使用竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测固体组织中的环磷酸鸟苷（cGMP）

Dechter 实验室研究一氧化氮代谢。一氧化氮通过适应性稳态级联反应刺激环磷酸鸟苷（cyclic GMP）的生成。我们的目标是了解衰老、饮食及其他因素如何影响这一级联过程。以往的研究主要集中于一氧化氮的生成及其产生的生理效应，却忽视了连接这两者的信号级联机制。本实验方案通过检测该级联中的第二信使——环磷酸鸟苷（cyclic GMP），提供了一种简单、易行且可广泛适用于多种组织类型的方法。

［旁白］首先，

将组织研磨器、镊子和勺子置于干冰上预冷10分钟。称取过量的猪组织，以补偿研磨过程中的损失。将组织转移至置于干冰上的预冷研磨器中。向研磨器中倒入液氮，快速冷冻组织，待液氮完全挥发后再进行下一步操作。盖上研磨器盖子，用橡胶锤敲击15次。将珠磨匀浆管在天平上去皮。使用预冷的勺子和镊子将研磨后的组织转移至该匀浆管中。用移液器向匀浆管中加入0.1 N盐酸，确保所加体积（微升）为组织质量（毫克）的整数倍。然后使用珠磨匀浆器对组织样本进行匀浆。在4°C条件下，以17,000 g离心匀浆液30分钟。将上清液转移至微量离心管中，在4°C条件下再次离心10分钟。取部分最终上清液 aliquot 转移至新的微量离心管中，并置于冰上备用。 接下来，向标记为“标准品B”的试管中加入9.9毫升ELISA缓冲液。向该“标准品B”管中加入100微升标准品储备液，充分涡旋混匀以确保均匀悬浮。从“标准品B”管中转移1,000微升溶液至标记为“标准品1”的试管中。向标记为“标准品0”及“标准品2至8”的各管中分别加入500微升ELISA缓冲液。涡旋混匀“标准品1”管，然后从中转移500微升溶液至“标准品2”管。涡旋混匀“标准品2”管，再转移500微升溶液至“标准品3”管。依次将500微升溶液从前一标准品管转移至下一管，每次转移后均需充分涡旋混匀，直至完成“标准品8”的配制。 对于样本的乙酰化处理，在250微升样本aliquot中加入50微升4 M氢氧化钾溶液。立即加入12.5微升乙酸酐。涡旋混匀15秒。然后加入12.5微升4 M氢氧化钾溶液，再次涡旋混匀。在标记为“标准品0”的试管中，加入100微升4 M氢氧化钾溶液，随后立即加入25微升乙酸酐。涡旋混匀后，向管中加入25微升4 M氢氧化钾溶液，并短暂涡旋。对剩余各标准品管重复上述氢氧化钾与乙酸酐的添加步骤，并在每次添加后充分涡旋混匀。 将预定比例的ELISA缓冲液与乙酰化样本aliquot加入微量离心管中。涡旋混匀“标准品0”管。将“标准品0”以50微升aliquot分别加入ELISA微孔板中指定的NSB和B零（B naught）孔，共五孔。然后向含有“标准品0”的两个NSB孔中各加入50微升ELISA缓冲液。使用同一枪头，从“标准品8”开始至“标准品1”，将各标准品以50微升aliquot重复加入指定孔中。涡旋混匀每个样本。然后将50微升样本分别以双复孔或三复孔形式加入相应微孔中。向所有标记为NSB、B零、标准品和样本的孔中加入50微升乙酰胆碱酯酶示踪剂。向每个B零、标准品和样本孔中加入50微升抗血清。用封板膜覆盖ELISA板，在4°C孵育18小时。 孵育结束后，将ELISA板倒置于废液容器上方，弃去孔内液体。用洗瓶向各孔中加入洗涤缓冲液，轻轻振荡5秒，然后倾倒弃去洗液，并将板在纸巾上轻拍以去除残留液体。将Ellman试剂转移至试剂槽中。迅速使用多通道移液器向空白孔、NSB孔、B零孔、TA孔、标准品孔和样本孔中各加入200微升Ellman试剂。向TA孔中加入5微升乙酰胆碱酯酶示踪剂。然后用Parafilm封板，将ELISA板置于避光容器中，在室温下震荡孵育60至90分钟。移除Parafilm，于412纳米波长处测定吸光度。 对照组猪肝中环磷酸鸟苷（cyclic GMP）浓度约为0.0202纳摩尔/克组织。硝酸盐处理组中，环磷酸鸟苷浓度升高至约0.0364纳摩尔/克组织。