Name: 使用竞争性酶联免疫吸附测定 （ELISA） 测量固体组织中的环磷酸鸟苷 （cGMP） (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-03T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 15 s
Description: 学习使用竞争性酶联免疫吸附测定法测量固体组织中的环磷酸鸟苷浓度。本研究以猪组织为样本，建立了一套简单可靠且易于适应多种组织类型的实验方案，为深入了解一氧化氮代谢相关信号通路提供了重要方法。

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本工作由美国国立糖尿病、消化及肾脏疾病研究所（NIDDK/NIH）院内研究项目向 Alan N. Schechter 资助，项目编号为 1ZIADK025104-18。

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<li>Koglin, M., Behrends, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+domain+of+the+alpha1+subunit+of+soluble+guanylyl+cyclase+is+necessary+for+activation+of+the+enzyme+by+nitric+oxide+and+YC-1+but+is+not+involved+in+heme+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A functional domain of the alpha1 subunit of soluble guanylyl cyclase is necessary for activation of the enzyme by nitric oxide and YC-1 but is not involved in heme binding.</a> J Biol Chem. 278 (14), 12590-12597 (2003).</li>
<li>Olson, L. J., Knych, E. T., Herzig, T. C., Drewett, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+guanylyl+cyclase+inhibitor+reverses+nitric+oxide-induced+vasorelaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Selective guanylyl cyclase inhibitor reverses nitric oxide-induced vasorelaxation.</a> Hypertension. 29 (1), 254-261 (1997).</li>
<li>Bailey, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+supplementation+reduces+the+O2+cost+of+low-intensity+exercise+and+enhances+tolerance+to+high-intensity+exercise+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate supplementation reduces the O2 cost of low-intensity exercise and enhances tolerance to high-intensity exercise in humans.</a> J Appl Physiol (1985). 107 (4), 1144-1155 (2009).</li>
<li>Vanhatalo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+and+chronic+effects+of+dietary+nitrate+supplementation+on+blood+pressure+and+the+physiological+responses+to+moderate-intensity+and+incremental+exercise%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute and chronic effects of dietary nitrate supplementation on blood pressure and the physiological responses to moderate-intensity and incremental exercise.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 299 (4), R1121-R1131 (2010).</li>
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<li>Radomski, M. W., Palmer, R. M., Moncada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+l-arginine%2Fnitric+oxide+pathway+present+in+human+platelets+regulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">An l-arginine/nitric oxide pathway present in human platelets regulates aggregation.</a> PNAS. 87 (13), 5193-5197 (1990).</li>
<li>Thomas, D. D., Liu, X., Kantrow, S. P., Lancaster, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biological+lifetime+of+nitric+oxide%3A+Implications+for+the+perivascular+dynamics+of+NO+and+O2%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">The biological lifetime of nitric oxide: Implications for the perivascular dynamics of NO and O2.</a> PNAS. 98 (1), 355-360 (2001).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+skeletal+muscle+homogenates+for+nitrate+and+nitrite+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat skeletal muscle homogenates for nitrate and nitrite measurements.</a> J Vis Exp. (173), e62427(2021).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166(2020).</li>
<li>Srihirun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrate+uptake+and+metabolism+in+human+skeletal+muscle+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">Nitrate uptake and metabolism in human skeletal muscle cell cultures.</a> Nitric Oxide. 94, 1-8 (2020).</li>
<li>Montoliu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+nitric+oxide+and+atrial+natriuretic+peptide+changes+with+altered+cGMP+homeostasis+in+liver+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">Correlation of nitric oxide and atrial natriuretic peptide changes with altered cGMP homeostasis in liver cirrhosis.</a> Liver Int. 25, 787-795 (2005).</li>
<li>Origlia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+cGMP+inversely+correlates+with+age+in+healthy+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet cGMP inversely correlates with age in healthy subjects.</a> J Endocrinol Invest. 27 (2), RC1-RC4 (2004).</li>
<li>Calamera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fret-based+cyclic+GMP+biosensors+measure+low+cGMP+concentrations+in+cardiomyocytes+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Fret-based cyclic GMP biosensors measure low cGMP concentrations in cardiomyocytes and neurons.</a> Commun Biol. 2, 394(2019).</li>
<li>Rutkowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+imaging+of+cGMP+signaling+shows+pronounced+differences+between+glomerular+endothelial+cells+and+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Real-time imaging of cGMP signaling shows pronounced differences between glomerular endothelial cells and podocytes.</a> Sci Rep. 14, 26099(2024).</li>
<li>Straub, A. C., Beuve, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+measuring+cGMP+signaling+and+cGMP-mediated+vascular+relaxation%5BTitle%5D)+AND+%22Nitric+Oxide%22%5BJournal%5D)">A primer for measuring cGMP signaling and cGMP-mediated vascular relaxation.</a> Nitric Oxide. 117, 40-45 (2021).</li>
<li>Huang, K. T., Lin, T. J., Hsu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+cyclic+GMP+concentration+using+a+gold+nanoparticle-modified+optical+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">Determination of cyclic GMP concentration using a gold nanoparticle-modified optical fiber.</a> Biosens Bioelectron. 26 (1), 11-15 (2010).</li>
<li>Cyclic gmp elisa kit. , 
 <a target="_blank" href="https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf">https://cdn.caymanchem.com/cdn/seawolf/insert/581021.pdf</a> (2024).</li>
<li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+nitrate+metabolism+in+porcine+ocular+tissues+determined+using+15N-labeled+sodium+nitrate+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Dietary nitrate metabolism in porcine ocular tissues determined using 15N-labeled sodium nitrate supplementation.</a> Nutrients. 16 (8), 1154(2024).</li>
<li>Cgmp enzyme immunoassay kit, direct technical bulletin. , 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V">https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/289/571/cg200bul.pdf?srsltid=AfmBOoqWnOVurQ549ESXk_E7DJoqNs7v268ktTabHHYc6I_6NZkc-j_V</a> (2025).</li>
<li>Cyclic gmp competitive elisa lysate and homogenate samples. , 
 <a target="_blank" href="https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf">https://assets.thermofisher.com/TFS Assets/LSG/certificate/Certificates%20of%20Analysis/RA229061_EMSCGMPL.pdf</a> (2025).</li>
<li>Hamad, A. M., Range, S., Holland, E., Knox, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cGMP+by+soluble+and+particulate+guanylyl+cyclases+in+cultured+human+airway+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cGMP by soluble and particulate guanylyl cyclases in cultured human airway smooth muscle.</a> Am J Physiol. 273 (4), L807-L813 (1997).</li>
<li>Mo, E., Amin, H., Bianco, I. H., Garthwaite, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+a+cellular+nitric+oxide%2FcGMP%2Fphosphodiesterase-5+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Kinetics of a cellular nitric oxide/cGMP/phosphodiesterase-5 pathway.</a> J Biol Chem. 279 (25), 26149-26158 (2004).</li>
<li>Corbin, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5B3h%5Dsildenafil+binding+to+phosphodiesterase-5+is+specific%2C+kinetically+heterogeneous%2C+and+stimulated+by+cGMP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">[3h]sildenafil binding to phosphodiesterase-5 is specific, kinetically heterogeneous, and stimulated by cGMP.</a> Mol Pharmacol. 63 (6), 1364-1372 (2003).</li>
</ol>

作者声明不存在利益冲突。

本实验方案提供了使用竞争性ELISA法测定固体组织中cGMP浓度所需步骤的操作说明。cGMP浓度的变化可反映组织中一氧化氮（NO）含量的差异。通过研究固体组织中的这些差异，可阐明不同器官中NO的相关信息。
在该实验方案中，组织样本首先被均质化以用于ELISA检测。该过程始于将一定质量的固体组织进行速冻，随后将其粉碎。在均质化步骤之前对组织进行破碎，旨在帮助珠磨均质器更有效地裂解细胞。组织在0.1 N盐酸中进行均质化，以沉淀蛋白质，该技术亦见于其他方法中。20,21最后，将固体和沉淀物与可溶性组分分离 通过 离心。为制作标准曲线，将cGMP储备液（300 pmol cGMP/mL）进行系列稀释，得到八种不同浓度的标准品。标准品与样品均经过乙酰化处理，以提高检测灵敏度，最低可检测至0.1 pmol cGMP/mL。该灵敏度的提升源于乙酰基与cGMP形成共价键，从而增强抗血清中各抗体与乙酰化cGMP的结合能力。18乙酰化标准品和样品可确保各孔间cGMP结合的一致性。若预期微孔板各孔中cGMP浓度超过1.0 pmol/mL，则可省略标准品和样品的乙酰化步骤。18.
在将样品加入孔板之前，使用ELISA缓冲液对样品进行进一步稀释。额外的稀释使样品的信号落在标准曲线范围内，并使其成分更接近非特异性结合孔（NSB）、B0孔和标准品孔中的内容，从而实现体系的一致性。除了样品和标准品外，还需在孔中加入其他几种溶液。在NSB孔中，加入ELISA缓冲液（含或不含乙酰化试剂），但不加抗血清，目的是测定乙酰胆碱酯酶标记物（与cGMP结合的乙酰胆碱酯酶）在缺乏抗血清中特异性抗体的情况下，与孔板表面附着的小鼠IgG结合的量。B0孔中含有ELISA缓冲液（含乙酰化试剂）、AChE标记物和抗血清，因此B0孔反映了在没有cGMP竞争时AChE标记物的结合能力。所有孔加样完成后，将微孔板进行孵育，随后洗涤。向各孔中加入Ellman试剂。最后，在加入Ellman试剂后，向TA孔中添加AChE标记物。该孔用于反映AChE标记物的催化活性，而不受抗体结合至微孔板上的标记物量的影响。微孔板在室温下显色，使AChE标记物催化显色反应。
实验方案中的多个步骤可能影响检测结果；为获得最佳结果，在执行以下步骤时需格外谨慎。在匀浆步骤以及乙酰化后，需确定每种组织类型的合适稀释倍数，以确保样品的检测值落在标准曲线范围内。配制标准品时，每次取样前或加入样品后，溶液均应充分涡旋振荡或混匀，以确保各标准品达到预期的cGMP浓度。在乙酰化步骤中，每个标准品和样品应以相同的时长进行涡旋振荡，以获得一致的吸光度读数。在将样品或标准品加入相应孔板前，也应立即进行涡旋振荡，以提高cGMP浓度测定的准确性。充分洗涤微孔板有助于提高吸光度值的准确性，因为它可彻底去除孔中未结合的乙酰胆碱酯酶示踪物。加入Ellman试剂后，应给予足够时间让微孔板显色，并注意观察颜色变化，尤其是B0孔的吸光度值。需要注意的是，cGMP浓度较低的样品在复孔或三复孔之间的浓度差异可能大于高浓度样品。检测更高浓度的样品可能有助于缓解此问题。此外，为消除不同微孔板之间的差异，相同组织类型的样品应尽可能在同一块板上进行检测。遵循上述建议可提高检测数据的质量。
上述方案可推广至其他柔软的实体组织。进一步优化本方案中的组织制备部分，可能获得适用于处理硬组织（包括骨骼）的方法，后者因其血管化特性而具有研究价值。该技术的持续发展有望建立一种适用于多种实体组织中cGMP浓度测定的方法，从而为获取几乎任何组织中一氧化氮（NO）丰度的额外信息提供有力工具。尽管上述竞争性ELISA方案是测定cGMP浓度并估算NO丰度的有效技术，但仍存在两个显著局限性：（1）该检测无法区分由可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）和颗粒型鸟苷酸环化酶（pGC）合成的cGMP。利钠肽可激活pGC活性22，因此通过该通路引起的cGMP变化并不反映NO丰度的变化；（2）此外，磷酸二酯酶（PDE）的活性会影响ELISA检测结果。多种PDE可水解cGMP，从而在NO激活sGC后降低其浓度23。因此，PDE的催化活性可能掩盖cGMP浓度与NO丰度之间的关联。对于主要旨在获取精确cGMP浓度而非仅观察其变化趋势的实验，建议添加PDE5抑制剂（如西地那非）以防止cGMP降解。可在样本采集前约1小时向动物给予西地那非（药效可持续达4小时24）；若无法实现体内给药，也可将西地那非直接加入采集后的样本中。若在组织采集后抑制PDE活性，应将西地那非加入0.1 N盐酸溶液中，使组织在含有西地那非的条件下进行匀浆。需同时检测加与不加西地那非的样本，以确保动物处理与西地那非之间无交叉干扰。
尽管存在局限性，该检测方法仍被用于深入了解一氧化氮信号的下游传递过程。总之，将固体组织中cGMP浓度的测定与其他一氧化氮检测方法相结合，有助于更全面地理解一氧化氮在器官中的作用。

环磷酸鸟苷（cGMP）是一种信号分子，可通过一氧化氮（NO）-cGMP信号通路诱导生理变化。在NO-cGMP通路中，NO与可溶性鸟苷酸环化酶结合，该胞质酶可将三磷酸鸟苷转化为cGMP，从而增强其催化活性1,2cGMP浓度的随后升高可激活促进血管舒张的信号通路3，导致血压下降4,5，一氧化氮存在时的主要生理反应特征 体内此外，已知一氧化氮（NO）可影响免疫功能6，提高身体活动期间的耐力4并通过抑制血小板聚集防止血液凝固7.
直接测量NO因其半衰期不足数秒而变得困难 体内8 在大多数生物组织中。因此，阐明一氧化氮的生理效应需要一种测量其含量的方法 离体因此，可用的定量方法通常避免直接测量NO。一种常见的估算组织中NO浓度的方法是检测其更稳定的代谢产物：亚硝酸盐和硝酸盐。4,5,9,10,11使用亚硝酸盐和硝酸盐浓度作为NO丰度指标的主要问题是，这两种代谢物分别还可作为NO的前体物质和储存分子。NO的代谢物，尤其是硝酸盐，在某些食物中含量较高。因此，通过检测位于NO下游的cGMP浓度变化，有助于估算有活性的NO含量，从而在不受原有亚硝酸盐和硝酸盐干扰的情况下确定NO的丰度。
既往研究主要依赖于测量血浆12和血小板13中的cGMP浓度，但对实体组织中cGMP浓度的测定则较少见。能够测定实体组织中cGMP浓度的方法将有助于表征一氧化氮（NO）在特定器官中的活性。本研究旨在建立一种利用竞争性ELISA检测实体组织中cGMP的简化方法。使用竞争性ELISA的一个优势在于，其所需的设备在大多数关注NO研究的实验室中均常见，例如常用于其他用途的酶标仪。相比之下，其他一些检测方法则需要在NO相关实验中较少使用的设备，例如显微镜14,15、闪烁计数器16或激光器17。除了设备易得之外，竞争性ELISA检测cGMP还具有高灵敏度；cGMP浓度可低至0.1皮摩尔（pmol）/mL18。通过对cGMP ELISA试剂盒（材料表）说明书18进行少量修改，成功建立了一种利用竞争性ELISA测定实体组织中cGMP的方法。

<table><tbody><tr><td>1 mL BD 透明口服注射器</td><td>Becton Dickinson</td><td>50382903052177</td><td></td></tr><tr><td>14 mL 圆底试管</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml 微量离心管，多种规格</td><td>Olympus Plastics</td><td>24-283A</td><td></td></tr><tr><td>30–300 &amp;micro;L 多通道移液器&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>3125000052</td><td></td></tr><tr><td>乙酸酐（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>400031</td><td>98% 纯度&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：易燃，腐蚀性：严重灼伤皮肤，造成眼部损伤，急性毒性&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：远离点火源，在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>cGMP 乙酰胆碱酯酶示踪剂（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>481020</td><td>磷酸氢二钾，氯化钠，&amp;nbsp; 磷酸二氢钾，牛血清白蛋白，叠氮化钠，EDTA，cGMP AChE 示踪剂&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：健康危害：反复暴露可导致器官毒性，&lt;br/&gt; 腐蚀性：眼部损伤，&lt;br/&gt; 皮肤和呼吸道刺激物&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>cGMP ELISA 抗血清（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>481022</td><td>磷酸氢二钾，氯化钠，&amp;nbsp; 磷酸二氢钾，牛血清白蛋白，&amp;nbsp; 叠氮化钠，EDTA，兔抗-cGMP 多克隆抗血清&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：健康危害：反复暴露可导致器官毒性，&lt;br/&gt; 腐蚀性：眼部损伤，&lt;br/&gt; 皮肤和呼吸道刺激物，急性毒性&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>cGMP ELISA 标准品（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>481024</td><td>磷酸氢二钾，氯化钠，&amp;nbsp; 磷酸二氢钾，牛血清白蛋白，&amp;nbsp; 叠氮化钠，EDTA，cGMP 标准品&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：健康危害：反复暴露可导致器官毒性，&lt;br/&gt; 腐蚀性：眼部损伤，&lt;br/&gt; 皮肤和呼吸道刺激物&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA 试剂盒</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>581021</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 缓冲液浓缩液 10X（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>400060</td><td>1 M 磷酸盐，1% BSA，4 M 氯化钠，10 mM EDTA，0.1% 叠氮化钠&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：健康危害：反复暴露可导致器官毒性，&lt;br/&gt; 腐蚀性：眼部损伤，&lt;br/&gt; 皮肤和呼吸道刺激物&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，储存于带可关闭盖子的容器中，佩戴手套</td></tr><tr><td>ELISA 试剂储液槽</td><td>Pierce（现为 Thermo Fisher Scientific）</td><td>15075</td><td></td></tr><tr><td>Ellman 试剂（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>400050</td><td>磷酸氢二钾，氯化钠，磷酸二氢钾，乙酰硫代胆碱（碘化物），5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：急性毒性，健康危害：器官毒性，腐蚀性：眼部损伤，皮肤刺激物，呼吸道刺激物&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>盐酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331</td><td>&lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：腐蚀性：腐蚀金属，严重灼伤皮肤，眼部损伤，呼吸道刺激物&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>液氮</td><td>Robert's Oxygen</td><td></td><td>氮气&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：压缩气体：存在低温灼伤、冻伤和窒息风险&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>小鼠抗兔 IgG 包被板（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>400006</td><td>&lt;br/&gt; 危险：无</td></tr><tr><td>New Classic MF 天平</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>轨道摇床&amp;nbsp;</td><td>Stovall Life Science Inc.（现为 IBI Scientific）</td><td>15-453-211（因型号而异）</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 封口膜</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>3023-4526（因型号而异）</td><td></td></tr><tr><td>聚山梨酯 20（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>400035</td><td>&lt;br/&gt; 危险：无</td></tr><tr><td>氢氧化钾（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>400029</td><td>85% 纯度&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：腐蚀性：腐蚀金属和皮肤，&lt;br/&gt; 眼部损伤，急性毒性&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr><tr><td>Precellys Evolution 匀浆仪</td><td>Bertin Technologies</td><td>PE000062-PEVO0-A</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 组织裂解试剂盒（硬组织匀浆）</td><td>Bertin Technologies</td><td>P000911-LYSK0-A</td><td></td></tr><tr><td>Sense 微孔板读板仪</td><td>HIDEX</td><td>425-301</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend Micro 17R 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002441</td><td></td></tr><tr><td>组织研磨器</td><td>Cellcrusher</td><td>Cellcrusher 试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Genie 2 涡旋振荡器</td><td>Scientific Industries&amp;nbsp;</td><td>SI-0246</td><td></td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z423092</td><td></td></tr><tr><td>洗涤缓冲液浓缩液 400X（cGMP 试剂盒内）</td><td>Cayman Chemical Company</td><td>400062</td><td>磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，水&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;危险&lt;/strong&gt;：腐蚀性：眼部损伤，急性毒性，皮肤刺激物，器官毒性&lt;br/&gt; &lt;strong&gt;安全操作&lt;/strong&gt;：在通风区域操作，佩戴手套</td></tr></tbody></table>

使用竞争性酶联免疫吸附测定法（elisa）检测固体组织中的环磷酸鸟苷（cgmp）

Measurement of Cyclic Guanosine Monophosphate (cGMP) in Solid Tissues using Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

产生环磷酸鸟苷（cGMP）的主要通路之一是 一氧化氮（NO）-cGMP 通路。在该通路中，NO 激活可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）的催化活性，促使三磷酸鸟苷转化为 cGMP。NO 受到广泛关注，因为在哺乳动物中，它具有多种生理功能，包括作为主要的血管扩张剂、血小板聚集抑制剂、免疫功能调节介质、神经递质，以及在体力活动过程中增强耐力等。测定不同组织中 NO 的含量有助于阐明其生物学功能。然而，由于 NO 的半衰期不足数秒，无法直接进行检测。通常通过测定其代谢产物硝酸盐和亚硝酸盐的水平来间接评估 NO 的含量，因为这些分子可相互转化 体内 通过氧化还原反应。另一种较少使用的估算NO丰度的方法是检测cGMP的浓度，cGMP是NO下游的一种信号分子。然而，尽管检测组织中的cGMP有助于更深入理解NO在器官中的功能，但此类检测在组织中却很少进行。因此，亟需一种用于测定实体器官和组织中cGMP浓度的实验方案。在本方案中，采集的猪组织经匀浆处理后，对处理后的样品进行竞争性ELISA检测，并将吸光度值转换为每克原始组织中cGMP的纳摩尔数。简言之，本方案阐述了一种利用环磷酸鸟苷（cGMP）ELISA试剂盒测定固体组织中cGMP浓度的简便方法。

连续五天每天一次在饲料中给予约克夏家猪口服氯化钠（0.15 mmol/kg）或15N标记的硝酸盐（0.15 mmol/kg），在组织采集前用肝素钠（0.9%氯化钠）溶液进行灌注；所有采集细节此前已有发表19。按照所述ELISA方案，测定四只约克夏家猪臀肌和肝脏中的cGMP浓度。肝脏组织以0.1 N盐酸（HCl）按1:5稀释比例稀释，臀肌组织则按1:10稀释比例稀释，以沉淀蛋白质。HCl稀释后的匀浆样品经乙酰化处理后，再分别以1:2和1:3的稀释比例用ELISA缓冲液进一步稀释肝组织和臀肌组织样品。cGMP浓度的测定方法如上所述。将吸光度值转换为每毫升制备样品中cGMP的皮摩尔数，再根据上述方案换算为每克组织中cGMP的纳摩尔数（nmol/g of tissue）。
在上述条件下，测得的肝组织中cGMP浓度获得了最佳的实验结果。猪肝组织中对照组和硝酸盐处理组的cGMP浓度分别为0.0202 nmol/g ± 0.003 nmol/g组织和0.0364 nmol/g ± 0.011 nmol/g组织（图3）。多个指标证实了结果的可靠性。扣除空白值后，B0 孔的吸光度范围为0.466至0.475，处于0.3 AU至1.0 AU之间，表明Ellman试剂的微孔板显色充分。标准曲线质量较高，表现为从标准品1到标准品8的吸光度呈递增趋势，且标准曲线具有良好线性，其决定系数为0.99。每个检测孔的百分比<img alt="静态平衡方程图，B/B₀表示平衡公式分析。" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="公式1">（31.5%–71.2%）均位于20%至80%之间，说明所有样品均落在标准曲线的有效范围内。具备上述特征的样品可用于结果分析。
在臀肌组织中测得的cGMP浓度导致实验结果不理想。由于大多数臀肌样本孔的百分比<img alt="静态平衡方程图，B/B₀ 表示平衡公式分析。" src="/files/ftp_upload/68432/68432eq001.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Equation 1">值（3.69%–27.3%）低于20%，表明需要进一步稀释样本，才能使吸光度落在标准曲线范围内，因此将“结果不理想”标签分配给臀肌组织的检测结果。猪臀肌组织中对照组和硝酸盐处理组的cGMP浓度分别为1.22 nmol/g ± 0.49 nmol/g组织和0.732 nmol/g ± 0.18 nmol/g组织（图未显示）。臀肌样本的吸光度与肝脏样本的B0孔及标准品存在重叠。使用这些不理想的样本可能导致错误结论；因此，需要制备更稀释的样本并重新测定cGMP浓度。
<img alt="猪肝cGMP水平比较，对照组与硝酸盐组，带误差线的柱状图，无显著性差异。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68432/68432fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：肝组织中cGMP浓度。经氯化钠（0.15 mmol/kg）或15N标记的硝酸盐（0.15 mmol/kg）处理的猪肝组织中cGMP的平均浓度，单位为nmol/g组织。n = 4；误差线表示标准差；数据采用Welch t检验进行分析；ns表示无显著性差异。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68432/68432fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本方案采用竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测固体组织中的环磷酸鸟苷（cGMP）浓度。本方案详细描述了固体组织的处理方法、竞争性ELISA的操作步骤、将吸光度转换为每毫升皮摩尔（pmol/mL）cGMP浓度的方法，以及最终以每克组织中cGMP的纳米摩尔数（nmol/g）计算结果的流程。

使用竞争性酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测固体组织中的环磷酸鸟苷（cGMP）

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接下来，向标记为“标准品B”的试管中加入9.9毫升ELISA缓冲液。向该“标准品B”管中加入100微升标准品储备液，充分涡旋混匀以确保均匀悬浮。从“标准品B”管中转移1,000微升溶液至标记为“标准品1”的试管中。向标记为“标准品0”及“标准品2至8”的各管中分别加入500微升ELISA缓冲液。涡旋混匀“标准品1”管，然后从中转移500微升溶液至“标准品2”管。涡旋混匀“标准品2”管，再转移500微升溶液至“标准品3”管。依次将500微升溶液从前一标准品管转移至下一管，每次转移后均需充分涡旋混匀，直至完成“标准品8”的配制。

对于样本的乙酰化处理，在250微升样本aliquot中加入50微升4 M氢氧化钾溶液。立即加入12.5微升乙酸酐。涡旋混匀15秒。然后加入12.5微升4 M氢氧化钾溶液，再次涡旋混匀。在标记为“标准品0”的试管中，加入100微升4 M氢氧化钾溶液，随后立即加入25微升乙酸酐。涡旋混匀后，向管中加入25微升4 M氢氧化钾溶液，并短暂涡旋。对剩余各标准品管重复上述氢氧化钾与乙酸酐的添加步骤，并在每次添加后充分涡旋混匀。

将预定比例的ELISA缓冲液与乙酰化样本aliquot加入微量离心管中。涡旋混匀“标准品0”管。将“标准品0”以50微升aliquot分别加入ELISA微孔板中指定的NSB和B零（B naught）孔，共五孔。然后向含有“标准品0”的两个NSB孔中各加入50微升ELISA缓冲液。使用同一枪头，从“标准品8”开始至“标准品1”，将各标准品以50微升aliquot重复加入指定孔中。涡旋混匀每个样本。然后将50微升样本分别以双复孔或三复孔形式加入相应微孔中。向所有标记为NSB、B零、标准品和样本的孔中加入50微升乙酰胆碱酯酶示踪剂。向每个B零、标准品和样本孔中加入50微升抗血清。用封板膜覆盖ELISA板，在4°C孵育18小时。

孵育结束后，将ELISA板倒置于废液容器上方，弃去孔内液体。用洗瓶向各孔中加入洗涤缓冲液，轻轻振荡5秒，然后倾倒弃去洗液，并将板在纸巾上轻拍以去除残留液体。将Ellman试剂转移至试剂槽中。迅速使用多通道移液器向空白孔、NSB孔、B零孔、TA孔、标准品孔和样本孔中各加入200微升Ellman试剂。向TA孔中加入5微升乙酰胆碱酯酶示踪剂。然后用Parafilm封板，将ELISA板置于避光容器中，在室温下震荡孵育60至90分钟。移除Parafilm，于412纳米波长处测定吸光度。

对照组猪肝中环磷酸鸟苷（cyclic GMP）浓度约为0.0202纳摩尔/克组织。硝酸盐处理组中，环磷酸鸟苷浓度升高至约0.0364纳摩尔/克组织。

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