流式细胞术和单细胞分析表征小鼠出生后早期大脑发育中的小胶质细胞激活
2025年10月3日
该协议结合了流式细胞术和单细胞RNA测序，以分离和表征出生后早期小鼠大脑小脑中的小胶质细胞状态。它使用酶解离、Percoll 离心和免疫染色来揭示小胶质细胞的异质性，并提高对其在小脑发育和疾病中的作用的理解。
我们的研究探讨了小胶质细胞如何影响产前脑损伤后的大脑修复。我们的目标是确定调节小胶质细胞活性是否可以改善长期神经系统结果。我相信这是小胶质细胞反应的复杂性，以及以最准确的方式描述这些反应以代表生理反应以及病理反应和疾病的挑战。
我们正在使用不同的模式，例如单细胞 RNA 测序和流式细胞术实验，来表征产前损伤后发育中大脑中的小胶质细胞状态和功能。一个主要挑战是在分离过程中保持细胞活力和小胶质细胞身份，特别是在小脑细胞数量有限的新生儿时间点。它提出了关于生命早期小脑损伤如何导致小胶质细胞亚群的转录改变以及靶向治疗如何调节这些变化的问题。
首先，根据需要解剖小鼠的特定大脑区域。使用镊子，将组织转移到装有小胶质细胞培养基的小培养皿中，置于冰上以维持细胞活力。使用移液器，从培养皿中取出小胶质细胞培养基。
然后，用手术刀在同一个培养皿中将脑组织切细。将均质的脑组织转移到五毫升管中进行酶消化。向每个试管中加入两毫升补充有胶原酶D和DNase 1的汉克斯平衡盐溶液，并用封口膜紧紧密封盖子。
然后，将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟，每五分钟摇晃一次。要停止消化，请将试管放在冰上。然后，将匀浆通过 140 微米金属网过滤器以去除大碎屑。
使用玻璃杵轻轻解离过滤器上剩余的细胞。每次洗涤用三毫升小胶质细胞培养基多次清洗金属网过滤器。现在，使用 10 毫升移液器收集滤液并将其转移到 15 毫升管中。
然后，将试管以 500g 在 4 摄氏度下离心 7 分钟。然后，小心地倒置管以丢弃上清液。使用架子，轻轻刮擦管以重悬沉淀。
然后，向重悬的细胞中加入 10 毫升 37% 二氧化硅基胶体培养基溶液。以最小的断裂力将溶液以 500g 离心 10 分钟，在 4 摄氏度下。使用 10 毫升移液器，从溶液顶部吸出髓鞘层。
要洗涤细胞，请加入 10 毫升 Hanks 平衡盐溶液，并在 4 摄氏度下以 500g 离心管 7 分钟。弃去上清液并重悬沉淀后，向管中加入10毫升荧光激活细胞分选缓冲液。离心后，将最终沉淀重悬于剩余的缓冲液中，用于下游应用。
将所有分离的细胞转移到具有锥形底部的 96 孔板中。将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。快速倒置板以丢弃上清液。
然后，将细胞沉淀重悬于 25 微升封闭溶液中，并将板在室温下孵育 15 分钟。要制备细胞外抗体染色混合物，请将抗体储备管以 10， 000g 离心以去除聚集体。在不干扰沉淀的情况下，从上清液中吸出所需体积。
使用荧光激活的细胞分选缓冲液，将总体积调整为 25 微升。现在，向每个孔中加入 25 微升细胞外抗体染色混合物，并在室温下孵育板 20 分钟。在不混合的情况下，向每个孔中加入 150 微升荧光激活细胞分选缓冲液。
将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后，快速倒置板以一次动作去除上清液。将细胞沉淀重悬于 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液中，并如前所述离心。
将细胞重悬于100微升皂苷-多聚甲醛缓冲液中，以固定和透化细胞。然后，将板在室温下孵育 10 分钟，避光。在不混合的情况下，向每个孔中加入 100 微升皂苷缓冲液。
将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 6 分钟。然后，倒置板以单次运动除去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 微升皂苷缓冲液中。接下来，通过向 11 个空孔中添加 20 微升珠子来制备补偿对照。
为了制备细胞内抗体染色混合物，将抗体储备管以10， 000g离心以去除潜在的聚集体。在不干扰沉淀的情况下，从上清液中吸出所需体积。使用皂苷缓冲液将体积调节至 50 微升。
然后，将细胞沉淀重悬于 50 微升细胞内抗体混合物中。将每种抗体一微升加入相应的珠孔中，并在室温下孵育板 30 分钟。在不混合的情况下，向每个含有细胞样品的孔中加入 150 微升皂苷缓冲液。
向每个补偿对照孔中加入 100 微升荧光激活细胞分选缓冲液以洗涤磁珠。板离心后，将细胞沉淀和对照分别重悬于 200 微升皂苷缓冲液和荧光激活细胞分选缓冲液中。将板以500g在4摄氏度下离心6分钟，除去上清液。
将细胞样品和补偿对照重悬于 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液中。将悬浮液转移到标记的荧光激活细胞分选管中。单细胞 RNA 测序根据转录谱鉴定出与其他脑细胞类型分开的不同小胶质细胞簇。
差异表达分析显示，小胶质细胞中基因显著上调，包括Csf1r、Fcrls、Fyb、Adap2和P2ry12。小胶质细胞根据其对CD45和CD11b标记物的不同表达，成功地从活脑样本中分离出来。根据激活标志物的组合鉴定出不同的小胶质细胞亚群，包括 CD80、CD86、iNOS、CD206 和 Arg1、CD86 和 CD64，以及 CD163 和 CD206。
Ptprc 和 Itgam 的标记基因表达在 umap 投影中特异性定位于小胶质细胞簇，证实了这些细胞的身份。小提琴图分析显示，与载体对照相比，处理过的小胶质细胞中抗炎标志物（如 Fcgr1 和 Cd86）的表达较低。
概述
该协议结合了流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征早期出生后小鼠大脑小脑中的小胶质细胞状态。它采用酶解和Percoll离心，结合免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，增进了对其在小脑发育和疾病中作用的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 小胶质细胞在大脑发育和功能中起着关键作用。
- 了解小胶质细胞动态可以阐明它们在各种疾病中的作用。
- 表征小胶质细胞状态对于开发靶向治疗至关重要。
- 单细胞分析提供了对细胞异质性的见解。
研究目的
- 分离和表征小胶质细胞在小脑中的状态。
- 增进对小胶质细胞在大脑发育中作用的理解。
- 为小胶质细胞在疾病过程中的参与知识做出贡献。
所使用的方法
- 主要平台是流式细胞术结合单细胞RNA测序。
- 生物模型包括早期出生后的小鼠大脑，重点关注小脑小胶质细胞。
- 重要步骤包括酶解和Percoll离心以分离细胞。
- 使用免疫染色技术来进一步分析小胶质细胞特性。
主要结果
- 研究成功分离了小胶质细胞状态，揭示了它们的异质性。
- 获得了小胶质细胞在小脑发育过程中的作用见解。
- 增进了对小胶质细胞在疾病机制中的影响的理解。
结论
- 这项研究展示了一种分析小胶质细胞状态的强大方法。
- 它对理解神经元机制和潜在疾病模型做出了重要贡献。
- 研究结果可能为针对小胶质细胞功能的未来治疗策略铺平道路。
常见问题
Executive Industry Relevance
High-resolution characterization of microglial activation states in early postnatal mouse brain development is critical for de-risking neuroinflammation targets and understanding developmental mechanisms. Integrating flow cytometry and single-cell RNA sequencing enables robust, quantitative profiling of microglial heterogeneity, supporting predictive confidence in target validation and translational research. These methods provide a reproducible framework for advancing neuroimmune discovery programs and informing portfolio decisions in neurodevelopmental and neurodegenerative disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of microglial activation states and population diversity.
- Supports functional target validation by linking surface marker expression to transcriptomic profiles.
- Facilitates mechanistic de-risking of neuroimmune pathways in early development.
- Provides quantitative data for triaging neuroinflammation targets.
Screening & Assay Development
- Delivers validated cell isolation and gating strategies for reproducible microglia assays.
- Standardizes live/dead discrimination and marker profiling for downstream screening workflows.
- Enables scalable preparation of high-quality neural cell suspensions for compound evaluation.
- Supports platform reuse across multiple experimental conditions and perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns microglial phenotyping with disease-relevant transcriptomic signatures.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of neuroimmune mechanisms.
- Supports risk-adjusted advancement of neurodevelopmental and neurodegenerative models.
- Provides a foundation for translational biomarker identification in microglia-driven pathologies.
Pipeline & Workflow Integration
This dual-method workflow bridges early discovery and preclinical research by enabling robust microglial profiling from cell isolation to transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial activation and diversity during brain development.
- Screening: Provides standardized, quantitative outputs for microglial marker expression and viability.
- Analytics: Delivers high-dimensional single-cell data and differential gene expression outputs for condition comparison.
- Translational Research: Connects microglial phenotypes to disease-relevant states and experimental perturbations.
- Enterprise Reuse: Offers adaptable protocols for diverse brain regions and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in neuroimmune target validation and mechanistic understanding.
- Operational Value: Enhances reproducibility, standardization, and scalability of microglial profiling workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroinflammation portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neuroimmune targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, single-cell RNA sequencing, and neural tissue handling.
- Demands access to advanced instrumentation and bioinformatics infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of cell isolation and gating protocols.
- Adaptable to other brain regions with protocol optimization for tissue-specific characteristics.
- Dependent on validated antibodies and careful control of cell viability and state during processing.
