Name: 开发一种创新的基于 LED 的照明装置，用于 Rose Bengal 光动力疗法的 体外 应用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: 了解基于LED的3D打印照明装置在Rose Bengal光动力疗法中的应用，用于HepG2肝癌细胞的体外研究。该低成本设备可有效降低癌细胞活力，为癌症治疗研究提供新工具。

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作者谨此感谢法国里尔中心医院和法国国家健康与医学研究院（INSERM）对本研究的支持。

本研究中所用试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 装置构建
注意：CELL-LED-550/3 设备的两个部件是分别制造的，仅在最后一步将其插接在一起。
<ol>
	<li>光源部分的构建
	<ol>
		<li>将适当尺寸的风扇散热器组件安装到印制电路板（PCB）背面，该电路板上安装有550 nm 3 W的LED。</li>
		<li>在LED上覆盖一个透明的PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）准直透镜，以首先均化光束，其次将光束角度从120°减小至10°。这种角度减小可提高传递至光分配部分的光量。</li>
		<li>将LED连接至具有三模调光功能的恒流驱动器，从而实现不同辐照度水平的输出。</li>
		<li>分别通过3D打印制作外壳、外壳前部和外壳封盖（见图1中的红色框）。</li>
		<li>将驱动器以及配备有透镜和风扇散热器组件的LED安装至外壳内的指定位置（见图1中的蓝色框）。</li>
		<li>将电源插孔和摇杆开关安装至外壳封盖的指定位置（见图1中的蓝色框）。</li>
		<li>通过摇杆开关将驱动器和风扇散热器组件连接至电源插孔。</li>
		<li>组装外壳、外壳封盖和外壳前部。</li>
		<li>检查LED是否与外壳前部圆柱形开口的轴线对齐。 
		注：外壳前部的圆柱形开口用于实现光源部分（雌性连接器）与光分配部分（雄性连接器）之间的光学连接。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="550nm 光源组件示意图，包含 LED、散热片、准直透镜、驱动器和岩石开关。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 1"> 
图 1： 光源部分的三维前视图（A）、后视图（B）和爆炸图（C）。改编自 Lefebvre, A. 等人30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>光分配部分的构建
	<ol>
		<li>分别通过3D打印制作外壳底盖、外壳主体和顶盖（三者共同构成一个中空盒体）（见图2中的红色框）。</li>
		<li>使用白色材料3D打印96孔间隔器（见图2中的红色框），使其能够精确地安装在1.2.1步骤所述的中空盒体上。采用白色是为了最大限度地增强光反射，从而优化光的分布。 
		注：96孔间隔器上的圆形开孔直径及中心间距应与用于生物学实验的96孔板的孔径及孔中心间距完全一致。</li>
		<li>在中空盒体的顶盖上钻出96个小孔，当96孔间隔器放置于顶盖之上时，这些小孔应与间隔器上的96个圆形开孔中心对齐。</li>
		<li>将直径为0.5 mm的塑料光纤从下至上依次插入顶盖上的96个小孔中。</li>
		<li>在顶盖底部涂覆聚酯树脂，将96根光纤固定于顶盖上。</li>
		<li>待树脂干燥后，打磨光纤远端末端，使其与顶盖上表面齐平。</li>
		<li>将步骤1.2.1中所述中空盒体内部的96根光纤集束，并用护套包裹形成单一股线，护套从盒体引出约两米长。 
		注：盒体高度应足够，以避免光纤弯曲，防止由此引起的光衰减。</li>
		<li>组装中空盒体，使光纤束穿过外壳上的专用开口。</li>
		<li>将光纤近端末端共同嵌入一个3D打印的公接头中，以便与光源部分（母接头）连接。 
		注：该接头设计应无需使用胶水，以避免胶水可能引起的光衰减。</li>
		<li>将96孔间隔器放置在中空盒体上方。</li>
		<li>通过将一张描图纸夹在一块透明PMMA板（底面）和一张防刮聚酯薄膜（顶面）之间，制作一个扩散屏，使每根光纤远端输出的窄光束扩散为与用于生物学实验的96孔板孔径相当的宽光束。</li>
		<li>使用3D打印制作屏幕框架（见图2中的红色框），使其中心开孔尺寸与用于生物学实验的96孔板完全匹配，从而确保各孔与96孔间隔器上的圆形开孔精确对齐。</li>
		<li>使用屏幕框架将扩散屏固定在96孔间隔器顶部。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="光分配器示意图，包含光纤、PMMA 屏幕、光纤束和连接器装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 2"> 
图 2： 光分配器部分的三维视图。改编自 Lefebvre, A. 等人30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本</a>。
<ol start="3">
	<li>将光源部分与光分配部分组装
	<ol>
		<li>将光分配部分的公头连接器插入光源部分的母头连接器。 
		注意：当公头连接器插入母头连接器后，光源部分输出的光束应覆盖光分配部分光接收元件表面面积略大一些的区域，从而确保向96根光纤充分供应光线。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 生物学实验
<ol>
	<li>细胞培养过程
	<ol>
		<li>在添加了10%热灭活牛血清和1%链霉素与青霉素的RPMI 1640培养基中培养肝癌细胞系HepG2。</li>
		<li>将含有HepG2细胞的培养瓶置于37 °C、5% CO2的细胞培养箱中维持培养。</li>
		<li>每3天更换一次培养基：吸去培养瓶中的旧培养基，并加入预热至37 °C的RPMI 1640新鲜培养基。</li>
		<li>使用显微镜观察培养瓶中细胞的融合度，直至达到80%–90%融合度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>接种过程
	<ol>
		<li>将细胞从培养箱中取出，置于预先清洁的微生物安全操作台内。</li>
		<li>移除培养瓶中的培养基。</li>
		<li>用磷酸盐缓冲液清洗培养瓶。</li>
		<li>向细胞中加入3 mL胰蛋白酶（0.25%，0.53 mM），并将培养瓶放回37 °C培养箱中孵育5分钟，以使细胞脱落。</li>
		<li>5分钟后，用7 mL培养基中和胰蛋白酶，并将培养基+胰蛋白酶+细胞的混合液全部转移至15 mL离心管中。</li>
		<li>使用细胞计数仪对细胞进行计数：取20 µL含细胞的溶液置于离心管中，加入20 µL台盼蓝溶液，将细胞与台盼蓝混合液滴加至计数板，插入细胞计数仪中进行计数。</li>
		<li>完成细胞计数后，用培养基将细胞稀释至150,000个细胞/mL的浓度，并以每孔1.5×104个细胞的密度接种于白色、透明平底96孔板中。白色板底旨在最大化孔内光的反射与分布。 
		注：每孔接种的细胞数量需根据所用细胞系进行调整。可能需要预先进行密度梯度实验，以确定最佳接种细胞数。</li>
		<li>为每个检测时间点准备两块96孔板：一块用于光照处理，另一块保持避光作为对照。</li>
		<li>接种后将96孔板在培养箱中孵育24小时，以确保细胞充分贴壁。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>玫瑰红（Rose Bengal）处理
	<ol>
		<li>通过将玫瑰红粉末溶解于10%生理盐水中配制储备液。该溶液应在细胞处理前即刻配制，以避免因玫瑰红不稳定而发生降解。</li>
		<li>用细胞培养基将上述储备液稀释，配制一系列浓度梯度的玫瑰红工作液（0 µM、5 µM、10 µM、25 µM、50 µM、75 µM、100 µM）。</li>
		<li>溶液配制完成后，吸去含细胞孔板中的培养基，每孔加入100 µL不同浓度的玫瑰红处理液。</li>
		<li>将细胞与玫瑰红共同孵育2小时，以促进玫瑰红的细胞内化。 
		注：玫瑰红孵育时间可能因细胞系不同而有所差异。可通过荧光检测优化玫瑰红的摄取动力学，从而确定各细胞系的最佳孵育时间。</li>
		<li>2小时后，吸去玫瑰红溶液，用PBS洗涤细胞两次，每孔加入100 µL不含玫瑰红的新鲜培养基。 
		注：对于较高浓度的玫瑰红处理，可能需要增加PBS洗涤次数。可通过肉眼观察判断洗涤是否充分：当PBS不再因细胞外残留的玫瑰红而呈现粉红色时，表明洗涤已足够。</li>
		<li>用铝箔包裹微孔板以避光。将其中一半孔板用于光动力治疗（PDT）实验（见步骤2.4），另一半保持避光作为对照组（暗条件），用于提供PDT结果的对照数据，并评估非光激活状态下的玫瑰红对细胞活力的影响。其余孔板将用于后续光照装置中的光照处理（PDT条件）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>CELL-LED-550/3设备操作流程
	<ol>
		<li>将光分配器上的公头连接器插入光源的母头接口，然后将光源接入电源插座。</li>
		<li>从培养箱中取出两块微孔板（PDT组和暗对照组），去除PDT组的铝箔，将该板放置在光分配器上。</li>
		<li>将驱动器调光旋钮调至最大值，以最大化LED输出功率，在96个孔上实现平均辐照度为0.62 mW/cm2。 
		注：驱动器调光旋钮应根据生物实验需求选择最合适的档位（共三个可选档位）。无论调光档位如何设置，由于输出辐照度较低，无需佩戴护目镜。</li>
		<li>持续光照直至细胞接收到目标光剂量。为达到所需光剂量，可通过调节两个参数——时间与辐照度——根据以下公式进行计算： 
		光剂量 (J/cm2) = 辐照度 (W/cm2) × 时间 (s) （公式1）。 
		通过调节驱动器调光旋钮，可分别获得0.02 mW/cm2、0.23 mW/cm2或0.62 mW/cm2的辐照度。选定辐照度后，利用公式1计算实现目标光剂量所需的光照时间。</li>
		<li>达到目标光剂量后，关闭设备。将PDT孔板重新用铝箔包裹，并与对照孔板一同放回培养箱，等待后续细胞活力检测。</li>
		<li>可选：如有需要，可按照上述相同流程对其他孔板进行光照处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞活力检测
	<ol>
		<li>PDT处理后，将光照孔板继续在培养箱中孵育24小时，再检测PDT对细胞活力的影响。孵育时间可根据需要调整，以研究PDT对细胞的短期或长期效应。每个PDT后孵育时间点均应设置一块未光照孔板（暗条件）作为对照，并进行相同时间的孵育。</li>
		<li>孵育结束后，取出一块光照孔板和一块未光照孔板，每孔加入100 µL细胞活力检测试剂盒中的试剂，通过检测线粒体代谢和细胞ATP生成水平来评估细胞活力。</li>
		<li>将多孔板置于避光环境中孵育10分钟，再进行细胞活力测定。</li>
		<li>10分钟孵育后，使用多功能酶标仪读取各孔发出的荧光信号。所检测到的荧光强度与活细胞在加入检测试剂时的ATP生成量成正比。</li>
		<li>将未经处理（NT）组的荧光值设为100%细胞活力，将各处理组的荧光值相对于NT组进行归一化处理，计算各处理条件下的细胞活力百分比。</li>
		<li>对每个PDT后检测时间点（例如，处理后24小时、48小时和72小时）重复相同的细胞活力检测流程。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文描述了开发一种专用于核黄素介导光动力疗法（RB-mediated PDT）的创新照明装置的实验方案 体外 以及为所开发的CELL-LED-550/3设备实施概念验证的方案30.
CELL-LED-550/3 由两个部分组成，每个部分具有特定功能。第一部分称为光源部分，其目的是利用单个 LED 产生一个均匀的绿色光束，其直径大于第二部分的光纤束的直径。第二部分称为光分配部分，其目的是通过光纤束将光源部分提供的光单独且远离 LED 地分配至 96 孔板的各个孔中。在距离 LED 最远达 2.5 米的范围内，细胞可以被持续照射任意所需时间，而不会产生因 LED 内部未受控热量而可能引发的有害热效应。
该特性使得CELL-LED-550/3相较于其他专为96孔板照明设计的LED系统具有首个显著优势31,32,33,34,35,36。事实上，所有其他系统均将LED（或LED阵列）置于细胞下方仅几厘米处（通常小于5 cm），这一距离不足以消除LED对细胞造成有害热效应的风险。为降低此类风险，这些系统中的大多数（遗憾的是，并非全部）配备了LED冷却系统32,34,35，有时该冷却系统距离细胞过近（甚至过于接近），反而可能因引起的热波动而对细胞产生不利影响。CELL-LED-550/3设备采用分体式设计，相较于大多数现有的LED系统31,32,33,35,36，提供了另一项显著优势：可在细胞培养孵育箱内对细胞进行照明，而不会对设备本身造成任何风险。其中不含电子元件的光分配部分确实可放置于孵育箱内部，而包含对潮湿环境敏感的电子元件的光源部分则置于外部，以避免腐蚀或故障风险。部分现有的含电子元件的LED系统虽也可实现孵育箱内照明，但此类使用方式首先未被设计者/制造商推荐，其次在使用后需进行“充分”的干燥处理33,34。能够在孵育箱内对细胞进行照明，从而在整个实验过程中维持细胞处于相同的生理条件（温度、湿度和CO2浓度）下，对于避免光动力治疗（PDT）后细胞活力评估中的潜在偏差至关重要，尤其适用于需要长时间照射的实验方案。还应强调的是，CELL-LED-550/3设备采用单个LED即可独立且同时照射全部96个孔。这一原创且创新的特性在前述任何其他LED系统中均未实现31,32,33,34,35,36。大多数此类系统配备96个LED，每个孔下方放置一个LED，因而产生96束独立光束31,33,34,36；而其余系统则通过置于距微孔板数厘米远的6至25个LED，产生覆盖全部或部分孔的全局光束31,32,35。根据现有文献，利用单个LED并通过光纤束实现96束独立光束的生成方式（如CELL-LED-550/3所采用的），此前从未被提出过。
光源部分包含一个根据两个主要标准选定的550 nm 3 W LED。首先，LED的发射光谱（即其中心波长）应与RB光敏剂的吸收光谱重叠。使用所选LED可实现理想的重叠（中心波长：554.4 nm；半高全宽：106.4 nm；两者均依据Lefebvre等人30所述方法估算）（图6），这种重叠对于RB的光激活以及由此引发的RB介导光动力疗法（PDT）至关重要。其次，LED的光功率应低于5 W。该功率限制由光源部分所含准直透镜的允许功率以及光分配部分所含光纤束的允许功率共同决定。
<img alt="玫瑰红B在水中的吸收光谱与CELL-LED-550/3辐照度的光谱吸收对比图；波长分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig6.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图6"> 
图6： 玫瑰红B在水中的吸收光谱。玫瑰红B在水中的最大归一化吸收光谱根据左侧坐标轴绘制，CELL-LED-550/3的平均光谱辐照度则按右侧坐标轴进行缩放。平均光谱辐照度的轮廓与制造商网站上提供的LED数据一致。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
装置两部分之间的光学耦合是一个关键因素。这种耦合一方面旨在将3 W LED发出的光最大限度地收集到一个窄光束中，另一方面则将该光束注入光纤束。针对第一个目标，采用了一种专为印刷电路板（PCB）安装LED设计的短焦距非球面准直透镜，可将120度的LED光束汇聚成空间分布均匀的10度窄光束。由此产生的光束投射出方形LED芯片的图像，与原始光束相比，图像清晰度更高，光学像差更小。关于将该窄光束注入光纤束，需解决四个重要问题。第一，将96根直径为0.5 mm的PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）光学纤维（数值孔径：0.2）的近端集束于一个自制连接器中，形成边长为5 mm的方形受光面（图7）。连接器采用方形而非常规的圆形，以匹配LED芯片经光束投射形成的方形图像，从而减少光损失。第二，该自制连接器设计为无需使用胶水，并采用完全透明的树脂3D打印而成，以减少光吸收，防止材料过热或碳化。第三，连接器的受光面及其末端表面均使用抛光轮进行抛光，以使尽可能多的光通过。第四，也是最后一点，通过理论计算确定透镜与方形受光面之间的距离，随后在光学平台上进行调整，使方形LED投影最均匀的中心区域略微超出受光面范围，实现最佳重叠。
通过这种耦合方式，10度窄光束的输出功率为1.25 W，而由96根光纤组成的光束所传输的总功率为0.12 W（使用了适用于LED光的光电二极管传感器（OPHIR））。
<img alt="用于分析和诊断的光学纤维检测探头，显示被照亮的光纤端面。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig7.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图7"> 
图7： 通过将96根光纤汇集到自制连接器中获得的方形光接收表面。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
CELL-LED-550/3 在孔板外底部表面提供的平均辐照度为 0.62 mW/cm2（标准偏差：0.09 mW/cm2）（图8）。该平均值已考虑上述耦合效率的影响，根据 Lefebvre 等人30 详细描述的方法进行估算，并证实其随时间保持稳定（变异系数低于 0.6%）。由于该辐照度较低（低于前述专为 96 孔板照明设计的其他基于 LED 系统所提供的辐照度），已证实单独的光照对 HepG2 细胞活力无影响，而对介由玫瑰红（RB）介导的光动力治疗（PDT）则达到了非常高的效率。对于需要更高辐照度以确保疗效的 PDT 方案，可采用多个 LED，从而集成多个光源部件，前提是注入每根光纤的光功率不超过数十毫瓦的允许限值。
<img alt="光强（mW/cm²）与孔数量的直方图；光强分布的数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig8.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图8"> 
图8： 表示照射到96孔板各孔的光强分布的直方图。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>
仅需将光源部分的LED替换为另一个合适的LED，即可获得另一种CELL-LED装置。若某LED在可见光范围内（根据光纤束的规格）发射的光功率低于5 W（原因如上所述），则可视为合适。由于此类LED种类繁多，因此可开发出多种多样的CELL-LED装置，进而能够评估多种光动力疗法（PDT）方案 体外在给定的光动力疗法（PDT）方案中，应优先选择与所用光敏剂吸收光谱重叠度最佳的LED。若更换LED，需特别关注风扇散热器组件的设计。事实上，该组件必须具备适当的尺寸，以防止LED和驱动器因过热而导致性能下降或损坏。此外，每次更换LED后，均需重新进行光学和热学表征。
与现有设备相比，该装置具有显著优势：只需简单更换一个LED即可实现对大多数光敏剂的光激活，并且能够在培养箱内对细胞进行照射。

2020年，原发性肝癌新增病例超过90.5万例，死亡病例达83万例，是全球第七大常见癌症，也是癌症相关死亡的第二大原因1。在原发性肝癌中，肝细胞癌（HCC）最为常见，约占所有病例的90%2。由于慢性肝病常未被发现且患者对监测的依从性较差，仅有25%的HCC患者能在疾病早期被诊断出来3。这些早期诊断的患者通常接受肝切除术、肝移植或局部消融治疗，以实现根治目的，预后良好，五年生存率超过70%4,5。而对于其余75%的患者（即中期或晚期诊断的HCC患者），尽管靶向治疗、免疫治疗及联合治疗等新型治疗手段带来了生存获益6，其预后仍然很差：该组患者的五年生存率实际上不超过30%，而转移性患者的亚组五年生存率更是降至2%6。因此，探索替代性治疗方案对于改善中晚期HCC患者的治疗效果和延长生存期至关重要。光动力疗法（Photodynamic Therapy, PDT）是一种在皮肤科广泛应用的抗癌疗法7，可能成为一种合适的替代选择。
光动力疗法（PDT）是一种光化学治疗方法，结合使用光敏剂（PS）、适当波长的可见光和分子氧，以产生活性氧（ROS）从而发挥细胞毒性作用8。PDT的抗肿瘤效应源于三种由ROS介导的机制9：首先是对恶性细胞的直接细胞毒性作用10，其次是损伤肿瘤血管系统，导致肿瘤组织缺氧、营养缺乏并发生退化11，最后是通过受损或凋亡的肿瘤细胞释放危险信号和肿瘤抗原，引发炎症反应12。三十多年来，研究人员已开展了大量研究，旨在评估PDT治疗多种类型和形态癌症的潜力13,14,15,16,17,18。基于这些研究已证实的疗效19,20,21，目前PDT已在皮肤科用于治疗非黑色素瘤皮肤癌7。对于其他适应证，近年来临床研究数量不断增加，表明人们正大力推动将PDT单独或联合标准疗法应用于临床实践22,23,24。
目前存在多种用于光动力疗法（PDT）的光敏剂25。其中，玫瑰红（Rose Bengal, RB）已被证明对喉癌肿瘤细胞26、黑色素瘤细胞27、乳腺癌细胞28以及前列腺癌组织29具有高效的光动力作用。本文所开展的研究基于评估RB介导的光动力疗法对肝细胞癌（HCC）细胞是否同样有效的需求。
此类评估确实需要首先开发一种基于绿色LED的装置，专门用于对96孔细胞培养板进行550&#160;nm波长的光照。该装置采用两部分设计30：光源部分通过单个LED产生550&#160;nm的绿光，而光分配部分则利用光纤束将该光线单独且远离LED地分配至96个孔中。这种两部分设计首先可防止细胞受到LED内部非受控热量产生的有害热效应影响，其次能够在将光源部分及其电子元件（包括LED）置于细胞培养箱外部的同时，对箱内细胞进行光照。这些创新特性使所谓的CELL-LED-550/3装置相较于已发表的、专为多孔板照明设计的其他LED系统具有显著优势31,32,33,34,35。
本文首先详细描述了CELL-LED-550/3设备。随后，作为概念验证，一项细胞活力研究展示了使用CELL-LED-550/3在二维肝细胞癌细胞培养模型（HepG2）中进行玫瑰红介导的光动力治疗（RB-mediated PDT）的有效性30。因此，CELL-LED-550/3设备不仅成本低廉且便于携带，而且也是开展玫瑰红介导光动力治疗实验的重要工具。

<table><tbody><tr><td>550&amp;nbsp;nm³&amp;nbsp;安装在印刷电路板上的白光发光二极管&amp;nbsp;</td><td>OSRAM</td><td>OSTAR KP CSLPM1.F1</td><td></td></tr><tr><td>75 cm² 细胞培养瓶</td><td>Sarstedt</td><td>3911002</td><td></td></tr><tr><td>100根塑料光纤（直径0.5 mm）套装</td><td>ARCENCIEL LED</td><td>fibre05egm</td><td>Glow End PMMA 0.5 直径 - 长度&amp;nbsp; 200 m&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prix-au-m.html</td></tr><tr><td>细胞计数仪</td><td>ThermoFisher</td><td>AMQAF2000</td><td>可选，您可以在显微镜下进行计数</td></tr><tr><td>细胞培养箱</td><td>PHCI（Dutscher）</td><td>MCO-170AICUVD-PE</td><td></td></tr><tr><td>Cell Titer Glo</td><td>Promega</td><td>G7571</td><td></td></tr><tr><td>透明PMMA准直透镜</td><td>Glecc 仓库</td><td>14毫米镜头 10&amp;deg;</td><td>Aliexpress - 带14 mm支架的DEL准直透镜</td></tr><tr><td>Colorfab Ngen 黑色</td><td>Colorfab</td><td>&amp;nbsp;SKU 020014</td><td>FDA食品接触合规性</td></tr><tr><td>Colorfab Ngen 白色</td><td>Colorfab</td><td>&amp;nbsp;SKU 020013</td><td>FDA食品接触合规性</td></tr><tr><td>具有三模式调光功能的恒流驱动器（CDM 驱动器）</td><td>CDM 驱动程序</td><td>BD39</td><td>2200 mA</td></tr><tr><td>环氧树脂&amp;nbsp;</td><td>Cl&amp;eacute;opatre</td><td>Crystal'Diamond</td><td>Cristal Diamond 150 mL</td></tr><tr><td>风扇散热器组件</td><td>BOYD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepG2 细胞</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>多功能酶标仪（CLARIOstar Plus）</td><td>BMG Labtech</td><td>430-2927</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>ThermoFisher</td><td>20012-068</td><td></td></tr><tr><td>PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯）光纤（数值孔径：0.2）</td><td>广州麦企照明有限公司</td><td></td><td></td></tr><tr><td>电源插孔</td><td>RSpro</td><td>907-5680</td><td></td></tr><tr><td>RMPI 1640</td><td>ThermoFisher</td><td>21875-091</td><td></td></tr><tr><td>摇杆开关&amp;nbsp;</td><td>RSpro</td><td>419-744</td><td></td></tr><tr><td>玫瑰红</td><td>赛默飞世尔 / 默克</td><td>A17053.14 / 330000-1G</td><td></td></tr><tr><td>防刮聚酯薄膜片</td><td>RSpro</td><td>RS：785-0802</td><td></td></tr><tr><td>鞘</td><td>AUPROTECT</td><td>&amp;Oslash; 8.5 mm / &amp;Oslash; 11 mm</td><td>聚丙烯（PP）&amp;egrave;非紫外线防护黑色波纹护套，未开裂</td></tr><tr><td>SVF</td><td>Eurobio</td><td>CVF SVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>描图纸</td><td>坎松</td><td>79368730</td><td></td></tr><tr><td>透明PMMA板</td><td>RSpro</td><td>RS：284-6269</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Ultimaker 2+</td><td>Ultimaker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>白色透明底96孔板</td><td>Dutscher</td><td>655098</td><td></td></tr></tbody></table>

开发一种基于led的创新照明装置 体外 应用玫瑰红光动力疗法

Development of an Innovative LED-based Illumination Device for In Vitro Application of Photodynamic Therapy with Rose Bengal

本文介绍了一种用于评估玫瑰红（Rose Bengal, RB）介导的光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）疗效的新型光动力治疗（PDT）装置 体外该设备名为CELL-LED-550/3，由两个3D打印部件组成：一个部件通过单个LED产生550 nm的绿光（光源部分），另一个部件将该光分配至96孔细胞培养板（光分配部分）。光源部分由一个具有三种不同模式的驱动器控制，使光分配部分能够向各孔底部外表面提供三种不同的辐照度：0.02 mW/cm²2，0.23 mW/cm2，或 0.62 mW/cm2光照分布部分的设计可实现对各孔的单独且同步照明。为验证CELL-LED-550/3装置的应用价值，评估了其在Rose Bengal（RB）介导的光动力疗法（PDT）中诱导HepG2肝细胞癌细胞死亡的能力。首先，将HepG2细胞用不同浓度的Rose Bengal处理2小时，Rose Bengal是一种光敏剂，其最大吸收峰位于约550 nm处。处理后的细胞使用CELL-LED-550/3装置进行照射，设备设定为最大辐照度，光照剂量为0.3 J/cm²2，0.6 J/cm2，以及 1.2 J/cm2 （光照时间分别为8分钟4秒、16分钟8秒和32分钟16秒）。最后，在光动力治疗（PDT）后24小时使用Cell-Titer Glo检测细胞活力。实验结果表明，使用CELL-LED-550/3设备进行的玫瑰红（Rose Bengal）介导的光动力治疗能够以玫瑰红浓度和光照剂量依赖的方式诱导HepG2细胞活力下降。基于本文所展示的概念验证，CELL-LED-550/3设备为研究玫瑰红介导的光动力治疗提供了又一有效工具。

如图3所示，CELL-LED-550/3设备能够从下方对96孔板提供550 nm绿光的均匀照射。
<img alt="用于光学研究的绿色LED阵列光激发装置；激发发射分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3： CELL-LED-550/3设备在照亮96孔板时的示意图，分别显示房间灯光开启（A）和关闭（B）的情况。改编自 Lefebvre, A. 等人30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
通过使用一束光纤（图4），每个孔均被单独照亮，并远离单个LED（最远可达两米）。
<img alt="绿色LED阵列、光纤装置、光激发、光谱实验、照明分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4： 光纤束可在远离单个LED的位置实现对96孔板各孔的独立照明。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本</a>
为评估 CELL-LED-550/3 设备的有效性，检测了其在 HepG2 肝癌细胞系中诱导玫瑰红介导的光动力治疗（PDT）的能力。细胞经不同浓度的玫瑰红处理 2 小时，浓度范围为 0–100 µM，随后进行光照。采用该浓度梯度旨在确定在绿光照射下可杀死 HepG2 细胞的玫瑰红有效剂量（EC50）。同时研究了 CELL-LED-550/3 设备所施加的光剂量对 HepG2 细胞死亡诱导的影响。为此，细胞在 0.62 mW/cm2 的光强下分别接受 8 分 9 秒、16 分 18 秒或 32 分 36 秒的光照，以获得分别为 0.30 J/cm2、0.60 J/cm2 和 1.22 J/cm2 的光剂量。
首先观察到，在无玫瑰红（Rose Bengal）存在的情况下，仅光照（光照条件，图5）对HepG2细胞的活力无任何影响，无论细胞接受的光剂量如何。同时观察到，在无光照条件下仅使用玫瑰红（RB条件，图5）时，无论测试条件如何，均未引起细胞活力的改变。相比之下，实验结果表明，使用CELL-LED-550/3进行的玫瑰红介导的光动力疗法（PDT）能够有效杀伤HepG2细胞。此外，随着光剂量的增加，杀伤效果增强，当光剂量为0.30 J/cm2时，最大有效浓度（EC50）为34.3 µM；光剂量为0.60 J/cm2时，EC50为26.6 µM；光剂量为1.2 J/cm2时，EC50为6.8 µM。
这些结果证实了该新型PDT设备在介导RB的PDT中的有效性（图5）。
<img alt="柱状图，光动力疗法（PDT）结果，细胞存活率与光剂量、RB浓度的关系。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68462/68462fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图5"> 
图5： 该装置对 HepG2 细胞系存活率的影响效果。HepG2 细胞经处理后 24 小时的存活率百分比。NT，未处理组；RB，仅光敏剂处理（0 µM、5 µM、10 µM、25 µM、50 µM、75 µM 和 100 µM）；light，光照剂量为 0.30 J/cm2、0.60 J/cm2， 和 1.22 J/cm2；PDT，光敏剂 RB 处理联合光照。结果以三次独立实验的均值 ± 标准误（SEM）表示，并以 NT 组为基准换算为百分比。采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行统计检验，其中 p ≤ 0.01（**）；p ≤ 0.0001（****）被认为具有统计学显著性，p ≥ 0.05 视为无显著性差异（NS）。改编自 Lefebvre, A. 等人30。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68462/68462fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>

本文介绍了一种用于研究玫瑰红介导的光动力疗法的新型创新3D打印照明装置 体外.

开发一种基于LED的创新照明装置 体外 应用玫瑰红光动力疗法

本文介绍了一种用于体外评估玫瑰红（Rose Bengal, RB）介导的光动力疗法（photodynamic therapy, PDT）效果的新型PDT装置。该装置称为……

我们的研究旨在开发基础性和转化性项目，以表征光动力疗法在治疗缺乏有效治疗手段的癌症中的作用。目前的实验挑战在于开发必要的技术，以推动光动力疗法从体外实验向临床应用转化，包括新型光敏剂和新型光照装置的研发。与其他技术相比，我们的实验方案采用一种低成本且自制的装置，能够更充分地照射96孔板，并维持细胞培养孵育箱内的生理条件。首先，将培养的 HepG2 细胞从培养箱中取出，置于已预清洁的微生物安全操作台内。使用移液器将培养瓶中的培养基移除。为去除残留培养基，用磷酸盐缓冲液轻轻混洗，然后小心吸去缓冲液。然后，向细胞中加入含有0.25%胰蛋白酶和0.53毫摩尔/升EDTA的3毫升胰蛋白酶溶液，将培养物放回37摄氏度的培养箱中孵育5分钟，以使细胞脱落。5分钟后，向培养瓶中加入7毫升培养基以中和胰蛋白酶并重悬细胞。接着，将胰蛋白酶、培养基以及脱落的细胞转移至15毫升离心管中。为了计数细胞，将20微升细胞悬液移入一支洁净的离心管中，加入20微升台盼蓝溶液。混匀后，将染色后的混合液加载到计数板上，并将其插入细胞计数仪中。接着，向离心管中加入培养基，然后加入细胞，使其最终浓度达到每毫升150,000个细胞。每孔接种1.5 × 10⁴个细胞至白色96孔板中，孔板底部需透明且平整。每次检测细胞活力时，需准备两块96孔板。接种后，将96孔板置于培养箱中孵育24小时，以使细胞充分贴壁。配制玫瑰红B储备液时，将其溶解于10%生理盐水中。用细胞培养基将玫瑰红B处理液稀释至浓度范围为0至100 µM。随后，从细胞培养板中移除培养基，并向每孔加入100 µL已配制好的玫瑰红B处理液。将细胞与玫瑰红B共同孵育2小时，以使其内化。2小时后，从每个孔中移除玫瑰红B溶液，用PBS洗涤细胞两次，吸去PBS，并向每孔中加入100 µL不含玫瑰红B的培养基。用铝箔包裹微孔板以避光，将其中一半的微孔板留置备用，用于光动力治疗实验中的光照处理。将光分配器上的公头连接器连接到光源的母头连接器。从培养箱中取出光动力治疗和避光条件的微孔板。拆开光动力治疗板的包装。然后，将LED驱动器的调光器调至最大级别，使96个孔的平均辐照度达到0.62毫瓦每平方厘米。接着，将微孔板放置在光分布器上，照射微孔板直至细胞获得预期的光剂量。当达到所需光剂量后，关闭设备。将光动力治疗微孔板重新用铝箔包裹，并与对照板一同放回培养箱，直至进行活力检测。完成光动力治疗实验后，将照射后的微孔板置于培养箱中孵育24小时，以允许细胞产生治疗后的应答反应。孵育结束后，取出一个经光照和一个未经光照的培养板。向每个孔中加入100 µL细胞活力检测试剂盒中的试剂，以检测线粒体代谢和ATP生成。将培养板在避光条件下孵育10分钟，随后进行发光检测。孵育10分钟后，使用多功能酶标仪读取每孔的发光值。将未处理对照孔的发光值视为100%活力。将处理孔的发光值相对于该对照进行归一化，以计算每种处理条件下的细胞活力百分比。在其他处理后时间点（如 24 小时、48 小时和 72 小时）重复相同的细胞活力检测方案。单独光照（无玫瑰红）在所有测试的光剂量下均未改变 HepG2 细胞的活力，单独使用玫瑰红（无光照）在所有浓度下也未引起显著变化。使用 CELL-LED-550/3 进行的玫瑰红介导的光动力治疗在所有光剂量下均显著降低了 HepG2 细胞的活力，显示出强烈的细胞毒性作用。LED发射光谱与玫瑰红B的吸收光谱之间的重叠证实了CELL-LED-550/3设备与该光敏剂在光谱上的兼容性。未来，我们的主要目标之一是开发新型光动力治疗（PDT）套装，每套均包含能够特异性靶向癌细胞的光敏化合物以及配套的照射装置。

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开发一种创新的基于 LED 的照明装置，用于 Rose Bengal 光动力疗法的 体外 应用

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