透射电子显微镜作为分析小鼠桶状皮层昼夜节律突触可塑性的可视化技术
August 19th, 2025
所提出的协议描述了使用透射电子显微镜（TEM）来量化小鼠桶状皮层的昼夜节律变化，主要关注突触数和树突棘形态。
我们对神经可塑性感兴趣，特别是突触、神经元和神经胶质细胞可塑性的昼夜节律变化。我们试图回答突触在白天和黑夜以及病理条件下如何转化的问题。我们研究领域的最新发展是使用各种遗传工具来纵基因表达，也使用可视化大脑变化的方法，以及越来越多的动物模型来研究神经退行性疾病。我们使用电子透射显微镜发现，小鼠桶皮层中的突触数量在白天和晚上都会发生变化。而且这种节奏也是昼夜节律的，至少在抑制性突触的情况下是这样。因为抑制性突触，它们在夜间数量增加，而兴奋性突触在白天增加。我们在果蝇的大脑中发现了类似的变化。在这个物种中，突触的数量在白天和晚上也会发生变化。此外，我们还发现了神经元和神经胶质细胞形状的结构变化。
[旁白]首先，取小鼠的小脑，将大脑分成两个半球。选择一个半球并定向它，以便切向桶皮层切部分。然后，以60微米的厚度切割切片，并将它们以一比五的比例转移到含有0.1摩尔磷酸盐缓冲液和固定剂的溶液中。在光学显微镜下检查切片，并仅收集那些清楚地显示桶场皮层的切片。使用画笔，轻轻地将切片转移到一个小玻璃培养皿中。用 0.1 摩尔二甲胂酸冲洗脑切片。然后，将切片固定在含有 1.5% 铁氰化钾的 0.1 摩尔二甲胂酸盐缓冲液中的 1% 四氧化锇中。在蒸馏水中冲洗切片后，使用带有 25 毫米过滤器的注射器将含有 1% 乙酸铀酰的 70% 乙醇缓慢分配到每个装有组织的培养皿中。在4摄氏度的70%乙醇中孵育过夜后，用80%，90%和100%乙醇洗涤组织。然后，用环氧丙烷洗涤组织两次，每次 10 分钟。接下来，用两毫升聚乙烯/床树脂和环氧丙烷的一对一混合物代替环氧丙烷。盖上盖子，孵育40分钟。将脑切片嵌入两毫升的聚乙烯/床树脂和环氧丙烷的三比一混合物中。盖上盖子静置 1.5 小时。然后，将 ACLAR 胶片切割成与标准载玻片尺寸相匹配的碎片。使用塑料移液器，将少量树脂涂抹在每个 ACLAR 薄膜片上。用画笔将大脑切片从培养皿转移到 ACLAR 薄膜上的树脂上。将每个部分嵌入两片 ACLAR 薄膜之间，并孵育聚合。使用具有两倍物镜的光学显微镜，拍摄嵌入的大脑切片。要打开图像，请单击“文件”并打开，按住 Shift 键选择图像，然后单击“打开”。开始从皮层堆叠图像。右键单击每个图像中的图层 1，选择复制图层，然后在对话框中输入图像编号作为名称。选择一张图像作为目标文件，然后单击确定。接下来，使用移动工具手动对齐图像，并根据需要使用编辑、变换、旋转或翻转调整方向。要进行更精细的调整，请使用“编辑”、“变换”、“扭曲”和单独移动角以匹配解剖标志。在“图层”面板中将顶层的混合模式设置为叠加，以方便对齐。在显示桶皮层的每个部分中，使用体视显微镜识别所选桶，并使用剃须刀片将其与相邻桶一起切出。将切片嵌入树脂块中后，将超薄切片收集到 Formvar 涂层的单槽镍网格上。如前所述对齐 TEM 图像堆栈后，定义分析区域。单击“图层”，然后单击“新建”和“图层”，然后单击“确定”。选择“矩形”工具，转到“图层”、“图层样式”、“描边”。将描边颜色、粗细和位置设置为“内侧”，然后单击“确定”。现在，绘制一个矩形来定义分析边界，然后选择填充 0%。要添加用于注释的新图层，请选择“图层”、“新建”、“图层”，然后单击“确定”。使用“画笔”工具标记此图层上的突触。使用缩放工具和手形工具确保注释时的精度。现在，打开用于 3D 重建的图像堆栈。选择裁剪工具，标记堆栈中包含树突棘的区域，然后按 Enter 键在所有可见图层中裁剪该区域。要一次仅显示一个图层，请切换“图层”面板中的眼睛图标。单击“文件”、“另存为”，为文件命名，选择 JPG 格式，然后单击“确定”以单独保存每个裁剪后的图像。打开 3D 重建软件。上传之前，单击导航小工具上的 Z（Z） 或按数字键盘 7 对齐视口透视。接下来，要上传图像，请单击“添加”、“图像”、“引用”，然后选择第一张图像并双击确认。 要沿z轴定位最终TEM图像，请单击图像。在右侧边栏的“对象属性”面板中，在“位置 Z”字段中输入适当的值。要沿 z 轴均匀分布所有图像，请选择所有图像对象。按“结束”打开“结束”面板。导航到编辑选项卡，然后单击分布 Z 以根据截面厚度自动间隔它们。要使用每张图像的单条曲线手动勾勒出每个 TEM 图像上的树突棘形状，请单击添加、曲线和圆。要移动圆，请按住 g，拖动鼠标，然后单击以确认放置。按住 以调整大小，然后单击以确认。接下来，缩放对象以与树突棘的形状对齐。现在，修改弯曲形状以适合脊柱边界。选择一个控制点，按 g，移动该点，然后单击确认。根据需要使用 g 或 s 键调整手柄点，细化曲线的方向和强度。要添加更多细节，请按住 Shift 并选择两个相邻的控制点。然后右键单击并选择“细分”以在它们之间插入一个新点。曲线准确勾勒出书脊轮廓后，进入“布局”选项卡，右键单击贝塞尔圆对象，然后选择“复制对象”，而无需移动鼠标。要连接连接对象的边缘并形成闭合网格，请进入“建模”选项卡。按 2 切换到边缘选择模式。单击“选择”、“全部”，单击鼠标右键，然后选择“桥接边缘环”以将边缘环链接在一起。要填充对象顶部的间隙，请通过单击对象旁边的 取消选择所有。按住 Alt 键并单击顶部壁架的一条边缘以选择整个循环。右键单击并选择“拉伸边”，沿 z 轴向上拖动。现在，按 s，将鼠标向内移动以缩小新循环，然后单击确认。在循环仍处于选中状态的情况下，右键单击并选择“从边新建面”。要平滑最终结构，请转到右侧边栏上的“修饰符”选项卡。单击 添加修改器（Add Modifier），导航到 生成（Generate），然后选择 细分曲面（Subdivision Surface）。将视口和渲染级别设置为 1 以实现一致的平滑。要为单个结构分配颜色，请选择所需的对象。打开右侧边栏上的“材质”选项卡，单击“新建”，然后设置基色。选择光源对象以调整场景照明。按住 g，移动鼠标重新定位灯，然后单击确认其新位置。要定位摄像机以进行渲染，请将视口定向为面向树突棘，因为它应该出现在最终输出中。按 Control + Alt + 数字键盘 0 将相机捕捉到当前视图。通过选择相机框架，按住 g 并移动它来调整相机框架以细化取景。即使在未染色的大脑切片中，小鼠体感皮层也是可以识别的，尽管单个桶分布在多个部分，但可以使用数字工具重建整个桶场。连续的超薄 TEM 图像能够根据连续视觉证据将突触可靠地分类为兴奋性或抑制性类型。从连续切片对树突棘进行三维重建，可以可视化脊柱形态，揭示不同的形状，如细刺、蘑菇刺、粗刺和中间刺。脊柱形状根据测量结果进行量化，包括脊柱长度、颈部长度以及脊柱、头部和颈部的直径。
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概述
本研究提出了一种使用透射电子显微镜（TEM）来调查小鼠桶状皮层昼夜变化的协议，重点关注突触数量和树突芽形态。该研究旨在了解突触如何昼夜变化，揭示全天和夜晚抑制性和兴奋性突触数量的不同模式。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 神经可塑性
- 昼夜节律
背景
- 调查昼夜节律下的神经可塑性。
- 重点关注小鼠桶状皮层的突触转化。
- 将研究结果与果蝇大脑中的类似变化进行比较。
- 使用基因工具来操纵模型中的基因表达。
研究目的
- 量化突触数量和形态的昼夜变化。
- 探索突触变化与一天中的时间之间的关系。
- 在病理背景下理解转化机制。
使用的方法
- 采用透射电子显微镜（TEM）进行视觉分析。
- 利用小鼠模型观察突触行为。
- 详细的大脑切片准备和包埋协议。
- 在处理过程中分析突触和形态结构。
主要结果
- 观察到突触数量的变化；夜间抑制性突触增加，而白天兴奋性突触达到高峰。
- 识别出神经元和胶质细胞结构修改，与昼夜周期相对应。
- 研究结果有助于理解突触可塑性动态响应于时间影响。
结论
- 该研究展示了小鼠桶状皮层突触变化的显著昼夜模式。
- 结果提供了对神经元机制的见解，并对神经退行性疾病有潜在影响。
- 增强了对昼夜节律如何影响神经可塑性的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Transmission electron microscopy (TEM) enables high-resolution quantification of circadian synaptic plasticity in the mouse barrel cortex, providing critical insight into time-dependent neural remodeling. This approach supports mechanistic de-risking and predictive confidence for early-stage neuroscience target validation. The method's quantitative outputs inform portfolio decisions by clarifying the temporal dynamics of synaptic changes relevant to neurodegenerative and circadian biology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Quantitative visualization of excitatory and inhibitory synapse dynamics supports functional target validation.
- Temporal mapping of synaptic remodeling enables mechanistic de-risking for circadian and neuroplasticity targets.
- Serial TEM imaging clarifies pathway involvement and biological context for candidate targets.
Screening & Assay Development
- Preparation of validated brain sections ensures reproducible assay conditions for downstream analysis.
- Stereological dissector methods provide standardized, quantitative synapse density measurements.
- 3D dendritic spine reconstructions enable robust morphological phenotyping for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Alignment of synaptic plasticity metrics with circadian phases enhances disease-relevant model fidelity.
- Quantitative outputs support translational biomarker development for neurodegenerative research.
- Continuity from discovery to preclinical validation is strengthened by reproducible, high-content imaging data.
Pipeline & Workflow Integration
This TEM-based workflow integrates from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing and quantitative phenotyping of synaptic changes across circadian cycles.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven interrogation of synaptic plasticity and circadian regulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative synapse and spine morphology data for assay development.
- Analytics: Delivers high-content, statistically analyzable outputs for condition comparison and decision support.
- Translational Research: Facilitates alignment of preclinical models with human circadian and neuroplasticity mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging and analysis platform for diverse neuroscience programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes quantitative imaging and analysis for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroscience portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of circadian and neuroplasticity assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in TEM operation, stereological analysis, and 3D reconstruction software.
- Demands access to advanced imaging infrastructure and digital analysis tools.
- Cross-team standardization is essential for reproducibility and data comparability.
- Adaptation to other brain regions or species may require protocol optimization.
- Throughput is limited by manual sectioning, imaging, and annotation steps.
