Name: Ookluc：用于鉴定传递阻断化合物的 伯氏疟 原虫系 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 了解利用发光转基因伯氏疟原虫系进行高通量筛选的方法，用于鉴定阻断疟疾传播的化合物并精确测定IC50值。该方法为寄生虫学研究提供了标准化检测手段。

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本项目得到了圣保罗研究基金会（FAPESP 2021/06769-0）和Serrapilheira研究所（资助号 G-1709-16618）的资助。

所有动物实验均严格遵循伦理准则，并经圣保罗大学生物医学科学研究所动物使用伦理委员会（CEUA-ICB/USP）批准。动物的饲养和管理均符合该委员会制定的标准。涉及基因修饰的实验 疟原虫 寄生虫，以及它们在 -80 °C，均符合圣保罗大学生物医学科学研究所机构生物安全委员会（CIBio-ICB/USP）制定的规定。本研究共使用三只3至5周龄的雌性BALB/c小鼠，其中两只为感染组，一只为未感染组。
1. 材料与试剂
<ol>
	<li>通过在 RPMI 1640 培养基中添加 0.025 M HEPES、青霉素-链霉素-新霉素（PSN）、50 mg/L 次黄嘌呤和 100 µM 黄尿酸，配制动合子培养基。将 pH 调整至 8.38,16。</li>
	<li>将荧光素酶检测试剂盒中提供的裂解缓冲液与底物按 50:1 的体积比混合，配制发光检测的工作溶液。</li>
	<li>将培养箱温度设定为 21 °C。</li>
</ol>
2. 感染与寄生血液采集
<ol>
	<li>在第0天，通过腹腔注射（IP）方式，用150 µL冻存的Ookluc菌株感染两只雌性BALB/c小鼠（4-6周龄）。 
	注意：本方案推荐使用BALB/c小鼠，因其在动物实验设施中易于获得且广泛应用。然而，任何对P. berghei感染敏感并能支持配子体形成的野生型小鼠品系均适用于本实验。</li>
	<li>从第3天开始，通过显微镜检查吉姆萨染色的血涂片，评估寄生虫血症和配子体血症水平。</li>
	<li>当寄生虫血症和配子体血症分别达到约5%和0.5%时（通常在第4天），使用肝素化注射器经心脏穿刺采集血液，并将两只感染小鼠的血液混合。 
	注意：尽管这是P. berghei的一个转基因株系，其生长特性和配子体形成水平与ANKA株系相似。在此背景下，配子体占总寄生虫的比例大约低10倍。 
	注意：理想情况下，化合物板（见下文）应在采集寄生虫血前准备好，以便血液采集后立即移入板中。若小鼠血液需在不同房间采集，或因其他原因无法立即加入化合物板，则采集的血液必须在37 °C下保存，且保存时间不得超过30分钟。</li>
</ol>
3. 转化实验——在96孔板中进行筛选
注意：为确保结果的一致性，整个实验应在不同日期重复三次，以验证研究结果。
<ol>
	<li>使用配子体培养基作为稀释液制备化合物样品（终浓度为 10 µM）。将化合物储备液稀释至 1 mM，并通过将 1 mM 储备液以 1:100（v:v）的比例加入配子体培养基中制备工作液。进行一次重复实验时，每种工作液的终体积为 200 µL。</li>
	<li>若化合物使用非水溶剂稀释，则需设置对照样品，其中溶剂在配子体培养基中的稀释比例与测试样品相同，以确保观察到的抑制作用归因于化合物本身而非溶剂。 
	注：例如，我们将筛选 90 种化合物。</li>
	<li>使用两块 96 孔板，按照以下方式并在 图 1 中所示，每孔加入 80 µL 样品，设置重复（两块板）：阳性对照：80 µL 配子体培养基；阴性对照：80 µL 配子体培养基；溶剂对照：含 1% DMSO 的 80 µL 配子体培养基；样品：每种化合物在配子体培养基中浓度为 10 µM 的溶液 80 µL。</li>
</ol>
<img alt="周期表座位图；带有标记列 A-H 和编号行 1-12 的示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 1"> 
图 1：用于化合物筛选的 96 孔板布局示意图。 该板布局包括阳性对照（C+）、阴性对照（C-）、对照加稀释溶剂（C+S）以及 90 个待测化合物（S1-S90）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>除阴性对照（C-）外，向96孔板的每个孔中加入4 µL感染小鼠血液，按1:20（v:v）的比例添加。用移液器轻轻吹打混匀。 
	注意：考虑到损耗，我们计算每块板大约需要400 µL感染血液。</li>
	<li>对于阴性对照，加入未感染的小鼠血液，按1:20（v:v，血液:样本）的比例添加。轻轻吹打混匀。</li>
	<li>在21 °C下孵育6小时或24小时。 
	注意：nLuc活性在孵育6小时后即可检测到，并在24小时达到峰值8。该检测方法无法识别在合子形成后才起作用的化合物（例如抑制动合子形态发生的化合物），因为已形成的合子会积累nLuc，无论其是否完成形态发生过程。因此，6小时的孵育足以检测所有通过抑制配子发生、性重组或具有早期细胞毒性而阻断nLuc活性的化合物。然而，我们通常倾向于孵育24小时，以获得更强的信号和更高的信噪比。</li>
</ol>
4. 发光检测
<ol>
	<li>孵育结束后，通过上下吹打混匀样品，确保血液与培养基充分混合。</li>
	<li>使用前立即按1:50（v:v，底物:裂解缓冲液）的比例配制裂解缓冲液/荧光素酶底物混合液。</li>
	<li>将底物混合液与样品按1:1（v:v）的比例混合，轻柔混匀以避免产生气泡。在37 °C孵育3–5分钟。 
	注意：本示例中，每孔加入84 µL底物:裂解缓冲液混合液。</li>
	<li>将样品转移至96孔白色平底板中，使用酶标仪检测发光信号。检测参数设置如下：发射滤光片：镜头；每孔检测时间间隔：1 s。</li>
</ol>
5. 数据分析 - 筛选
<ol>
	<li>发光检测完成后，记录出现的原始数据（图2）。
	 
	注意：获得的相对光单位（RLU）取决于所使用的发光仪。在我们的实验中，阳性对照在24小时孵育检测中的RLU值范围为10,000至500,000。较短的孵育时间（6小时）将导致较低的RLU值。</li>
</ol>
<img alt="矩阵数据表；元素标记为 A-H × 1-12；数值结果；数据分析参考。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 2"> 
图 2：化合物筛选转化实验模拟读数结果。 该图像显示了在90种化合物存在下，卵囊动合子转化后进行实验所获得的模拟发光读数。相对光单位值越低，表明动合子形成减少。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<ol start="2">
	<li>使用电子表格，利用以下公式计算每次测量值的平均值。将 XX 替换为第一个测量值单元格的地址，将 YY 替换为第二个测量值单元格的地址。对所有样本重复此公式。 
	=(AVERAGE(XX:YY)</li>
	<li>将数据转换为抑制率（%），以便更好地分析结果。在电子表格中使用以下公式。将 A 替换为样本的 RLU 值，将 B 替换为对照组的 RLU 值。对所有测试化合物重复此公式： 
	= 1 - (A/B) x 100 
	注：数据将如 图3 所示呈现。</li>
</ol>
<img alt="静态平衡结果；数据表；数值分析；类别 A-H、1-12 的百分比和评分。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 3"> 
图 3：通过模拟读取化合物筛选转化实验所获得的结果，以每种化合物的抑制百分比表示。 每种测试化合物对转化的抑制百分比，按上述方法计算。高亮显示的方格表示对转化抑制率超过 95% 的化合物。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="4">
	<li>确定抑制率超过95%的化合物。 
	注意：这些化合物在10 µM浓度下对配子体阶段表现出高活性。在本示例中，我们发现了五种对配子体阶段具有高活性的化合物。</li>
	<li>针对上述鉴定出的化合物，按以下所述方法进行IC50测定。</li>
</ol>
6. 转化实验——确定 IC50
<ol>
	<li>按照第2节所述方法，用Ookluc感染小鼠并采集寄生虫血样。</li>
	<li>使用动合子培养基作为稀释液制备样品。初始浓度应选择能够观察到化合物对转化率达到100%抑制的浓度。 
	注意：由于活性化合物是在10 µM浓度筛选中鉴定出来的，因此我们首次剂量-反应曲线实验采用20 µM作为初始浓度。为了获得准确的剂量-反应曲线，实验设计中必须包含能引起100%转化抑制的初始浓度，以及导致0%抑制的终末浓度。这种方法可确保精确计算IC50值。首次剂量-反应曲线将确定实现约100%抑制所需的最低化合物浓度。在本方案中，将以近期利用Ookluc13鉴定出的PyAz90为例进行说明。</li>
	<li>在96孔板中，每组设置三个重复（见图4）：阳性对照（C+）：加入80 µL动合子培养基；阴性对照（C-）：加入80 µL动合子培养基；样品第一稀释度（Cpd D1）：加入160 µL以动合子培养基配制、可实现100%转化抑制的初始浓度的化合物溶液；D2至D12孔：每孔加入80 µL动合子培养基。</li>
	<li>通过移液器将D1孔中的80 µL液体转移至D2孔，混匀后，再从D2孔取80 µL转移至D3孔，依此类推进行两倍系列稀释。确保所有孔的总体积为80 µL，因此需弃去从D12孔移出的最后80 µL液体。 
	注意：所有样品均应至少设置三个重复，具体参见图4。为确保结果的可靠性和可重复性，整个实验应在三个不同的实验日重复进行，每次均使用新感染的动物。 
	注意：若在初次筛选中结果显示溶剂对转化过程无影响，则在系列稀释中无需包含溶剂对照；否则，也必须对溶剂进行系列稀释并设相应对照。</li>
</ol>
<img alt="色谱网格布局、化合物分布图、A-H列中的化合物定性标记。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图4"> 
图4：用于化合物IC50测定的96孔板布局。该板布局包含阳性对照（C+）、阴性对照（C-）以及化合物（Cpd）的稀释梯度（D1至D12）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="5">
	<li>以1:20（体积比）将感染小鼠血液加入96孔板中。通过移液轻轻混匀。 
	注意：除阴性对照（C-）外，每个孔中将加入总共4 µL感染血液。考虑到操作损失，每种待测化合物约需准备200 µL感染血液。</li>
	<li>在阴性对照孔中，按1:20的比例（体积比，血液:样品）加入未感染小鼠血液。轻轻混匀。</li>
	<li>在21 °C下孵育6小时或24小时。</li>
	<li>按照第4节所述方法进行发光检测。</li>
</ol>
7. 数据分析 - IC50 测定
注意：IC50 定义为抑制50%生物活性/抑制作用所需的化合物浓度。在此实验中，抑制是指动合子转化率的降低。数据以S形剂量-反应曲线表示，其中X轴表示化合物浓度（经对数转换），Y轴表示抑制百分比。
<ol>
	<li>按照第5节第5.3步所述计算抑制率（%）。</li>
	<li>打开软件并创建一个XY表格。</li>
	<li>将Y轴选项设置为在并列的子列中输入3个重复值。</li>
	<li>粘贴数据，其中X表示化合物浓度，Y表示抑制率（%）（图5A）。</li>
	<li>在菜单栏中，点击分析，选择非线性回归（曲线拟合），然后选择剂量-反应曲线 - 抑制和[抑制剂] 对 标准化反应 — 可变斜率；点击确定。</li>
	<li>在左侧面板中观察数据的剂量-反应曲线。可根据需要进行个性化设置，例如更改颜色和数据点格式。</li>
	<li>查找非线性拟合表格，以获取计算得到的IC50值及其95%置信区间（95% CI）（图5B）。</li>
</ol>
<img alt="IC₅₀ 测定；剂量-反应数据表和曲线；药物抑制分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68466/68466fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：PyAz90 的剂量-反应曲线。 抑制率（%）随 PyAz90 浓度（µM）的变化关系以对数刻度表示。S 形曲线为拟合数据，用于确定 IC50，其值为 0.013 µM（95% 置信区间：0.012–0.014 µM）。数据点表示实验重复组的平均值 ± 平均值的标准误差。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68466/68466fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024">https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024</a> (2025).</li>
<li>Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+biology+and+disease+pathogenesis%3A+insights+for+new+treatments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments.</a> Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).</li>
<li>Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria+Vaccines%3A+From+the+Past+towards+the+mRNA+Vaccine+Era%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccines%22%5BJournal%5D)">Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era.</a> Vaccines. 11 (9), 1452(2023).</li>
<li>Ménard, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+under+the+skin%3A+the+first+steps+in+malarial+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity.</a> Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).</li>
<li>Appetecchia, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission-blocking+strategies+for+malaria+eradication%3A+Recent+advances+in+small-molecule+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development.</a> Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).</li>
<li>Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+Plasmodium+falciparum+growth+assay+for+malaria+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).</li>
<li>Delves, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activities+of+current+antimalarial+drugs+on+the+life+cycle+stages+of+Plasmodium%3A+A+comparative+study+with+human+and+rodent+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites.</a> PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+the+pathogen+box+for+molecules+active+against+Plasmodium+sexual+stages+using+a+new+nanoluciferase-based+transgenic+line+of+P.+berghei+identifies+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+transmission-blocking+antimalarials+identified+by+high-throughput+screening+of+Plasmodium+berghei+Ookluc%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc.</a> Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).</li>
<li>Lima, M. N. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+multi-kinase+approach+for+the+identification+of+potent+antiplasmodial+hits%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Chem%22%5BJournal%5D)">Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits.</a> Front Chem. 7, 773(2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+chemogenomics+drug+repositioning+strategy+enables+the+discovery+of+epirubicin+as+a+new+repurposed+hit+for+Plasmodium+falciparum%C3%82%C2%A0and%C3%82%C2%A0P.+vivax%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparumÂ andÂ P. vivax.</a> Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).</li>
<li>Krishnan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torin+2+derivative%2C+NCATS-SM3710%2C+has+potent+multistage+antimalarial+activity+through+inhibition+of+P.+falciparum+phosphatidylinositol+4-kinase+%28Pf+ACS+Pharmacol%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol).</a> Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).</li>
<li>Calit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrimidine+azepine+targets+the+Plasmodium+bc1+complex+and+displays+multistage+antimalarial+activity%5BTitle%5D)+AND+%22JACS+Au%22%5BJournal%5D)">Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity.</a> JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).</li>
<li>Lima, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcones+as+a+basis+for+computer-aided+drug+design%3A+Innovative+approaches+to+tackle+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria.</a> Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).</li>
<li>Ferreira, L. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+4-aminoquinoline+chemotype+with+multistage+antimalarial+activity+and+lack+of+cross-resistance+with+PfCRT+and+PfMDR1+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants.</a> PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).</li>
<li>Blagborough, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+transmission+blockade+in+Plasmodium+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessing transmission blockade in Plasmodium spp.</a> Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).</li>
<li>Azevedo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+method+for+in+vitro+screening+of+Plasmodium+transmission-blocking+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).</li>
<li>Gaitán, X. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+merozoite+thrombospondin+related+anonymous+protein+%28MTRAP%29+of+Plasmodium+berghei+as+a+transmission-blocking+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

目前用于开发新型结核病化合物的大多数高通量筛选方法主要集中于抑制配子体形成或具有杀配子体活性。迄今为止，仅有两种P. berghei模型被建立，可用于评估配子体功能、配子发生、合子形成以及动合子形态发生5。
其中一种模型与Ookluc类似，均利用与ctrp启动子相连的荧光报告基因17。然而，Ookluc引入了若干关键改进，例如采用灵敏度更高的报告基因nLuc，并且不携带整合的药物抗性标记。在第一种模型中，报告基因插入后该抗性标记仍保留在寄生虫基因组中，而Ookluc的这一特性使其可用于进一步的遗传修饰，包括反向遗传学方法以鉴定新的结核病治疗靶点。
在本实验方案中，我们描述了使用Ookluc寄生虫在高通量模式下鉴定新型传播阻断（TB）化合物的方法。然而，在TB疫苗研究的背景下，也可采用类似的筛选策略。与将感染小鼠的血液与化学化合...

疟疾是一种古老的疾病，深刻影响了人类历史。仅在2023年，全球85个流行国家就报告了2.63亿例病例，导致59.7万人死亡1。该病由属于顶复门（Apicomplexa）的疟原虫属（Plasmodium）原虫寄生虫引起。在感染人类的五种疟原虫中——&#160;P. falciparum、P. vivax、P. knowlesi、P. ovale 和 P. malariae——&#160;P. falciparum 和 P. vivax 导致了大多数病例。P. falciparum 与重症疟疾相关，在非洲占主导地位，而 P. vivax 的地理分布最广，在南美洲和亚洲更为普遍2。
疟原虫的生活周期十分复杂，涉及在两个宿主之间经历多个发育阶段，这有助于其在流行地区的传播和持续存在3。该周期中的一个关键步骤是从人类宿主传播至蚊媒，因此成为干预措施的重要靶点。传播始于人体内，此时疟原虫的无性裂殖子分化为雌雄配子体，进入有性发育阶段。当蚊子吸血摄取这些配子体后，环境信号会触发配子体的活化并形成配子，进而在蚊子中肠腔内完成受精。受精形成的合子进一步分化为具有运动能力的动合子，动合子主动侵入中肠上皮细胞，并在基底膜内发育为卵囊。在卵囊内，会产生数千个子孢子，随后释放到血淋巴中，使其能够迁移至唾液腺。在唾液腺中，子孢子侵入腺泡细胞并进入腺腔，停留于此直至蚊子再次吸血，将寄生虫注入人类皮肤，完成传播过程4。
鉴于现有药物的局限性以及疟疾治疗药物耐药性的不断增加，寻找新的阻断传播（TB）策略至关重要5。传统的筛选方法——例如蚊虫感染实验、人工显微镜分析或放射性次黄嘌呤掺入法——耗时耗力，难以标准化，且不适用于高通量应用6,7。近年来采用基于荧光检测的方法（如DNA染色或GFP报告系统）提高了效率，但在评估靶向疟原虫有性阶段化合物方面仍存在重大挑战6,7,8。
为应对这些挑战，研究人员开发了一种表达纳米荧光素酶（nanoluciferase, nLuc）的转基因P. berghei品系，称为Ookluc8。在该系统中，nLuc基因受子孢子和TRAP相关蛋白（P. berghei Circumsporozoite- and TRAP-related protein, CTRP）启动子调控，该启动子在动合子中激活，导致nLuc在配子激活后约6小时开始表达，并在转化实验后24小时达到峰值8。该设计使得在受精后可立即通过基于发光信号的自动化方法定量检测寄生虫活力——无需直接操作传播媒介——并有助于对数千种化合物进行高通量筛选8。
尽管无论动合子存活能力如何都会发生nLuc表达，从而限制了对特异性影响后期阶段（如动合子形态发生）化合物的检测，Ookluc 仍能高效地用于鉴定靶向配子发生、有性重组或疟原虫在蚊体内存活（包括诱导活性氧产生的药物）的传播阻断（TB）化合物。先前的研究已通过成功鉴定已知抑制Plasmodium有性阶段的化合物验证了该系统9,10,11,12,13,14,15。因此，Ookluc 是一个强大且创新的平台，可用于对Plasmodium有性阶段进行高通量筛选，有助于发现新型传播阻断（TB）化合物，并推动未来几年内实现疟疾根除的目标8。本方案概述了Ookluc系统在药物筛选及半数抑制浓度（IC50）测定中的应用。

<table><tbody><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 版本 10.0.0 for Windows</td><td></td><td></td><td>GraphPad Software，美国马萨诸塞州波士顿</td></tr><tr><td>猪肠黏膜来源肝素钠盐</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>次黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>小鼠</td><td>---</td><td>---</td><td>3至5周龄雌性BALB/c小鼠</td></tr><tr><td>Nano-Glo 荧光素酶检测试剂盒</td><td>Promega</td><td>N1110</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 &amp;minus; 链霉素 &amp;minus; 新霉素溶液（稳定型）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4083</td><td></td></tr><tr><td>POLARStar Omega 微孔板读板仪&amp;nbsp;</td><td>BMG Labtech</td><td>----</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，含 GlutaMAX 补充物</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>61870036</td><td></td></tr><tr><td>黄尿酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td></td></tr></tbody></table>

ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的plasmodium berghei菌株

Ookluc: A Plasmodium berghei Line for Identifying Transmission-blocking Compounds

疟疾仍然是全球健康面临的重大挑战；2023年，全球报告了2.63亿例病例和59.7万例死亡。疟原虫的生活史十分复杂，需在关键发育阶段采取针对性干预措施，才能有效控制该疾病。阻断传播（TB）策略旨在通过疫苗和药物靶向蚊媒或疟原虫的有性阶段，从而阻断Plasmodium的传播。TB干预措施可针对人体宿主中的配子体，或蚊子中肠中的其他形态，如配子、合子、动合子和卵囊。
新结核病防治方法的开发面临重大挑战。研究该寄生虫的有性阶段本身具有较大难度，而针对配子体杀灭化合物的高通量筛选（HTS）主要依赖于 P. falciparum 培养物。然而，稳健的 体外 用于评估针对后期性阶段干预措施的工具仍然有限。为加速抗结核药物的发现，本研究团队开发了一种新型高通量筛选（HTS）检测方法，用于检测配子体活化与受精过程 P. berghei，一种小鼠模型 疟原虫 感染。该转基因寄生虫， 卵母细胞，仅在合子形成后表达纳米荧光素酶，并在动合子发育期间达到发光峰值。该基于发光的检测方法可定量读取配子到合子以及合子到动合子的分化过程，其中发光信号的增强与动合子的形成直接相关。本视频文章介绍了利用该系统筛选疟疾传播阻断化合物的方法 卵母细胞.

Ookluc 寄生虫的构建使得能够从现有检测方法所不具备的视角评估新的结核病药物候选物，特别是在评估化合物对配子活化、受精以及合子形成的影响方面8。图2 和 图3 展示了该方法以高通量方式对一系列化合物在寄生虫有性阶段进行筛选的能力，从而可在单次实验中快速识别出最具前景的候选化合物（图1）。将结果以百分比形式表示有助于数据可视化，并支持决策判断哪些化合物应进入后续研究阶段。利用 Ookluc 系统，已鉴定出五种抑制率超过&#62;95% 的化合物（图3）。对于这些选定的化合物，可进一步测定其 IC50 值，而 Ookluc 实验方案同样适用于该目的（图5）。

疟原虫的有性发育发生在蚊子的中肠内。靶向寄生虫的有性阶段是阻断传播的一种有前景的策略。我们开发了Ookluc，这是一种在合子形成后表达纳米荧光素酶的转基因P. berghei，可用于高通量筛选阻断传播的化合物。本文详细介绍了使用Ookluc进行筛选的方法。

Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

疟疾仍然是全球健康面临的重大挑战；2023年，全球报告了2.63亿例病例和59.7万例死亡。该寄生虫的生活周期是……

本研究旨在利用高通量系统鉴定并表征疟原虫有性阶段的传播阻断化合物及必需基因，以支持阻断疟疾传播的新型策略。该实验方案通过使用一种携带发光相报告基因的转基因伯氏疟原虫（P. berghei）品系，并结合受精后寄生虫发育的自动化检测技术，弥补了目前缺乏标准化、高通量传播阻断化合物筛选方法的不足。本方案可实现对疟原虫有性阶段的高效筛选，检测早期传播阻断化合物，并支持精确的IC50测定，相较于传统方法具有显著优势。首先，使用动合子培养基将化合物储备液稀释至一毫摩尔，制备化合物样品。将该一毫摩尔储备液按1比100的比例用动合子培养基稀释，得到终浓度为10微摩尔的工作样品。每次检测需制备终体积为200微升的工作样品，并设两个重复。如果化合物溶解于非水溶剂中，则通过将该溶剂以与测试样品相同的比例稀释于动合子培养基中，制备溶剂对照样品。使用两块96孔板，按照指定布局，将每种样品各80微升分别加入至阳性对照、阴性对照、溶剂对照以及测试样品的相应孔中，每个样品设两个复孔。除阴性对照孔外，向其余各孔加入4微升感染疟原虫的小鼠血液，稀释比例为1:20。通过上下吹打轻轻混匀。对于阴性对照，按1:20的比例向每个孔中加入未感染的小鼠血液，并通过吹打轻轻混匀。将培养板置于设定为21°C的培养箱中，在6小时或24小时条件下进行孵育。孵育后，通过上下吹打混匀各样本，以确保血液培养基充分混合。使用前立即按1:50的比例配制裂解缓冲液与荧光素酶底物混合液。将该裂解缓冲液-底物混合液与每个样本按1:1比例混合，轻柔混匀，避免产生气泡。将培养板在37摄氏度下孵育三至五分钟。随后，将样品转移至96孔白色平底板中，并使用酶标仪检测发光信号。发光检测完成后，记录酶标仪显示的原始发光数据。使用电子表格，根据给定公式计算每次测量值的平均值。将 XX 替换为第一个测量值单元格的地址，将 YY 替换为第二个测量值单元格的地址。对所有样本重复此公式。使用给定公式将数据转换为抑制率百分比，其中 A 为样品的相对光单位值，B 为对照组的相对光单位值。选择抑制率超过 95% 的化合物用于 50% 抑制浓度的测定。在用 Ookluc 感染小鼠并采集寄生虫血样后，以动合子培养基作为稀释液，制备在初始浓度下显示 100% 转化抑制的化合物样品。按照指定布局，将样品以每组三个重复的方式加入96孔板中。使用移液器进行两倍系列稀释：从D1孔移取80 µL至D2孔，充分混匀，然后从D2孔移取80 µL至D3孔，依此类推，直至D12孔。从D12孔中弃去最后的80 µL液体，以确保每孔中液体体积保持为80 µL。现在，以1比20的比例向每个孔中加入感染疟原虫的小鼠血液，并通过移液轻轻混匀。在阴性对照孔中，以1比20的比例加入未感染小鼠的血液，并轻轻混匀。将该培养板置于设定为21°C的培养箱中，在进行发光检测前孵育6小时或24小时。计算抑制率后，打开分析软件并创建一个用于绘图的XY表格。将y轴设置为并列的子列，以输入三个重复值。将数据粘贴到表格中，其中x表示化合物浓度，y表示抑制率。现在，点击“分析”。选择“非线性回归，曲线拟合”，然后选择“剂量-反应曲线，抑制”，接着选择“抑制剂 vs. 标准化反应值，可变斜率”，并点击“确定”。在左侧面板中查看剂量-反应曲线，并进行自定义设置，例如更改颜色或数据点格式。查找非线性拟合表格以获得计算出的IC50值及95%置信区间。嘧啶并氮杂环庚三烯化合物90表现出明显的浓度依赖性抑制作用，在0.125至1微摩尔浓度范围内观察到超过95%的抑制率，而在低于0.007微摩尔浓度时活性完全丧失，提示其抑制效应存在明显的阈值。根据嘧啶并氮杂环庚三烯化合物90的数据拟合的剂量-反应曲线得出IC50值为0.013微摩尔，表明其对靶标活性具有高抑制效力。

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Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

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