Name: 流式细胞术和单细胞分析表征小鼠出生后早期大脑发育中的小胶质细胞激活 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-10-03T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 学习流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征小鼠出生后早期小脑中的小胶质细胞状态。该方法结合酶解消化和Percoll离心，揭示细胞异质性，助力神经发育与疾病机制研究。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作由加拿大卫生研究院（487354）和魁北克研究基金会（333845）资助。

<ol><li>Berardi, N., Sale, A., Maffei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+structural+and+functional+development%3A+Genetics+and+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Brain structural and functional development: Genetics and experience.</a> Dev Med Child Neurol. 57 (Suppl 2), 4-9 (2015).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+functional+alteration+and+increased+diversity+in+the+challenged+brain%3A+Insights+into+novel+targets+for+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Immun+Health%22%5BJournal%5D)">Microglial functional alteration and increased diversity in the challenged brain: Insights into novel targets for intervention.</a> Brain Behav Immun Health. 16, 100301(2021).</li>
<li>Salter, M. W., Beggs, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sublime+microglia%3A+Expanding+roles+for+the+guardians+of+the+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sublime microglia: Expanding roles for the guardians of the CNS.</a> Cell. 158 (1), 15-24 (2014).</li>
<li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+microglia+in+brain+development%2C+tissue+maintenance+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (Pt 5), 1138-1159 (2015).</li>
<li>Nayak, D., Roth, T. L., Mcgavern, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li>
<li>Mehl, L. C., Manjally, A. V., Bouadi, O., Gibson, E. M., Tay, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+brain+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microglia in brain development and regeneration.</a> Development. 149 (8), dev200425(2022).</li>
<li>Mastenbroek, L. J. M., Kooistra, S. M., Eggen, B. J. L., Prins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microglia+in+early+neurodevelopment+and+the+effects+of+maternal+immune+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">The role of microglia in early neurodevelopment and the effects of maternal immune activation.</a> Semin Immunopathol. 46 (1-2), 1(2024).</li>
<li>Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+dynamics+during+human+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial dynamics during human brain development.</a> Front Immunol. 9, 1014(2018).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Akhmetzyanova, E. R., Rizvanov, A. A., Mukhamedshina, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+for+the+microglia+isolation%3A+Overview+and+comparative+analysis+of+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Current methods for the microglia isolation: Overview and comparative analysis of approaches.</a> Cell Tissue Res. 395 (2), 147-158 (2024).</li>
<li>Walker, D. G., Lue, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+phenotypes+of+microglia+in+human+neurodegenerative+disease%3A+Challenges+to+detecting+microglial+polarization+in+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimers+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune phenotypes of microglia in human neurodegenerative disease: Challenges to detecting microglial polarization in human brains.</a> Alzheimers Res Ther. 7 (1), 56(2015).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+states+and+nomenclature%3A+A+field+at+its+crossroads%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li>
<li>Hammond, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+of+microglia+throughout+the+mouse+lifespan+and+in+the+injured+brain+reveals+complex+cell-state+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing of microglia throughout the mouse lifespan and in the injured brain reveals complex cell-state changes.</a> Immunity. 50 (1), 253-271.e6 (2019).</li>
<li>Bernier, L. P., York, E. M., Macvicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism+in+the+brain%3A+How+metabolism+shapes+microglial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism in the brain: How metabolism shapes microglial function.</a> Trends Neurosci. 43 (11), 854-869 (2020).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+unique+TGF-%CE%B2-dependent+molecular+and+functional+signature+in+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia.</a> Nat Neurosci. 17 (1), 131-143 (2014).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+drives+selection+and+function+of+enhancers+controlling+tissue-specific+macrophage+identities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Environment drives selection and function of enhancers controlling tissue-specific macrophage identities.</a> Cell. 159 (6), 1327-1340 (2014).</li>
<li>Chometon, T. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+monocyte+isolation+and+generation+of+singular+human+monocyte-derived+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid monocyte isolation and generation of singular human monocyte-derived dendritic cells.</a> PLoS One. 15 (4), e0231132(2020).</li>
<li>Skog, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+enzymatic+digestion+on+cultured+epithelial+autografts%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts.</a> Cell Transplant. 28 (5), 638-644 (2019).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本研究提出了一种详细且经过优化的实验方案，结合流式细胞术与单细胞RNA测序（scRNA-seq），用于在出生后早期脑发育过程中分离和表征小胶质细胞。尽管流式细胞术仍是一种经济高效且易于获取的技术，但其与单细胞转录组学的结合能够通过将蛋白水平的标志物表达与基因水平的转录谱相联系，提供互补性的深入见解。该方案针对未成熟脑组织特有的技术难题进行了优化，包括高效的组织解离、碎片与髓鞘的去除，以及优化的免疫染色策略，以确保在关键发育时间点对小胶质细胞群体的分析具有可重复性和可靠性。
采用流式细胞术根据选定的表面和细胞内标志物的表达来鉴定小胶质细胞亚群。这些亚群并非通过推断功能状态来区分，而是依据其标志物表达谱进行区分，例如 CD80+/CD86+/iNOS+；CD206+/Arg1+；CD86+/CD64+ 或 CD163+/CD206+ 表型。这些由标志物定义的细胞群体反映了小胶质细胞群体内的分子异质性，并为高通量表征提供了实用的方法。尽管基于表面标志物的分类可能无法完全捕捉小胶质细胞多样性的全部复杂性，但在缺乏高维分子分析工具的情况下，此类方法仍具有重要信息价值。为体现小胶质细胞表型具有类似谱系、依赖于微环境的特性，本文有意避免使用诸如 M1/M2 这样的二元分类模式，该观点已在近期文献中有所阐述12。
这些观察结果与先前的研究一致，强调了小胶质细胞在正常大脑成熟以及对环境或病理刺激反应中的作用13,14。能够区分小胶质细胞的异质性，为小胶质细胞极化如何参与神经发育障碍提供了宝贵的见解15,16。
尽管单细胞RNA测序具有更高的分辨率，并能够鉴定出转录上不同的小胶质细胞亚群，但其成本较高且分析过程复杂，限制了该技术的普及应用。在本研究中，数据集采集于围产期损伤后的第15天，此时炎症反应的高峰期已基本消退，导致活化的小胶质细胞数量较少。因此，UMAP等降维技术未能有效分离出界限清晰的小胶质细胞亚簇，故本实验方案论文未包含基于聚类水平的转录组分析。
本方案的一项重要创新在于优化了从小脑早期出生后阶段（P3至P30）分离和表征小胶质细胞的流程。该特定脑区和年龄范围带来了独特挑战，包括细胞得率低、髓鞘含量高以及组织脆性增加。为应对这些限制，本方案整合了改良的组织解离流程、高效的碎片和髓鞘去除步骤，以及针对小体积小脑组织优化的免疫染色条件。尽管目前 increasingly 认识到小脑小胶质细胞在功能和转录水平上与其他脑区的小胶质细胞存在差异，但针对其分离与分析的详细实验方案仍十分有限。本方法提供了一种可靠且易于实施的操作流程，特别适用于小脑小胶质细胞发育过程的研究。
本文的主要目标是提供一个可重复且可灵活调整的方法学框架，而非报告特定的生物学发现。该实验流程适用于其他发育阶段或实验模型的调整，在这些情况下，转录上不同的小胶质细胞状态可能更为显著。在这些背景下，流式细胞术仍是一种有价值的工具，尤其是当其与互补性检测方法相结合时。
本方案的一个关键优势在于其适用于从出生后第3天（P3）到出生后第30天（P30）的多个发育阶段，从而能够在脑组织成熟过程中对小胶质细胞表型进行纵向分析。联合使用流式细胞术和单细胞RNA测序技术，不仅可以研究表面标志物，还能分析小胶质细胞中涉及的细胞内信号通路和转录因子。
然而，酶消化可能会影响某些表面标志物的表达，因此需要针对特定实验目标仔细优化消化条件17,18。此外，流式细胞术和单细胞测序均无法提供群体水平的数据，可能无法充分捕捉小胶质细胞在其原生环境中相互作用的空间和功能细微差异。结合单细胞空间技术有助于通过保留小胶质细胞的空间背景来弥补这一局限性。未来将本方案与免疫组织化学、活体成像、蛋白质印迹或单细胞空间转录组学等成像技术相结合的研究，可为小胶质细胞动态提供互补的见解。
该方法为研究生命早期损伤（如炎症、缺氧或环境应激因素）如何影响小胶质细胞表型并导致长期神经发育结局开辟了新的途径。通过实现对小胶质细胞活化状态的精确且可靠的表征，该方法有助于识别可用于调节生命早期小胶质细胞反应的治疗靶点，旨在预防或减轻神经发育障碍。
综上所述，本方案为研究早期脑发育过程中小胶质细胞的多样性提供了一个稳健且易于实施的框架。流式细胞术与单细胞RNA测序的结合可灵活应用于不同的发育阶段和实验模型，有助于在生理和病理条件下更深入地探索小胶质细胞的生物学特性。

出生后的早期是大脑发育的关键阶段，其特征是复杂的细胞和分子过程，为认知、情感和行为功能奠定基础1。然而，这一时期也具有脆弱性，因为外界干扰可能改变神经发育轨迹，导致长期的神经或精神疾病。小胶质细胞作为大脑的常驻免疫细胞，通过突触修剪、吞噬作用、免疫监视以及对环境损伤的响应，在塑造发育中的大脑方面发挥核心作用2,3。这些细胞表现出显著的可塑性，其转录谱会因脑区、发育阶段和病理环境的不同而发生变化4,5。
在发育中的大脑中，对小胶质细胞活化的准确分析需要具备强大且可重复的方法，以在未成熟脑组织背景下分析其动态表型。流式细胞术提供了一种可靠的解决方案，能够高通量地表征细胞群体及标志物表达6。然而，由于组织较为脆弱，且需要高效的细胞分离与富集方案，将该技术应用于出生后早期大脑的小胶质细胞研究在技术上具有挑战性7,8。
本文所述方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序（scRNA-seq），用于分离和表征出生后早期小鼠脑中的小胶质细胞，特别关注从出生后第3天（P3）到出生后第30天（P30）的小脑区域，该脑区及发育阶段目前仍缺乏详细的实验方法参考文献9。
该实验流程包括酶解离、密度梯度离心以去除碎片并富集细胞，以及使用一组细胞外和细胞内标志物进行免疫染色。为表征小胶质细胞的异质性，本方案采用多种表面及细胞内标志物10,11。该方案不采用固定的分类标签（如促炎性或修复性），而是根据特定标志物的表达谱来定义亚群。例如，表达 CD80、CD86 和 iNOS，或 CD206 和 Arg1，或 CD86 和 CD64，或 CD163 和 CD206 的小胶质细胞被识别并分析为分子特征不同的亚群。这些标志物反映了小胶质细胞的不同活化状态10,11，并以表达谱的形式呈现。
这种多参数门控策略能够基于表面标志物的表达精确识别小胶质细胞亚群，为分析出生后大脑发育过程中免疫异质性提供了一个简化的分析框架。为了扩展表型分析并揭示转录多样性，在细胞分离后进行单细胞RNA测序。本研究建立了一种一致且可扩展的工作流程，以增进对神经发育过程及小胶质细胞活化长期影响的理解。通过在具有发育阶段和区域特异性信息的框架内整合优化的流式细胞术与单细胞RNA测序技术，该方案为研究生命早期小胶质细胞生物学及其与神经发育结局的相关性提供了强有力的工具。

<table><tbody><tr><td>140 &amp;micro;金属网滤器&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3895</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>5 mL 离心管</td><td>Sarstedt</td><td>55.526.006</td><td></td></tr><tr><td>锥底96孔板&amp;nbsp;</td><td>Sarstedt</td><td>82.1583.001</td><td></td></tr><tr><td>精氨酸酶1 - Pecy7偶联物 - 克隆号：A1exF5</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25-3697-82</td><td></td></tr><tr><td>台式稳定型荧光试剂</td><td>Invitrogen</td><td>A49905</td><td></td></tr><tr><td>CD11b - FITC偶联 - 克隆：M1/70</td><td>BD Pharmingen</td><td>553310</td><td></td></tr><tr><td>CD163 - SB600偶联物 - 克隆号：TNKUPJ</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>63-1631-82</td><td></td></tr><tr><td>CD206-APC偶联抗体-克隆：C068C2</td><td>BioLegend</td><td>141708</td><td></td></tr><tr><td>CD45 - 偶联A700 - 克隆：30-F11</td><td>BD Pharmingen</td><td>560510</td><td></td></tr><tr><td>CD64-偶联物&amp;nbsp; PerCP-eF710 - 克隆：X54-5/7.1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>46-0641-82</td><td></td></tr><tr><td>CD80 - SB436偶联物 - 克隆号：16-10A1</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>62-0801-82</td><td></td></tr><tr><td>CD86 - PE偶联抗体 - 克隆号：GL-1</td><td>BioLegend</td><td>105008</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶D</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich&amp;nbsp;</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Hank's 平衡盐溶液）10x</td><td>Wisent Bioproducts&amp;nbsp;</td><td>311506CL</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>vwr international</td><td>82030-470</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wisent Bioproducts&amp;nbsp;</td><td>330.050.EL</td><td></td></tr><tr><td>iNOS - PE-eF610 偶联物 - 克隆：CXNFT</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>61-5920-82</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>活/死 Amcyan</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>小胶质细胞培养基</td><td>Life Technologies</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich&amp;nbsp;</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>大鼠抗小鼠 CD16/CD32</td><td>BD 生物科学&amp;nbsp;</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>皂苷</td><td>Sigma&amp;ndash;Aldrich&amp;nbsp;</td><td>S7900</td><td></td></tr><tr><td>单细胞RNA测序文库</td><td>10X Genomics</td><td>1000121</td><td></td></tr><tr><td>基于二氧化硅的胶体介质</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>45001747</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP922I-500</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>Gibco</td><td>1525006</td><td></td></tr></tbody></table>

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

Flow Cytometry and Single-Cell Analysis for Characterizing Microglia Activation in Early Postnatal Mouse Brain Development

小胶质细胞是大脑的常驻免疫细胞，在发育和疾病过程中表现出区域和环境特异性的转录谱。本方案介绍了两种互补的方法，用于研究小鼠小脑组织中的小胶质细胞群体：流式细胞术和单细胞RNA测序。
作为首先使用的方法，基于流式细胞术的实验方案针对出生后早期脑组织进行了优化，确保细胞分离的高效性以及不同实验条件间结果的一致性。该方法首先通过酶消化法进行组织解离，随后利用Percoll密度梯度离心去除髓鞘，从而获得高质量的神经细胞悬液，并基于CD45和CD11b的表达设计门控策略。通过活/死细胞染色评估细胞活力，使用荧光标记抗体对小胶质细胞表面特定标志物的表达进行分析。采用包被荧光素的乳胶微球进行补偿对照，并结合荧光减一（FMO）对照验证门控策略的准确性。
第二种方法采用10X Genomics的单细胞RNA测序技术，其上游分离步骤与前述方法相同，可实现不同条件下小胶质细胞的转录组学分析。通过基因表达分析鉴定小胶质细胞簇，并在实验组之间进行差异表达分析。当样本为多重混合时，仅使用随机森林分类器来区分雄性和雌性样本。
这些可重复且可调整的实验方案共同为研究小脑在早期脑发育过程中小胶质细胞的多样性及其在实验性干扰后的潜在改变提供了坚实的框架。

本方案通过流式细胞术有效分析小鼠脑组织样本中基于特定表面标志物和细胞内标志物表达特征的小胶质细胞群体。以下部分详细描述了实验流程关键步骤所获得的结果，重点展示在不同实验条件下小胶质细胞亚群的分布及其异质性。
补偿与设门策略验证 
使用补偿微珠校准荧光信号，并校正不同荧光染料之间的光谱重叠。每种荧光染料的阳性和阴性群体均清晰分离，从而能够准确生成补偿矩阵。在抗体组合优化过程中，首先通过荧光减一对照（FMO）验证设门阈值，以区分真实信号与背景信号，尤其适用于表达较弱或存在重叠的标志物。在后续使用相同染色组合和流式细胞仪设置的实验中，重复使用这些阈值，以确保结果的一致性。同时设置同型对照，用于监测潜在的非特异性结合，特别是针对细胞内标志物，但同型对照不用于设门判断。
小胶质细胞鉴定 
活/死细胞（Amcyan）设门策略成功排除了死细胞。该设门策略根据CD45（AF700）和CD11b（FITC）的表达情况，有效分离出小胶质细胞群体。前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）参数经过优化（FSC = 300，SSC = 200），使小胶质细胞群落在散点图中居中（图5）。
小胶质细胞表型分析 
通过点图分析，可根据表面标志物和细胞内标志物的差异表达来鉴定小胶质细胞亚群。在FlowJo软件中采用特定的设门策略，鉴定出表达CD80（Super Bright 436）、CD86（PE）和iNOS（PE-eFluor 610）的一群小胶质细胞亚群（图6A）。同时采用双重设门方法，定义表达CD206（APC）和Arg1（PE-Cy7）的细胞亚群（见图6B）。其他细胞群体则通过共表达CD86（PE）和CD64（PerCP-eFluor 710），以及CD163（Super Bright 600）和CD206（APC）进行表征（图6C、D）。这些表型特征反映了小胶质细胞群体中由标志物定义的异质性，并表明本方案能够在不预设固定功能状态的前提下，区分出多个在转录和免疫特征上各不相同的亚群。
小胶质细胞单细胞分析 
采用均匀流形近似与投影（UMAP）方法可视化细胞异质性，并在其他脑细胞类型中识别小胶质细胞簇。每个点代表一个单细胞，聚类根据转录相似性进行颜色编码（图2）。
在小胶质细胞簇内进行差异表达分析，以鉴定在实验条件下受调控的基因。调整后P值≤ 0.05的基因被视为差异表达基因。
绘制火山图以可视化小胶质细胞中差异表达的基因，突出显示具有高倍数变化和统计学显著性的基因（图4）。
为了将这些单细胞结果与流式细胞术数据进行比较，检测了小胶质细胞标志物 CD45 和 CD11b（Ptprc 和 Itgam）的表达。UMAP 图显示了它们在不同细胞群体中的表达情况（图 7）。
最后，通过检测选定的免疫相关标志物的表达，以表征小胶质细胞间的转录异质性。小提琴图展示了单细胞水平下 CD80 和 NOS2，以及 Mrc1、Arg1、Fcgr1 和 CD163 等基因的表达情况（图8）。这些标志物的表达模式可与基于流式细胞术的分析结果进行比较，并揭示在不同实验条件下小胶质细胞亚群的分子多样性。
<img alt="展示细胞质量指标的密度图和散点图：percent.mt、log10GenesPerUMI、nGene、nUMI。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图1"> 
图1：单细胞转录组数据的质量控制。（A）细胞中线粒体RNA含量的分布。排除线粒体RNA含量&gt;30%的细胞，以去除可能处于应激状态或正在死亡的细胞。（B）过滤掉log10GenesPerUMI &gt; 0.75的细胞，以确保基因与UMI的比例一致，并减少低复杂度文库带来的噪声。（C）同时排除检测到的转录本数（nUMI）少于500或检测到的基因数（nGENE）超过300的细胞，以消除低质量细胞或多重细胞。（D）nUMI与nGene的相关性图，展示过滤阈值的影响。检测到的双细胞（doublets）已被去除。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="细胞簇的UMAP图；包含神经元、内皮和免疫细胞；数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="Figure 2"> 
图2：单细胞转录组的UMAP可视化。 UMAP图展示了来自两个独立动物的单细胞基于转录组特征的分布情况。每个点代表一个细胞，按簇的身份进行颜色编码。小胶质细胞簇在其他细胞群体中被识别出来。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="随机森林ROC曲线，AUC=99.7%，示意图，模型敏感性和特异性分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig3.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图3"> 
图3：通过交叉验证评估的随机森林分类器的ROC曲线。受试者工作特征（ROC）曲线展示了基于基因表达谱区分小胶质细胞与其他脑细胞类型的随机森林模型的性能。该模型在约1000个已知标签的细胞数据集上进行训练，并采用10折交叉验证进行评估。在测试的五种统计模型（随机森林、逻辑回归、朴素贝叶斯、支持向量机和决策树）中，随机森林模型取得了最高的分类性能。曲线下面积（AUC）反映了模型的准确性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="小胶质细胞差异表达基因的火山图；Log2 倍数变化 vs. -log10 P值；基因表达的数据可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig4.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 4"> 
图 4：小胶质细胞中差异基因表达分析。 火山图展示了两组实验组（对照组 vs. 小脑脑损伤组）之间小胶质细胞差异表达基因的 log2 倍数变化与校正后 P 值的关系。上调基因在目标组（ident.1）中表达水平更高，而下调基因相较于对照组（ident.2）表达水平降低。图中已标注关键的显著差异表达基因。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="流式细胞术示意图，显示在CD11b、CD45分析中选择小胶质细胞的设门过程。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig5.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图5"> 
图5：通过流式细胞术鉴定小胶质细胞的设门策略。（A）应用于对照组出生后第3天（P3）小鼠小脑细胞的设门策略。（B）选择单细胞以排除双联体。（C）使用活细胞染料鉴定活细胞；排除前向散射光面积（FSC-A）较低的事件，以去除碎片并确保对完整细胞进行分析。（D）小胶质细胞被鉴定为CD45+和CD11b+，并分为两个不同群体：CD45low-CD11bint代表静息状态的小胶质细胞，CD45int-CD11bhigh代表活化状态的小胶质细胞。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="免疫细胞分析中CD80、CD86和iNOS的流式细胞术示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig6.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图6"> 
图6．通过流式细胞术分析小胶质细胞标志物表达谱。 （A）基于CD80、CD86和iNOS表达对CD45+ CD11b+细胞进行逐级设门分析。（B）鉴定表达CD206的细胞亚群，随后根据Arg1表达进行设门。（C）鉴定表达CD86的细胞亚群，随后根据CD64表达进行设门。（D）鉴定表达CD163的细胞亚群，随后根据CD206表达进行设门。这些设门策略展示了基于表面标志物和细胞内标志物表达的小胶质细胞群体的表型异质性。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="UMAP 图、单细胞 RNA 测序数据、Ptprc 与 Itgam 表达、细胞类型分布、生物信息学分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig7.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 7"> 
图 7：利用单细胞 RNA 测序数据中 Itgam 和 Ptprc 的表达验证小胶质细胞身份。 UMAP 图展示了 P15 小脑细胞的转录组景观，基因 Itgam 和 Ptprc 的表达情况叠加显示于各个聚类中。这两种经典髓系标志物的共表达支持小胶质细胞群体的鉴定，并与流式细胞术中使用的标志物一致，从而在转录组和蛋白水平分析之间提供了交叉验证。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="小胶质细胞基因表达小提琴图，比较 Cd80、Nos2 和 Fcgr1 的 Veh 与 CBI 处理。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68427/68427fig8.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 8"> 
图 8：通过单细胞 RNA 测序鉴定的小胶质细胞中选定免疫相关基因的表达谱。 小提琴图展示了单个小胶质细胞中 CD80、NOS2、Mrc1、Arg1、Fcgr1 和 CD163 基因表达的分布情况。这些标志物通常与免疫相关过程相关，反映了小胶质细胞群体中存在的转录异质性。数据展示了对照组和小脑脑损伤（CBI）条件下的结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/68427fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
表1：用于神经细胞分离和染色的溶液组成。 本表详细列出了细胞分离和染色所需溶液的成分及其各自浓度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%201.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表2：细胞外染色用抗体混合物浓度。 本表详细列出了用于细胞外染色的抗体及活/死细胞染料溶液的浓度，具体说明了每种抗体在单个样本染色混合物中所需的体积和稀释比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%202.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>
表3：细胞内染色用抗体混合物浓度。本表详细列出了用于细胞内染色的抗体浓度，针对一个样本的染色混合物，具体说明了每种抗体所需的体积和稀释比例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68427/Table%203.xlsx" target="_blank">请点击此处下载该表格。</a>

本方案结合流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征出生后早期小鼠脑小脑中的小胶质细胞状态。该方法通过酶解消化、Percoll离心及免疫染色，揭示小胶质细胞的异质性，从而加深对其在小脑发育与疾病中作用的理解。

小胶质细胞作为大脑的常驻免疫细胞，在发育和疾病过程中表现出区域和环境特异性的转录谱。本方案……

我们的研究探讨了小胶质细胞如何影响产前脑损伤后的大脑修复。我们的目标是确定调节小胶质细胞活性是否可以改善长期神经系统结果。我相信这是小胶质细胞反应的复杂性，以及以最准确的方式描述这些反应以代表生理反应以及病理反应和疾病的挑战。我们正在使用不同的模式，例如单细胞 RNA 测序和流式细胞术实验，来表征产前损伤后发育中大脑中的小胶质细胞状态和功能。一个主要挑战是在分离过程中保持细胞活力和小胶质细胞身份，特别是在小脑细胞数量有限的新生儿时间点。它提出了关于生命早期小脑损伤如何导致小胶质细胞亚群的转录改变以及靶向治疗如何调节这些变化的问题。首先，根据需要解剖小鼠的特定大脑区域。使用镊子，将组织转移到装有小胶质细胞培养基的小培养皿中，置于冰上以维持细胞活力。使用移液器，从培养皿中取出小胶质细胞培养基。然后，用手术刀在同一个培养皿中将脑组织切细。将均质的脑组织转移到五毫升管中进行酶消化。向每个试管中加入两毫升补充有胶原酶D和DNase 1的汉克斯平衡盐溶液，并用封口膜紧紧密封盖子。然后，将试管在 37 摄氏度的水浴中孵育 15 分钟，每五分钟摇晃一次。要停止消化，请将试管放在冰上。然后，将匀浆通过 140 微米金属网过滤器以去除大碎屑。使用玻璃杵轻轻解离过滤器上剩余的细胞。每次洗涤用三毫升小胶质细胞培养基多次清洗金属网过滤器。现在，使用 10 毫升移液器收集滤液并将其转移到 15 毫升管中。然后，将试管以 500g 在 4 摄氏度下离心 7 分钟。然后，小心地倒置管以丢弃上清液。使用架子，轻轻刮擦管以重悬沉淀。然后，向重悬的细胞中加入 10 毫升 37% 二氧化硅基胶体培养基溶液。以最小的断裂力将溶液以 500g 离心 10 分钟，在 4 摄氏度下。使用 10 毫升移液器，从溶液顶部吸出髓鞘层。要洗涤细胞，请加入 10 毫升 Hanks 平衡盐溶液，并在 4 摄氏度下以 500g 离心管 7 分钟。弃去上清液并重悬沉淀后，向管中加入10毫升荧光激活细胞分选缓冲液。离心后，将最终沉淀重悬于剩余的缓冲液中，用于下游应用。将所有分离的细胞转移到具有锥形底部的 96 孔板中。将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。快速倒置板以丢弃上清液。然后，将细胞沉淀重悬于 25 微升封闭溶液中，并将板在室温下孵育 15 分钟。要制备细胞外抗体染色混合物，请将抗体储备管以 10， 000g 离心以去除聚集体。在不干扰沉淀的情况下，从上清液中吸出所需体积。使用荧光激活的细胞分选缓冲液，将总体积调整为 25 微升。现在，向每个孔中加入 25 微升细胞外抗体染色混合物，并在室温下孵育板 20 分钟。在不混合的情况下，向每个孔中加入 150 微升荧光激活细胞分选缓冲液。将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 5 分钟。然后，快速倒置板以一次动作去除上清液。将细胞沉淀重悬于 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液中，并如前所述离心。将细胞重悬于100微升皂苷-多聚甲醛缓冲液中，以固定和透化细胞。然后，将板在室温下孵育 10 分钟，避光。在不混合的情况下，向每个孔中加入 100 微升皂苷缓冲液。将板以 500g 在 4 摄氏度下离心 6 分钟。然后，倒置板以单次运动除去上清液，并将细胞沉淀重悬于 200 微升皂苷缓冲液中。接下来，通过向 11 个空孔中添加 20 微升珠子来制备补偿对照。为了制备细胞内抗体染色混合物，将抗体储备管以10， 000g离心以去除潜在的聚集体。在不干扰沉淀的情况下，从上清液中吸出所需体积。使用皂苷缓冲液将体积调节至 50 微升。然后，将细胞沉淀重悬于 50 微升细胞内抗体混合物中。将每种抗体一微升加入相应的珠孔中，并在室温下孵育板 30 分钟。在不混合的情况下，向每个含有细胞样品的孔中加入 150 微升皂苷缓冲液。向每个补偿对照孔中加入 100 微升荧光激活细胞分选缓冲液以洗涤磁珠。板离心后，将细胞沉淀和对照分别重悬于 200 微升皂苷缓冲液和荧光激活细胞分选缓冲液中。将板以500g在4摄氏度下离心6分钟，除去上清液。将细胞样品和补偿对照重悬于 200 微升荧光激活细胞分选缓冲液中。将悬浮液转移到标记的荧光激活细胞分选管中。单细胞 RNA 测序根据转录谱鉴定出与其他脑细胞类型分开的不同小胶质细胞簇。差异表达分析显示，小胶质细胞中基因显著上调，包括Csf1r、Fcrls、Fyb、Adap2和P2ry12。小胶质细胞根据其对CD45和CD11b标记物的不同表达，成功地从活脑样本中分离出来。根据激活标志物的组合鉴定出不同的小胶质细胞亚群，包括 CD80、CD86、iNOS、CD206 和 Arg1、CD86 和 CD64，以及 CD163 和 CD206。Ptprc 和 Itgam 的标记基因表达在 umap 投影中特异性定位于小胶质细胞簇，证实了这些细胞的身份。小提琴图分析显示，与载体对照相比，处理过的小胶质细胞中抗炎标志物（如 Fcgr1 和 Cd86）的表达较低。

flow-cytometry-single-cell-analysis-for-characterizing-microglia

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

流式细胞术和单细胞分析表征小鼠出生后早期大脑发育中的小胶质细胞激活

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。...

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

小胶质细胞活化和小胶质细胞增生是慢性神经退行性变的关键反应。本文介绍了相关方法...

体内 神经退行过程中视网膜小胶质细胞活化的动态变化：小鼠青光眼模型中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。...

通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

原代小胶质细胞培养常用于评估新的抗炎分子。本方案描述了一种可重复且相关的方法，用于从新生幼鼠中通过磁珠分离小胶质细胞。...

从新生小鼠中磁分离小胶质细胞用于原代细胞培养

本文介绍了一种利用柱状磁性激活细胞分选技术，在脱髓鞘疾病动物模型中分离和纯化原代小胶质细胞的实验方案。...

脱髓鞘动物模型中通过磁激活细胞分选法分离小鼠原代小胶质细胞

本研究描述了一种利用细胞核内流式细胞术对分离自脑组织的小胶质细胞进行全基因组组蛋白修饰定量的实验方案。本研究还包含了用于数据采集的小胶质细胞分离方案。...

利用核内流式细胞术定量分析分离的小鼠脑小胶质细胞中组蛋白全局翻译后修饰

本文介绍了两种利用流式细胞术定量分析小胶质细胞吞噬vGLUT1阳性突触以及pHRodo Red标记的粗制突触体的实验方案。...

利用流式细胞术定量小胶质细胞对突触物质的吞噬作用

本方案描述了如何从成年小鼠中分离和纯化原代海马区小胶质细胞，并进一步介绍了对这些急性分离的细胞进行全细胞膜片钳记录的操作步骤。...

从成年小鼠海马体中分离小胶质细胞并进行全细胞膜片钳记录

学习流式细胞术和单细胞RNA测序技术，用于分离和表征小鼠出生后早期小脑中的小胶质细胞状态。该方法结合酶解消化和Percoll离心，揭示细胞异质性，助力神经发育与疾病机制研究。

流式细胞术与单细胞分析用于表征小鼠出生后早期脑发育过程中小胶质细胞的活化

探索更多视频