生产 SARS-CoV-2 病毒样颗粒系统以研究体外病毒生命周期

我们提出了一种优化的 体外 方案，用于生产与真实病毒非常相似的 SARS-CoV-2 病毒样颗粒。这种方法能够研究病毒感染、组装和出口机制，而不受生物安全 3 级实验室的限制。

我们的研究重点是了解SARS-CoV-2病毒的生物学，并尝试寻找针对SARS-CoV-2的药物，特别是中药。所有活的 SARS-CoV-2 病毒研究都必须在生物安全三级实验室进行控制。这种实验限制使得 SARS-CoV-2 研究只能在少数人中实现。SARS-CoV-2病毒类研究的实用方法，不受生物安全三级实验室的限制，该列表将是一个非常有用的方法。

[导师]首先，将大约 300 万个 HEK-293T 细胞接种在直径 10 厘米的组织培养板中，并含有 DMEM 完全培养基，并补充 10% FBS 和 1% 青霉素 - 链霉素。在37摄氏度和5%二氧化碳下培养细胞约24小时。在显微镜下检查细胞的协同流畅性。用无血清培养基从每毫升一毫克储备溶液中稀释 60 微升 PEI，以达到 200 微升的最终体积。现在，取 200 微升无血清培养基，加入 6.7 微克 N 质粒、10 微克 Luc-T20 质粒、0.016 微克 S 质粒和 3.3 微克 M-IRES-E 质粒。将稀释的PEI溶液轻轻加入含有病毒结构蛋白质粒包被的溶液中，并在室温下孵育混合物10分钟。这是转染溶液。小心地将转染溶液滴到 HEK-293T 细胞上，并轻轻旋转组织培养板以确保彻底混合。感染后6小时将细胞培养基与DMEM完全培养基交换，并将转染的HEK-293T细胞在37摄氏度下与5%二氧化碳孵育48小时。收集受感染的 HEK-293T 细胞的上清液，其中含有 SARS-CoV-2 病毒样颗粒。通过 0.45 微米注射器过滤器过滤收集的上清液，以去除细胞碎片。这是 SC2-VLP 介质。将 40,000 个血管紧张素转换酶 2 或 ACE2 稳定表达的 HEK-293T 细胞接种，并在 96 孔板中TMPRSS2，并加入 50 微升 SC2-VLP 培养基。将 96 孔组织培养板与 5% 二氧化碳在 37 摄氏度下孵育 24 小时。孵育后，从96孔板的每个孔中取出培养基，并用预热至37摄氏度的100微升PBS洗涤一次。用 20 微升被动裂解缓冲液裂解接种有 ACE2 TMPRSS2 细胞的 HEK-293T 细胞，并在室温下在轨道振荡器上轻轻摇动样品 15 分钟。使用冷藏微孔板离心机在4摄氏度下以4,000 G旋转96孔板15分钟，然后立即将板转移到冰浴中。将 100 微升重构荧光素酶测定缓冲液放入新的不透明白色 96 孔板中，并在每个孔中加入 20 微升裂解物。上下移液两到三次短暂混合。使用酶标仪测量发光信号。接下来，为了评估 SC2-VLP 培养基的组成，将 1.36 毫升 PEG 8000 溶液添加到 10 毫升 SC2-VLP 培养基中。将混合物放在轨道摇床上，在四摄氏度下缓慢混合过夜。将溶液在 4 摄氏度和 2,000 G 下离心 30 分钟。并收集SC2-VLP沉淀进行蛋白质印迹分析。将大约 300 万个 HEK-293T 细胞均匀地接种在直径为 15 毫米的玻璃底培养皿中，并让细胞粘附和生长，直到它们达到大约 70% 的汇合度。如前所述，用修饰的质粒量横切细胞后，用一毫升冰冷的PBS轻轻洗涤培养皿两次。在室温下加入一毫升4%多对异形醛固定溶液，孵育15分钟。在室温下用一毫升PBS洗涤细胞两次，每次五分钟，并通过加入一毫升0.25%Triton X-100来透化细胞10分钟。再次，在室温下用一毫升PBS洗涤细胞两次，每次五分钟。然后加入一毫升5%牛血清白蛋白一小时，阻断非特异性抗体相互作用。加入约200微升一抗溶液以覆盖玻璃底部，并在4摄氏度下孵育过夜。然后，除去一抗溶液，并在室温下用一毫升PBS洗涤细胞三次，每次五分钟。 现在，加入荧光偶联的二抗溶液，在室温下孵育一小时。用PBS洗涤细胞3次后，在室温下用每毫升2.5微克Hoechst溶液染色细胞核5分钟。最后，用PBS洗涤细胞后，观察S蛋白或细胞器染色，然后使用共聚焦显微镜获取图像。该图说明了SC2-VLP生产对编码刺突蛋白的质粒的不同转染量的敏感性。转染0.016微克S质粒时SC2-VLP滴度最高，转染0.16微克和1.6微克S质粒时，SC2-VLP滴度显著降低。与野生型相比，刺突蛋白中的 H1271 到 E 突变显着降低了 SC2-VLP 滴度。E1262 至 H 突变导致 SC2-VLP 滴度适度降低，而 E1262 至 H、H1271 至 E 双突变完全消除了产量。与野生型相比，E1262 至 H 和双突变体泳道中的全长 S 和 S-2 蛋白条带减少。E1262 对 H 和 H1271 对 E 突变体的 S 包装效率也降低，在双突变体中几乎被消除。野生型和所有 S 突变体的 VLP 丰度基本保持不变。野生型 S 蛋白与顺式高尔基体标记物 GM130 共定位，但不与 ER 标记物 Sec61 β 或 ERGIC 标记物 ERGIC 53 共定位。H1271 至 E 突变体 S 蛋白表现出弥漫性细胞质分布，与 GM130 缺乏共定位。