24小时。在无脊椎动物和脊椎动物神经系统的生理过程中已发现多种昼夜节律；然而，一些研究表明，昼夜节律也存在于突触可塑性和神经元可塑性中，即突触和树突的数量与结构的变化1,2,3,4。
小鼠体感皮层因其结构清晰且与动物运动活动直接相关，是全天研究突触可塑性的理想部位5,6,7,8,9。在体感皮层的第四层中，存在明显的神经结构（桶状结构），即使在未染色的大脑中也清晰可见10,11。这些结构的排列方式反映了动物鼻部触须的形态和组织方式，从而能够精确映射感觉刺激。较大的桶状结构排列成五条规则的纵行，每行包含四到七个桶状结构。对应于大触须的桶状结构行用大写字母A至E标记，代表从眼部区域沿鼻部向下排列的触须。每个桶状结构由两个主要区域组成：空腔，即充满神经纤维网的中央部分；以及称为侧壁的外围部分，主要由星形细胞的胞体构成。桶状结构之间由细胞密度较低的区域（称为隔膜）分隔。每个桶状结构接收来自动物鼻部对侧特定触须的冲动输入10,12。
特定桶状结构按规则排列成行，这种分区方式便于快速、准确地识别所选区域10,13。选择B行桶状结构用于分析昼夜节律变化，是基于活动依赖性可塑性相关研究的依据14,15,16,17。B行具有清晰的躯体定位边界，且仅包含四个明显的大桶状结构，有利于在样本中准确定位。由于其位于中枢位置，B行神经元活动与小鼠的自然行为（如环境探索和运动活动）密切相关。在对树突棘和树突干上的突触进行计数时，应选择桶状结构的中央区域，因为该区域的细胞体较为稀疏12,15,18。
免疫组织化学结合共聚焦显微镜成像技术在阐明小鼠突触可塑性的关键机制方面发挥了重要作用。尽管共聚焦显微镜能够提供高分辨率图像，降低背景荧光并提高细胞结构的清晰度，但该技术存在光漂白问题，且需要复杂的样品制备过程，可能改变生物组织的状态。此外，其对荧光标记物的依赖性会因信号重叠而限制可同时研究的蛋白质种类。共聚焦免疫荧光显微镜通过使用抗体检测固定组织切片中的靶抗原，可实现对特定蛋白质、其表达水平及与突触活动相关定位的标记。虽然该方法在研究参与神经传递的多种蛋白质时具有特异性和灵活性，但由于涉及组织固定步骤，无法提供动态过程的实时数据。抗体结合的不一致性也可能导致结果不可靠19,20,21。
与使用光学显微镜的免疫荧光方法相比，电子显微镜能够显著提高分辨率，并在神经结构的定位选择和区分方面实现更高的精确度。连续透射电子显微镜（TEM）切片有助于在超微结构水平上可视化突触结构，并可用于研究突触的形成或消除。TEM使研究人员能够分析突触的物理特性以及突触密度和结构的变化，这些变化被称为突触可塑性。尽管样品制备和成像过程较为耗时费力，但TEM能够更详细地揭示学习、记忆形成以及感觉信息处理过程中，以及昼夜、年周期和动物年龄变化期间所发生的神经结构改变。
本方法旨在通过基于最少四个时间点的取样方案，结合连续透射电子显微镜（TEM）图像的体视学分隔器法，研究突触密度与形态的昼夜节律动态。体视学分隔器法即使仅使用少量超薄连续切片，也能对突触数量进行可靠估算22,23,24,25,26。桶状皮层明确的躯体定位组织结构可确保研究位点的精确解剖学选择，而连续TEM成像则可区分突触类型（兴奋性与抑制性）及其位置（树突棘与树突干上）。该方法为研究昼夜节律及生物钟相关神经可塑性的科研人员提供了有力工具，有助于探索环境因素与内在因素如何影响突触动态变化。本方法的各个组成部分亦可独立应用，适用于更广泛的研究中神经可塑性变化的分析，而不仅限于与昼夜节律相关的变化。

<table><tbody><tr><td>Aclar 薄膜</td><td>Agar scientific</td><td>AGL4458</td><td></td></tr><tr><td>Blender 软件&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>版本：v. 2.91.2</td></tr><tr><td>二甲胂酸钠三水合物</td><td>Polysciences</td><td>01131-100</td><td></td></tr><tr><td>凹面载玻片</td><td>Menzel</td><td>9.161 151</td><td></td></tr><tr><td>金刚石刀片&amp;nbsp;</td><td>Diatome</td><td>15-US</td><td>刀片角度：Ultra 45&amp;deg;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>数码相机&amp;nbsp;</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>DXM 1200 F</td><td></td></tr><tr><td>十二水合磷酸氢二钠</td><td>POCH</td><td>799280115</td><td></td></tr><tr><td>包埋树脂</td><td>Polysciences</td><td>08792-1</td><td>Luft 配方&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Pol-Aura</td><td>PA-11-0004</td><td></td></tr><tr><td>GIMP 软件</td><td></td><td></td><td>版本：v 3.0.4</td></tr><tr><td>柠檬酸铅</td><td>TAAB</td><td>L018</td><td></td></tr><tr><td>光学显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon&amp;nbsp;</td><td>Optiphot</td><td></td></tr><tr><td>四氧化锇&amp;nbsp;</td><td>Polysciences</td><td>0223C-10</td><td>晶体状（99.95%）</td></tr><tr><td>画笔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop 软件</td><td></td><td></td><td>版本：CS5</td></tr><tr><td>铁氰化钾</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>环氧丙烷&amp;nbsp;</td><td>Sigmaaldrich</td><td>82320</td><td>特纯 p.a.，&amp;ge;99.5%（GC）</td></tr><tr><td>单槽载网</td><td>Agar scientific</td><td>AGG2525</td><td>2 × 0.75 mm 或 2 × 1 mm</td></tr><tr><td>氯化钠&amp;nbsp;</td><td>Chempur</td><td>117941206</td><td></td></tr><tr><td>二水合磷酸二氢钠</td><td>Chempur</td><td>117991808</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>pzo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器&amp;nbsp;</td><td>Biosens</td><td>BS25PES045</td><td></td></tr><tr><td>透射电子显微镜&amp;nbsp;</td><td>Joel</td><td>JEM-2100</td><td></td></tr><tr><td>超薄切片机</td><td>Leica</td><td>UC7</td><td></td></tr><tr><td>醋酸铀酰</td><td>Lachema</td><td></td><td></td></tr><tr><td>振动切片机</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr></tbody></table>

透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术

Transmission Electron Microscopy as the Visualization Technique for Analysis of Circadian Synaptic Plasticity in the Mouse Barrel Cortex

研究昼夜突触可塑性需要将小鼠饲养在不同的光照条件下（12小时光照/12小时黑暗循环，LD 12:12，以及持续黑暗，DD），提供跑轮供其活动，并在24小时内四个明确的时间点处死小鼠——分别在白天/主观白天的起始和中期，以及夜晚/主观夜晚的起始和中期。随后对脑组织进行适当固定，用于透射电子显微镜（TEM）观察。桶状皮层因其精确的躯体定位结构，是此类分析的理想模型。为获取所需脑区，使用振动切片机对脑组织进行水平切片，然后挑选包含桶状皮层的切片并将其包埋于Polybed树脂中。从含有目标桶状结构的包埋块中连续切取超薄切片。利用体视学剖分法（stereological dissector method）对电子显微照片中的兴奋性和抑制性突触密度进行分析。此外，TEM图像还用于树突棘的三维重建。树突棘形态的变化表明神经元在一天中发生重塑。在小鼠中，兴奋性突触的数量在睡眠期（白天）达到峰值，而抑制性突触则在其活跃期（夜间中期）达到高峰。

为了将本方法正确应用于昼夜节律性突触变化的分析，首先需要选择至少四个等间隔的时间点，每个活动阶段各包含两个时间点（每6小时一个）。在指定的时间点处死动物并采集其脑组织。该方法有助于识别突触可塑性的日节律或昼夜节律模式，并将其与动物运动活动的变化相关联（图1）。仅使用两个时间点虽可分析不同活动阶段间突触密度的差异，但可能无法准确反映突触变化的真实模式。用于检测昼夜节律效应的统计效能分析表明，每个时间点使用五只动物即可达到超过0.9的统计效能。该样本量在保证统计学稳健性的同时，也兼顾了动物使用的伦理考量，被视为最优选择。
小鼠体感皮层的结构使得研究位置的选择具有高度精确性和可重复性，即使在未染色的脑组织中也能清晰辨认图5A此外，我们的方法能够利用图形软件重建整个桶状皮层区，即使单个桶状列分布在连续切片上，仅通过观察单一切片难以明确识别所选的桶状结构 (图5B)...

本方案描述了使用透射电子显微镜（TEM）定量分析小鼠桶状皮层中昼夜节律变化的方法，主要关注突触数量和树突棘形态的变化。

研究昼夜节律性突触可塑性需要在不同光照条件下饲养小鼠（明暗循环，LD 12:12，以及持续黑暗，DD），……

我们致力于研究神经可塑性，特别是突触、神经元和胶质细胞可塑性的昼夜节律性变化。我们试图回答突触在昼夜周期以及病理条件下如何发生转变这一科学问题。近年来，本领域的重要进展包括利用多种遗传学工具调控基因表达，结合脑内变化的可视化技术，同时用于研究神经退行性疾病的动物模型也日益增多。我们通过透射电子显微镜发现，小鼠桶状皮层中突触的数量在昼夜周期中发生变化。这种节律具有昼夜节律特征，至少在抑制性突触中是如此：抑制性突触的数量在夜间增加，而兴奋性突触的数量则在白天增加。我们在果蝇脑中也观察到了类似的变化，即该物种的突触数量同样呈现昼夜波动。此外，我们还发现了神经元和胶质细胞形态的结构变化。[旁白] 首先，取小鼠的小脑，将脑组织分为两个半球。选择其中一个半球，并将其定向，以便能够沿桶状皮层切向切片。然后以60微米的厚度切片，并将切片转移至含有0.1摩尔磷酸盐缓冲液与固定剂按1:5比例配制的溶液中。在光学显微镜下观察切片，仅收集那些清晰显示桶状皮层区域的切片。使用画笔将切片轻柔地转移至小型玻璃培养皿中。用0.1摩尔卡可基二酸缓冲液冲洗脑切片。随后，在含有1.5%铁氰化钾的0.1摩尔卡可基二酸缓冲液中，用1%四氧化锇对切片进行固定。当切片经蒸馏水冲洗后，使用带有25毫米滤器的注射器，缓慢将含1%醋酸铀的70%乙醇逐滴加入各含组织的培养皿中。在4摄氏度条件下于70%乙醇中孵育过夜后，依次用80%、90%和100%乙醇洗涤组织。接着，用丙烯氧化物洗涤组织两次，每次10分钟。下一步，用两毫升Poly/Bed树脂与丙烯氧化物按1:1比例配制的混合液取代丙烯氧化物。盖上盖子，孵育40分钟。将脑切片包埋于两毫升Poly/Bed树脂与丙烯氧化物按3:1比例配制的混合液中。盖上盖子，静置1.5小时。然后，将ACLAR膜裁剪成与标准玻片大小相匹配的片状。使用塑料移液管，将少量树脂滴加至每片ACLAR膜上。用画笔将脑切片从培养皿转移至ACLAR膜上的树脂中。将每一片切片夹在两片ACLAR膜之间，并进行孵育以完成聚合。使用配备2倍物镜的光学显微镜对包埋后的脑切片进行拍照。打开图像时，点击“文件”并选择“打开”，按住Shift键选择多张图像后点击“打开”。从皮层开始进行图像堆叠。在每张图像的“图层1”上右键点击，选择“复制图层”，并在对话框中输入图像编号作为名称。选择其中一张图像作为目标文件，点击“确定”。接下来，使用移动工具手动对齐图像，并根据需要通过“编辑”→“变换”→“旋转”或“翻转”调整方向。如需更精细的调整，可使用“编辑”→“变换”→“扭曲”，单独移动各角点以匹配解剖标志。在图层面板中，将顶层图层的混合模式设置为“叠加”，以辅助对齐。在每张显示桶状皮层的切片中，使用体视显微镜识别选定的桶状结构，并用剃刀将其连同相邻结构一并切下。将切片包埋于树脂块后，将超薄切片收集至涂有Formvar膜的单槽镍网上。在按照前述方法对透射电子显微镜（TEM）图像堆叠进行对齐后，定义分析区域。点击“图层”→“新建”→“图层”，然后点击“确定”。选择矩形工具，进入“图层”→“图层样式”→“描边”。设置描边颜色、宽度及位置为“内部”，然后点击“确定”。绘制一个矩形以定义分析边界，并将填充设置为0%。为添加注释图层，选择“图层”→“新建”→“图层”，然后点击“确定”。使用画笔工具在该图层上标记突触。使用缩放工具和抓手工具，确保注释过程中的精确性。现在，打开用于三维重建的图像堆栈。选择裁剪工具，在整个堆栈中标记包含树突棘的区域，然后按Enter键对所有可见图层裁剪该区域。为实现每次仅显示一个图层，可在图层面板中切换眼睛图标。点击“文件”→“另存为”，命名文件，选择JPG格式，然后点击“确定”，将每张裁剪后的图像单独保存。打开三维重建软件。上传前，点击导航控件中的Z轴或按小键盘7键，以对齐视口视角。接下来，为上传图像，点击“添加”→“图像”→“参考”，然后选择第一张图像并双击确认。为将最终的TEM图像沿z轴定位，点击该图像。在右侧边栏的“对象属性”面板中，在“位置Z”字段输入相应数值。为使所有图像沿z轴均匀分布，选择所有图像对象。按End键打开End面板。进入“编辑”选项卡，点击“Z轴分布”，系统将根据切片厚度自动均匀排布图像。为在每张TEM图像上使用单条曲线手动勾勒树突棘的轮廓，点击“添加”→“曲线”→“圆形”。移动圆形时，按住g键拖动鼠标，然后点击确认位置。按住s键调整大小，再点击确认。接下来，缩放对象以匹配树突棘的形状。随后，修改曲线形状以贴合棘的边界。选择一个控制点，按g键移动该点，点击确认。根据需要使用g或s键调整控制柄点，优化曲线的方向和曲率。为增加细节，按住Shift键选择两个相邻的控制点，右键点击并选择“细分”，以在两者之间插入新点。当曲线准确勾勒出棘的轮廓后，进入“布局”选项卡，右键点击贝塞尔圆形对象，选择“复制对象”且不移动鼠标。为连接合并对象的边缘并形成封闭网格，进入“建模”选项卡。按2键切换至边选择模式。点击“选择”→“全选”，右键点击并选择“桥接边环”以连接各边环。为填补对象顶部的空隙，先点击空白区域取消所有选择。按住Alt键并点击顶部边缘的一条边，以选中整个环。右键点击并选择“挤出边”，沿z轴向上拖动。然后按s键，向内移动鼠标以缩小新环，点击确认。保持该环选中状态，右键点击并选择“由边生成新面”。为平滑最终结构，进入右侧边栏的“修改器”选项卡。点击“添加修改器”，进入“生成”类别，选择“细分曲面”。将视口和渲染层级均设为1，以实现一致的平滑效果。为给各个结构分配颜色，选择目标对象。打开右侧边栏的“材质”选项卡，点击“新建”，并设置基础颜色。选择光源对象以调整场景照明。按住g键并移动鼠标以重新定位光源，点击确认其新位置。为设置渲染用摄像机的位置，调整视口方向，使其正对树突棘，呈现最终输出所需视角。按Ctrl + Alt + 小键盘0键，将摄像机对齐至当前视图。通过选择摄像机，按住g键并移动，以优化构图。即使在未染色的脑切片中，小鼠体感皮层仍可被识别，且尽管各个桶状结构分布在多个切片中，整个桶状皮层区域仍可通过数字工具完成重建。连续的超薄TEM图像使得基于连续视觉证据可靠地将突触分类为兴奋性或抑制性类型成为可能。通过连续切片对树突棘进行三维重建，可实现对棘形态的可视化，揭示出细长型、蘑菇型、短粗型及中间型等多种形态。根据棘长度、颈长度以及棘头和棘颈直径等测量参数，对棘的形态进行了量化分析。

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透射电子显微镜作为分析小鼠桶状皮层昼夜节律突触可塑性的可视化技术

本报告展示了一种机械分离单个有活性神经元的技术，该神经元保留了附着的突触前末梢。经振动解离获得的神经元具有制备快速、药理学控制优良以及在无邻近细胞干扰的情况下改善空间钳制的优点。该方法可用于突触结构的成像及膜片钳记录。...

从啮齿类动物脑片中振动解离神经元以研究突触传递和成像突触前终末

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小鼠海马神经元中突触囊泡内吞的透射电子显微镜成像

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双光子 体内 使用颅骨变薄制备法对小鼠皮层树突棘进行成像

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活体小鼠背侧海马CA1区的纵向双光子成像

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本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

本文介绍了一种结合腺相关病毒注射与颅窗植入的技术方案，用于在清醒小鼠中同时成像小胶质细胞动态与神经元活动。...

清醒小鼠中小胶质细胞动态与神经元活动的同步成像

了解透射电子显微镜技术在小鼠桶状皮层中分析昼夜节律突触可塑性的应用。该方法可量化突触数量和树突棘形态在昼夜间的动态变化，揭示抑制性和兴奋性突触的不同节律模式。

透射电子显微镜作为小鼠桶状皮层昼夜节律性突触可塑性分析的可视化技术

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