使用拟南芥莲座丛分离和分析叶表和质外 RNA 的分步指南
2025年8月8日
我们描述了一种简单但高度可重复的方法，用于从拟南芥植物的叶表和质外体中分离细胞外 RNA。
我们试图了解植物如何调节其微生物组，以及植物分泌的 RNA 是否调节定植在植物中的原核和真核微生物的基因表达。我们结合使用高分辨率壳电泳和基于 Illumina 的分析来评估叶子表面存在的 RNA，以及它们如何响应生物胁迫而变化。虽然最近的研究表明细胞外 RNA 被真菌和细菌病原体吸收，但 RNA 摄取的潜在机制和这种摄取的功能后果在很大程度上仍未被探索。
首先，每次复制取六到七周大的拟南芥植物。在开始分离叶面洗涤之前，将轮廓 L-77 添加到无菌 VIB 中。然后使用量筒将 100 毫升制备的 VIB 溶液转移到 500 毫升的喷雾瓶中。
使用细剪刀，小心地将拟南芥莲座丛从根部取下。之后，用软刷清除花瓣上多余的污垢。将分离的玫瑰花结放在平坦的托盘上，远轴面朝上。
然后使用五泵装满 VIB 和润湿剂的喷雾瓶喷洒远轴表面。小心地将玫瑰花结翻转过来并喷洒近轴表面。准备底部有孔的改良注射器，用对位膜包裹在颈部，将尖端悬挂在瓶底上方。
要恢复叶子表面洗涤液，请将喷洒的莲座丛轻轻插入放置在250毫升离心瓶内的无针60毫升改性注射器中，然后将两泵坚固的缓冲液喷入注射器中。然后将装载的瓶子在 100 G 下在 4 摄氏度下离心 10 分钟。现在通过0.22微米注射器过滤器过滤回收的叶子表面洗涤液，并将滤液收集在50毫升离心管中，保持在冰上。
对于叶面拭子法，以与上一步中描述的相同方式用VIB和润湿剂溶液喷洒分离的莲座丛。要回收叶面拭子，请使用无菌棉尖棒擦拭莲座丛的近轴和远轴表面。然后将浸泡过的吸头压在 15 毫升离心管的内壁上以提取液体。
通过0.22微米注射器过滤器过滤提取的叶面拭子样品，进入放置在冰上的两毫升管中。将之前用于叶面清洗或拭子分离的同一组植物放入干净的烧杯中，并用蒸馏水轻轻冲洗两次。要用 VIB 真空浸润玫瑰花结，请小心地将冲洗过的玫瑰花结放入含有 300 至 500 毫升 VIB 的法式压榨咖啡机中。
盖上盖子并轻轻降低柱塞，直到玫瑰花结完全浸没。将法式压滤机插入真空室，使用真空泵施加真空 20 秒，直到植物充分渗透。松开真空后，将法式压榨机从腔室中取出并取下盖子。
将 VIB 倒入 500 毫升塑料烧杯中，取出玫瑰花结。然后轻轻摇动莲座丛，将叶子刷在纸巾上以去除多余的缓冲液。现在使用吸墨纸轻轻吸干叶子表面以去除任何残留的缓冲液。
要收集非塑料清洗液，请将 VIB 浸润的玫瑰花结插入 60 毫升无针注射器中，像以前一样放置在 250 毫升离心瓶内。将瓶子以 600 G 在 4 摄氏度下离心 30 分钟，缓慢加速。然后通过放置在冰上的 15 毫升管中的 0.22 微米注射器过滤器过滤汇集的非再生障碍洗液。
使用丙烯酰胺和双溶液制备或购买含有 10% 或 15% 聚丙烯酰胺和七摩尔尿素的三硼酸 EDTA 缓冲液中的微型凝胶。然后将 RNA 样品与两次变性上样缓冲液混合。将混合物在 65 摄氏度下加热五分钟，然后立即将其放在冰上。
现在，通过施加 220 伏约 1 小时 15 分钟，在室温下将 RNA 样品分离在 0.5 倍 TBE 运行缓冲液中。然后用赛博金核酸凝胶染色剂在0.5倍TBE中染色凝胶10分钟。用蒸馏水冲洗凝胶两次，并使用成像系统对其进行成像。
要量化分离的 RNA 条带，请使用分析和凝胶分析菜单下 Image J 文档中的凝胶分析方法。通过在 RNase 和 DNase 游离水中稀释细胞裂解物 RNA 来制备用于两次技术重复的 RNA 标准品。要制备1.5倍的cyber gold核酸凝胶染色剂，将其溶解在pH值为8的500毫摩尔tris HCL缓冲液中。
对于微孔板设置，向每个孔中加入 99 微升蒸馏水。接下来，向每个孔中添加一微升 RNA，对 RNA 样品和标准品使用相同的体积。最后，向每口井中加入 50 微升赛博金溶液。
要设置微孔板读标仪参数，请选择线性或轨道摇动三秒钟。将酶标仪设置为荧光终点模式，激发波长为496纳米，发射波长为540纳米。使用 RNA 标准品中的荧光强度值构建校准线。
变性 RNA 凝胶分析表明，叶面洗涤液和再生障碍洗涤液样品都含有广泛的 RNA 大小，包括长 RNA 和小 RNA 物种。当归一化为植物新鲜重量时，从再生障碍洗涤液和叶片表面洗涤液中分离的总 RNA 量相似。叶面洗涤、再生障碍洗涤和细胞裂解物的 RNA 谱显着不同，证实了细胞内 RNA 污染最小，并表明再生障碍 RNA 经过高度处理，在囊泡分离缓冲液中添加 0.001% 轮廓 L-77 的弥漫性低分子量条带与不含润湿剂的缓冲液相比，叶片表面的 RNA 产量几乎翻了一番。
但将该浓度提高到0.01%并没有进一步提高RNA回收率。对相同叶子的第二次洗涤回收了第一次洗涤中获得的大约 63% 的 RNA，表明叶子表面正在进行 RNA 分泌。使用基于荧光的微量滴定板测定法进行 RNA 定量，在 cyber gold 和 RIBO 488 检测方法中均显示出与 RNA 浓度的高线性。
我们已经证明，tRNA 和 tRNA 衍生片段或 TDR 在细胞外 RNA 中特别丰富，这可能是由于它们对降解的抵抗力。因此，我们认为这些 TDR 可能调节细菌中的基因表达。我们希望确定叶表RNA的细胞来源以及该叶表RNase在计划中的微生物相互作用中可能发挥的生物学作用。
概览
本研究提出了一种从拟南芥植物的叶面和质外体中分离胞外RNA的可重复方法。该方法结合了高分辨率的质外体电泳和基于Illumina的分析，用于研究RNA在生物胁迫响应中的动态变化。
关键研究组成部分
科学领域
- 植物分子生物学
- RNA生物学
- 微生物组相互作用
背景
- 了解植物-微生物相互作用对农业进步至关重要。
- 胞外RNA可能在调节微生物基因表达中发挥作用。
- 目前关于微生物摄取RNA的知识有限。
- 拟南芥作为研究这些相互作用的模式生物。
研究目的
- 分离和分析拟南芥的胞外RNA。
- 评估RNA在生物胁迫下的变化情况。
- 探索植物分泌RNA的潜在功能作用。
使用的方法
- 使用VIB溶液分离叶面洗涤液和质外体洗涤液。
- 高分辨率质外体电泳用于RNA分析。
- 基于Illumina的分析用于RNA表征。
- 使用凝胶分析和微板阅读器进行RNA定量。
主要结果
- 叶面洗涤液和质外体洗涤液中都包含各种大小的RNA。
- 添加润湿剂显著提高了RNA产量。
- 确认了细胞内RNA污染很少。
- 在不同样本类型之间观察到不同的RNA分布。
结论
- 该方法提供了一种研究植物胞外RNA的可靠方法。
- 研究结果有助于理解植物-微生物相互作用。
- 需要进一步研究来阐明这些RNA的功能作用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolation and quantitative analysis of extracellular RNA (exRNA) from Arabidopsis leaf surfaces and apoplast enables mechanistic interrogation of plant-microbe molecular exchange. This workflow supports predictive confidence in understanding RNA-mediated signaling and its impact on microbial gene regulation. The protocol's reproducibility and quantitative rigor position it as a foundational tool for early discovery and target validation in plant-microbe interaction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables hypothesis-driven investigation of RNA secretion and uptake mechanisms at the plant-microbe interface.
- Supports functional target validation by distinguishing extracellular from intracellular RNA populations.
- Facilitates mechanistic de-risking by quantifying RNA species and their potential regulatory roles.
Screening & Assay Development
- Provides validated protocols for isolating and quantifying exRNA from distinct plant compartments.
- Standardizes sample preparation and filtration to minimize contamination and maximize reproducibility.
- Generates quantitative outputs suitable for downstream comparative and screening assays.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker discovery by enabling molecular profiling of plant responses to biotic stress.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of RNA-mediated plant-microbe interactions.
- Offers predictive value for identifying RNA species with potential regulatory impact on microbial communities.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical model development in plant-microbe research.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on RNA secretion, uptake, and functional consequences in plant-microbe systems.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative exRNA profiles for comparative analysis across experimental conditions.
- Analytics: Employs gel electrophoresis and fluorescence-based quantification for robust measurement of RNA species.
- Translational Research: Facilitates identification of candidate RNA biomarkers relevant to plant health and microbial modulation.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable for diverse plant systems and scalable for high-throughput applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in plant-microbe molecular exchange and target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable RNA isolation and analysis workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by providing quantitative, contamination-minimized exRNA data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of plant-microbe interaction targets and mechanistic hypotheses.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant molecular biology and RNA handling.
- Needs access to centrifugation, filtration, gel electrophoresis, and fluorescence quantification instrumentation.
- Demands rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and data comparability.
- Adaptable to other plant models with protocol optimization for tissue type and RNA yield.
- RNA yield and contamination risk are influenced by buffer composition and filtration stringency.
