Name: 电击诱导 果蝇 幼虫癫痫发作的活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 了解利用果蝇幼虫模型筛选抗癫痫化合物的实验方法。该方案通过电击诱导癫痫发作，评估候选药物对神经兴奋性的影响，为开发新型癫痫治疗策略提供高通量筛选平台。

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我们感谢Baines实验室的众多成员多年来共同开发和完善了这一技术，特别感谢Richard Marley为使该技术具备稳健性和可靠性所付出的大量努力。我们感谢Anna Munro绘制了文中所示的幼虫图 图2Baines 实验室在开发本技术过程中得到了英国生物技术和生物科学研究生理事会（BBSRC）、医学研究理事会（MRC）以及惠康信托基金（Wellcome Trust）的慷慨支持。本研究目前由惠康信托基金授予 R.A.B. 的研究员奖项资助（项目编号 217099/Z/19/Z）。本技术的开发还受益于曼彻斯特果蝇设施（Manchester Fly Facility），该设施由曼彻斯特大学和惠康信托基金共同资助建立（项目编号 087742/Z/08/Z）。

本研究中使用了果蝇Drosophila melanogaster（详见结果部分）。该技术最适合用于游走期三龄幼虫（L3）。实验方案相对简单，但需要练习才能掌握。根据我们的经验，新学生大约需要两周时间才能熟练掌握该检测方法，并且通过实时观察其他经验更丰富的研究人员使用带摄像头的解剖显微镜或类似设备进行实验，将获益显著。本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 幼虫筛选
<ol>
	<li>从含有标准培养基（5 L 水，390 g 葡萄糖，360 g 玉米粉，250 g 酵母粉，40 g 琼脂，135 mL 尼泊金，15 mL 丙酸）的果蝇培养瓶/管壁上收集幼虫。</li>
	<li>仅选用正在活跃移动并已离开食物爬至容器壁上的幼虫（游走三期幼虫，L3）。避免选择运动能力显著下降的前蛹。</li>
</ol>
2. 电休克操作
<ol>
	<li>移除一条单独的游走期L3幼虫，转移至一个小型塑料培养皿（大小不限），并用ddH₂O轻轻冲洗2用小号（000）画笔清除食物残渣。</li>
	<li>使用毛笔将经过一次洗涤的幼虫转移至一个空的塑料培养皿中（培养皿尺寸无特殊要求）。用镊子夹取一小片纸巾将幼虫表面水分吸干。去除多余的ddH₂O。2注意：不要将幼虫完全晾干，以免其粘附在塑料培养皿上。</li>
	<li>让幼虫恢复30秒，以方便放置电击探针（见下文）。</li>
	<li>在低倍解剖显微镜（15–20×）下观察幼虫，待其正常爬行行为恢复后，轻柔地将电击探针放置到位（详见步骤3） 图2A) 位于幼虫背侧前部、大致相当于中枢神经系统位置的上方（参见 图2C). 
	注意：此步骤至关重要，需施加足够的压力以确保探针与幼虫表皮之间具有良好的导电性，但须小心避免损伤幼虫。因此，将幼虫压扁至其原厚度的三分之一至二分之一即可。</li>
	<li>施加一个持续时间为2秒的恒定电压脉冲，电压强度需预先确定 通过 滴定曲线（图3）。任何独立的电压刺激器在此均可使用。此处所用的刺激器如图所示 图2B.</li>
	<li>电击后启动计时器。幼虫在受到电击后会出现短暂性麻痹，随后伴随体壁肌肉的偶发性痉挛和翻滚行为，正常爬行行为因此停止。</li>
	<li>当幼虫明显离开其在培养皿上的初始位置时，停止计时。惊厥持续时间，即恢复时间（RT），定义为从刺激开始至恢复正常爬行行为之间的时间段（例如，产生向前运动的完整前向蠕动波）。</li>
	<li>每天实验结束后，应仔细清洁探针导线，先用100%乙醇冲洗，再用ddH₂O冲洗。2O. 在放大镜下仔细检查导线，如有必要，可用镊子轻轻刮去导线上的残留物。操作时需格外小心，避免改变两根导线之间的距离。</li>
</ol>
3. 电击探针的构建
<ol>
	<li>需要准备 2&#160;段长度为 1 m 的电线（应选择细而柔韧的电线，例如额定电流约为 3 A 的电线）。在每根电线的一端焊接一段 5 cm 长的钨丝（为增大接触面积，焊接前可先将钨丝缠绕在电线的裸露端）。在电线的另一端焊接可插式连接器（例如香蕉插头），以便于与电压刺激器轻松连接。</li>
	<li>将两根钨丝固定在电极夹持器上，使它们彼此平行（图 2）。使用小段玻璃毛细管（长度约 2 cm）在探针锁紧螺丝下固定钨丝的位置。</li>
	<li>使用镊子将钨丝弯曲，使其在从夹持器伸出的位置附近相距 1–2 mm。由于钨丝具有“记忆性”，弯曲操作较为困难，因此需要耐心。有助于完成此操作的技巧包括使用电气绝缘胶带和/或蓝丁胶（或类似的塑形腻子）来帮助保持钨丝的正确方向和间距。</li>
</ol>
4. 探针校准
<ol>
	<li>确保备有合适的野生型（阴性对照）和惊厥突变型（阳性对照）的三龄游走幼虫品系，每种约需 100 只。</li>
	<li>按照上述方法，逐一准备幼虫。</li>
	<li>使用电极探针对每种基因型的幼虫在每个测试电压下施加一系列电压刺激。建议在每种电压下测试 10–15 只幼虫，施加的电压分别为 0 V、2 V、4 V、6 V、8 V、10 V 和 12 V，持续时间为 2 秒。每只幼虫仅给予一次电击。</li>
	<li>测量每只幼虫的恢复时间，并分别计算每种基因型在各电压下的平均恢复时间。</li>
	<li>将各电压下的平均恢复时间绘制成图，并用直线拟合数据。</li>
	<li>选择一个对照组与惊厥突变型之间差异显著且清晰的电压值。注意避免选择导致恢复时间过长的电压，否则会因等待恢复时间过久而影响实验效率。 
	注意：本研究通常选用使野生型恢复时间为 50–100 秒、parabss 突变体为 200–300 秒的刺激电压。示例性校准曲线见 图 3。必须使用 0 V 条件以排除探针按压幼虫背侧表面所引起的效应，该操作本身可能导致一定程度的麻痹，这可能是幼虫的一种防御机制。</li>
</ol>
5. 实验的执行
<ol>
	<li>对所需基因型或药物处理的幼虫进行电击，并测量其惊厥恢复时间。 
	注意：对于待测幼虫，通常 n = 20 已足够，但基于预实验分析的统计功效计算可提供更确切的样本量。</li>
	<li>每次实验均应同时设置阴性对照（例如野生型）和阳性对照（例如 parabss）。对照组的样本量无需过大，n = 5 即可。这有助于确认实验体系按预期工作（例如，电极或刺激器无故障）。</li>
	<li>设定截止时间（例如 300 秒），以避免过长的恢复时间，并仅将恢复时间超过 30 秒的惊厥视为可量化的惊厥事件。</li>
</ol>
6. 药物筛选
<ol>
	<li>将药物溶于适当的溶剂后，直接加入食物表面，使其充分渗透（若使用乙醇，需预留溶剂挥发时间）。或者，也可将药物（溶于适当溶剂）加入熔化的果蝇食物中。详见结果部分。</li>
	<li>将药物加入融化的食物中时，从西林瓶中取出食物，重新加热融化，待食物冷却至40 °C时加入药物，使用涡旋振荡器混匀，然后将5 mL融化的食物重新倒入西林瓶中，冷却后备用。</li>
	<li>运行浓度梯度以确定最佳药物浓度。 
	注意：一个良好的起点是加入3 mM药物溶液&#160;直接施加到食品表面（每个标准 200 µL） 黑腹果蝇 小瓶）或将食物熔化后配制成3 mM浓度。可让成年雌蝇直接在此食物中产卵，或根据需要在特定发育阶段将幼虫转移至其中。所用溶剂须单独加入部分小瓶中作为溶剂对照。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

通过电击法诱导Drosophila幼虫发生癫痫发作，提供了一种简单而高效的筛选手段，可用于鉴定新的抗癫痫化合物或基因操作。然而，由于该方法属于定性检测，其主要局限性在于难以检测到较小的效应量。尽管如此，该方法具备中等通量的潜力，每位研究人员每周可筛选约5种化合物，因而是一种非常强大的整体动物实验模型。该技术的简便性也使其适用于本科生水平的实验课程项目。因此，3至4名研究人员可在相对较短的时间内完成大量化合物的筛选，且成本远低于使用相应的小鼠癫痫模型。该检测方法的自动化将进一步提高通量。然而，本研究未能成功实现自动化。曾尝试使用含锂琼脂并在其中嵌入两个电极，以同时对多个幼虫施加电刺激，但未获成功。其他方法，可能基于光遗传学技术，或许更适合实现自动化28。
尽管该检测方法操作简单，但这容易使人忽视熟练掌握的必要性。探针的定位以及电击过程中施加的压力是两个关键步骤。保持这两方面的操作一致性，可减少电击后幼虫恢复时间的差异。另一个主要问题是癫痫发作终点的判断，这使得该检测具有定性性质，因为它取决于实验者个人决定何时停止计时。...

癫痫仍然是一个重大的健康负担，全球约有1%的人口受其影响。尽管目前已有30多种抗癫痫发作药物（ASMs）用于临床治疗，但约三分之一的癫痫患者仍为药物难治性，即对药物治疗反应不佳1,2。现有药物也仅具有缓解症状的作用，因此既不能阻止癫痫的发生发展，也无法实现治愈3。因此，迫切需要发现更有效的癫痫治疗方法。然而，开发更有效疗法的一个主要障碍在于难以确定新的药物靶点。事实上，几乎所有现有的抗癫痫药物都作用于相似的靶点：包括电压门控钠通道（Nav）以及由γ-氨基丁酸（GABA）介导的抑制性神经传递4,5。普遍认为，继续采用传统的药物研发方法不太可能从根本上改变这一现状。
实验室模式动物，包括但不限于果蝇 黑腹果蝇，以及斑马鱼 Danio rerio，可用于鉴定新型抗癫痫药物6,7,8。事实上，通过在PubMed中搜索“果蝇 + 癫痫发作’返回 342 个结果，而对斑马鱼进行相同搜索返回 578 个结果（两次搜索均于 29 日进行）th 2025年1月）。尽管与小鼠相关研究的数量（约15,000项）相比仍显不足，但利用模式系统开展的研究数量仍在持续增长。这些研究得以开展，得益于不同门类间中枢神经系统（CNS）功能机制的高度保守性。此外，在果蝇和鱼类中诱导产生的癫痫发作可被临床使用的抗癫痫药物（ASMs）有效治疗，表明尽管癫痫行为的表型表现可能外观不同，其潜在机制却具有高度共性。7,9,10.
果蝇 Drosophila 在理解人类生物学方面做出了许多开创性的贡献。在癫痫研究领域，该模型系统提供了无与伦比的遗传工具箱，并具有可识别且实验上易于操作的神经元7。此外，幼虫和成虫中枢神经系统（CNS）的连接组现已发表，同时已鉴定出大量细胞特异性的遗传驱动品系11,12。值得注意的是，研究人员偶然发现了一类突变，携带此类突变的成年果蝇在受到强烈机械刺激时会出现姿势丧失及类似癫痫的活动（例如翅膀震颤、腿部抽搐等）。这类突变被称为“震击敏感性”突变（bang-sensitive）13,14,15,16。随后又发现第二类癫痫突变，其表型由升高的温度诱发，类似于人类的热性惊厥17,18。然而，与同种昆虫模型的幼虫阶段相比，成年果蝇的实验可操作性有所降低。例如，对成年果蝇进行药物喂养较为困难，而电生理学和光遗传学等更具侵入性的技术也更具挑战性。相比之下，Drosophila 幼虫持续进食，可在短短5天内将自身体积扩大约100倍，以支持化蛹过程。因此，我们能够确保在幼虫阶段实现充分的药物喂养。胚胎发育过程已被充分记录，并可精确分期，进而揭示了中枢神经系统发育的关键里程碑事件，包括神经元电学特性的首次获得以及神经回路的形成19。孵化后，幼虫经历3次蜕皮（即3个龄期），至第5天进入“游走期”（wandering stage），离开食物以寻找安全场所进行化蛹。经过约100小时的蛹期发育后，成虫羽化，形成全新的身体结构和中枢神经系统（图1）。
在成虫中诱导癫痫发作的技术并不适用于幼虫阶段。幼虫缺乏感觉刚毛，而机械刺激过程中这些刚毛的同步激活可能引发癫痫发作。因此，为克服这些困难，已开发出一种电击技术，用于在游走期幼虫阶段诱导癫痫发作。随后对幼虫和成虫中不同癫痫诱导技术的比较分析表明，幼虫电击法对突变类型（例如，对震荡敏感型 vs. 温度敏感型）的依赖性显著更低。因此，我们建议，当未知最佳癫痫诱导方法时，该技术应作为检测新突变的首选方法20。幼虫电击技术操作简便、快速，且所需设备极少。该技术为筛选新型化合物或基因疗法在模拟人类癫痫遗传多样性的多种突变背景下的抗癫痫效果，提供了一种高效的手段。

<table><tbody><tr><td>电极夹持器</td><td>World Precision Instruments&amp;nbsp;</td><td>M3301</td><td></td></tr><tr><td>玻璃毛细管</td><td>Harvard Instruments</td><td>GC100F-10</td><td></td></tr><tr><td>钨丝（99.95%）</td><td>Goodfellow Cambridge, UK</td><td></td><td>直径0.1 mm</td></tr><tr><td>电压刺激器</td><td>Digitimer Ltd, UK</td><td>DS2A mkII&amp;nbsp;</td><td>恒压隔离刺激器&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

电休克诱发的癫痫发作活动 果蝇 幼虫

Seizure Activity Induced by Electroshock in Drosophila Larvae

癫痫是一种重大的健康负担，且由于大量患者对药物治疗无效而进一步加剧。尽管部分药物难治性患者对非药物治疗（如迷走神经刺激、生酮饮食等）有反应，但对许多患者而言，最终选择仍是具有挑战性且昂贵的手术治疗，以缓解癫痫发作。虽然人们普遍认为需要开发作用靶点更广泛的抗癫痫药物，但实现这一目标的主要障碍在于新药物靶点的识别。可进行遗传操作的模式动物为此提供了希望。果蝇Drosophila melanogaster已成为研究癫痫发作机制以及探索更佳治疗方法的有力模型。许多已鉴定的果蝇突变会导致幼虫和成虫在强烈刺激（电、机械和/或热刺激）下出现类似癫痫的活动。这些突变中有许多位于与人类遗传性癫痫相关基因同源的基因中（例如电压门控Na+通道基因）。如今，还可以用携带疾病相关突变的人源等位基因替换果蝇中的相应基因。因此，这种简单的果蝇已转变为模拟人类疾病的“替身”模型。本研究描述了一种适用于利用Drosophila幼虫进行低至中等通量药物筛选的方法，以鉴定具有抗癫痫潜力的独特化合物及其作用靶点。

许多 Drosophila 突变表现出增强的类惊厥行为7,20。这些突变的遗传基础各不相同，较好地模拟了人类癫痫同样多样的遗传病因。其中研究最为深入的三种 Drosophila 突变是 parabangsenseless（parabss）、julius seizure（jus）和 easily-shocked（eas）。parabss 突变导致 paralytic 电压门控 Na+ 通道功能获得性改变，eas 编码乙醇胺激酶，而 jus 是一种迄今尚未明确的膜蛋白（需注意，jus 直到最近被称为 slamdance）16,</su...

本方案详细介绍了利用黑腹果蝇（Drosophila）幼虫筛选独特抗惊厥化合物以治疗癫痫的方法。

癫痫是一种重大的公共卫生负担，其严重性因大量患者对药物治疗无效而加剧。尽管部分药物难治性……

我们使用果蝇果蝇的幼虫来确定癫痫的新治疗方法。就像人类一样，苍蝇可以携带基因突变，使它们容易癫痫发作，我们可以通过临床使用的抗癫痫药物来减轻苍蝇癫痫发作的严重程度。主要挑战是充分了解苍蝇神经系统的工作原理，以便我们可以将区域映射到人脑中的等效区域。大约 1% 的人口患有癫痫症，其中约 1/3 的人对目前使用的抗癫痫药物反应不佳。我们正在探索治疗癫痫的新方法。使用苍蝇幼虫而不是成年苍蝇是有利的，因为幼虫生活在它们吃的食物中。这使得添加实验药物变得非常简单。我们用来诱发癫痫发作的技术也很简单但有效。我们已经确定了一些具有强效抗癫痫活性的候选药物。我们现在将重点了解这些药物的作用原理，并测试它们在哺乳动物中的使用是否安全。[导师]首先，为该程序构建电击探头。确保有来自野生型对照品系和癫痫发作突变株的大约 100 只游荡三龄幼虫的茎可用。从小瓶壁上取出一只游荡的三龄幼虫，并将其放入一个小塑料培养皿中。使用小画笔，用双蒸馏水轻轻清洗幼虫，去除任何食物残渣。现在，将洗净的幼虫转移到一个空的塑料盘中。用镊子拿着一小块纸巾，轻轻擦干幼虫。在幼虫未完全干燥的情况下去除多余的水，以防止其粘在盘子上。让幼虫恢复 30 秒，以确保在探头放置过程中易于处理。接下来，在解剖显微镜下以 15 至 20 倍的放大倍率观察幼虫。一旦幼虫恢复正常爬行，轻轻地将电击探头放在中枢神经系统上方的前背表面。施加足够的压力，将幼虫压缩至其深度的三分之一到二分之一左右，以确保适当的导电性而不造成损坏。使用隔离电压刺激器施加两秒恒压脉冲，其强度事先通过滴定曲线校准。电击发出后立即启动计时器。观察幼虫是否有短暂性麻痹、痉挛或滚动行为的迹象。一旦幼虫明显远离其原始位置，就停止计时器，表明通过向前蠕动运动恢复。然后，先用 100% 乙醇冲洗探针线，然后用双蒸馏水冲洗。在放大镜下检查电线后，用镊子轻轻刮掉任何残留物，不要改变电线间距。使用探针向每种基因型的每种电压向大约 15 只幼虫提供两秒不同电压的脉冲。每个幼虫只电击一次。测量每个幼虫的恢复时间，并计算每个基因型中每个电压的平均恢复时间。在图形上绘制平均恢复时间，并将一条直线拟合到数据上。选择一个电压，该电压显示野生型和癫痫发作突变幼虫之间恢复时间明显且显着的差异。确保所选电压不会导致长时间恢复，从而影响吞吐量。对于药物制备，将溶解在适当溶剂中的药物直接添加到固体苍蝇食物的表面，并留出时间使其浸泡和蒸发。或者，从小瓶中舀出食物并重新融化。当温度冷却到40摄氏度时，加入药物溶液并使用涡旋混合器充分混合。将大约五毫升处理过的食物倒回小瓶中，让其凝固后再使用。通过测试一系列药物浓度来运行浓度梯度，以确定最佳剂量。对测试基因型的幼虫或暴露于药物的幼虫进行电击，并测量癫痫发作恢复时间。应用 300 秒的截止时间，以消除过长的恢复持续时间。仅将恢复时间大于 30 秒的癫痫发

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

电击诱导 果蝇 幼虫癫痫发作的活动

本文介绍了用于测量果蝇幼虫神经肌肉接头处突触传递的电生理学方法。通过刺激运动神经元轴突可人工引发递质释放，而神经肌肉接头（NMJ）的传递情况可通过记录肌肉中诱发的突触后反应进行测量。...

果蝇幼虫神经肌肉接头突触电位记录的电生理学方法

通过高频电刺激，可在Drosophila中诱导产生类似癫痫发作的活动。该活动可轻松从巨纤维系统记录得到。...

癫痫突变体中癫痫发作的神经环路检测方法 果蝇

该实验利用蓝光激活的藻类通道蛋白和细胞特异性基因表达工具，在果蝇（Drosophila）幼虫的神经肌肉接头（NMJ）处通过光脉冲诱导突触电位。该技术为科研和教学实验室中的突触生理学研究提供了一种成本低廉且易于使用的替代方法，可取代传统的吸吮电极刺激。...

光遗传刺激突触电位的通道视紫红质2介导方法 果蝇 神经肌肉接头

对黑腹果蝇（Drosophila）胚胎进行电生理记录，可分析发育中肌肉和神经元的电学特性，并表征谷氨酸能神经肌肉接头以及中枢胆碱能和GABA能突触的功能性突触形成过程。...

电生理记录在 果蝇 胚胎

该视频展示了从黑腹果蝇幼虫中枢神经系统（CNS）进行神经元活动的细胞外记录。将切断的中枢神经系统置于记录室中，记录下行神经的电活动，以确定其基础放电频率。随后引入测试剂，记录放电频率的变化，以判断该试剂的兴奋性或抑制性作用。...

细胞外记录神经元电活动 果蝇 中枢神经系统

本文介绍了一种记录幼年斑马鱼前脑细胞外场电位的简单方法。该方法可提供癫痫样活动的稳定体内读数。该技术可用于携带癫痫相关基因的转基因斑马鱼幼鱼，或通过给予致惊厥药物诱发癫痫的模型。...

幼年斑马鱼前脑电生理记录

介绍了测量成年Drosophila关联记忆的方法。该检测基于果蝇将某种气味与负面强化刺激（电击）相关联的能力，并能在后续时间回忆该信息，从而实现对记忆的测量。...

Drosophila 成年果蝇嗅觉休克学习

利用网络摄像头以及免费或低成本的软件组合，可以分析黑腹果蝇（Drosophila...

一种低成本分析类癫痫活动及运动行为的方法 黑腹果蝇

本方案描述了一种记录黑腹果蝇（Drosophila...

Drosophila Melanogaster 三龄幼虫中枢神经系统活动的电生理记录

本文介绍了一种斑马鱼癫痫模型的建立与表征方案，该模型源于对DEPDC5基因的瞬时抑制。...

癫痫斑马鱼模型中的行为与生理学分析

在此，我们介绍一种实验方案 离体 在表达GCaMP6的成年个体中进行钙成像 果蝇 以监测癫痫样活动。该方案为研究成人中的发作事件提供了一种有价值的工具 果蝇 通过 离体...

Ex Vivo 钙成像用于癫痫的Drosophila模型

了解利用果蝇幼虫模型筛选抗癫痫化合物的实验方法。该方案通过电击诱导癫痫发作，评估候选药物对神经兴奋性的影响，为开发新型癫痫治疗策略提供高通量筛选平台。

电休克诱发的癫痫发作活动果蝇幼虫

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电休克诱发的癫痫发作活动 果蝇 幼虫

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