Ookluc：一种用于鉴定阻断传播化合物的Plasmodium berghei菌株

本研究旨在利用高通量系统鉴定并表征疟原虫有性阶段的传播阻断化合物及必需基因，以支持阻断疟疾传播的新型策略。该实验方案通过使用一种携带发光相报告基因的转基因伯氏疟原虫（P. berghei）品系，并结合受精后寄生虫发育的自动化检测技术，弥补了目前缺乏标准化、高通量传播阻断化合物筛选方法的不足。本方案可实现对疟原虫有性阶段的高效筛选，检测早期传播阻断化合物，并支持精确的IC50测定，相较于传统方法具有显著优势。

首先，使用动合子培养基将化合物储备液稀释至一毫摩尔，制备化合物样品。将该一毫摩尔储备液按1比100的比例用动合子培养基稀释，得到终浓度为10微摩尔的工作样品。每次检测需制备终体积为200微升的工作样品，并设两个重复。

如果化合物溶解于非水溶剂中，则通过将该溶剂以与测试样品相同的比例稀释于动合子培养基中，制备溶剂对照样品。使用两块96孔板，按照指定布局，将每种样品各80微升分别加入至阳性对照、阴性对照、溶剂对照以及测试样品的相应孔中，每个样品设两个复孔。除阴性对照孔外，向其余各孔加入4微升感染疟原虫的小鼠血液，稀释比例为1:20。

通过上下吹打轻轻混匀。对于阴性对照，按1:20的比例向每个孔中加入未感染的小鼠血液，并通过吹打轻轻混匀。将培养板置于设定为21°C的培养箱中，在6小时或24小时条件下进行孵育。

孵育后，通过上下吹打混匀各样本，以确保血液培养基充分混合。使用前立即按1:50的比例配制裂解缓冲液与荧光素酶底物混合液。将该裂解缓冲液-底物混合液与每个样本按1:1比例混合，轻柔混匀，避免产生气泡。

将培养板在37摄氏度下孵育三至五分钟。随后，将样品转移至96孔白色平底板中，并使用酶标仪检测发光信号。发光检测完成后，记录酶标仪显示的原始发光数据。

使用电子表格，根据给定公式计算每次测量值的平均值。将 XX 替换为第一个测量值单元格的地址，将 YY 替换为第二个测量值单元格的地址。对所有样本重复此公式。

使用给定公式将数据转换为抑制率百分比，其中 A 为样品的相对光单位值，B 为对照组的相对光单位值。选择抑制率超过 95% 的化合物用于 50% 抑制浓度的测定。在用 Ookluc 感染小鼠并采集寄生虫血样后，以动合子培养基作为稀释液，制备在初始浓度下显示 100% 转化抑制的化合物样品。

按照指定布局，将样品以每组三个重复的方式加入96孔板中。使用移液器进行两倍系列稀释：从D1孔移取80 µL至D2孔，充分混匀，然后从D2孔移取80 µL至D3孔，依此类推，直至D12孔。从D12孔中弃去最后的80 µL液体，以确保每孔中液体体积保持为80 µL。

现在，以1比20的比例向每个孔中加入感染疟原虫的小鼠血液，并通过移液轻轻混匀。在阴性对照孔中，以1比20的比例加入未感染小鼠的血液，并轻轻混匀。将该培养板置于设定为21°C的培养箱中，在进行发光检测前孵育6小时或24小时。

计算抑制率后，打开分析软件并创建一个用于绘图的XY表格。将y轴设置为并列的子列，以输入三个重复值。将数据粘贴到表格中，其中x表示化合物浓度，y表示抑制率。

现在，点击“分析”。选择“非线性回归，曲线拟合”，然后选择“剂量-反应曲线，抑制”，接着选择“抑制剂 vs. 标准化反应值，可变斜率”，并点击“确定”。在左侧面板中查看剂量-反应曲线，并进行自定义设置，例如更改颜色或数据点格式。

查找非线性拟合表格以获得计算出的IC50值及95%置信区间。嘧啶并氮杂环庚三烯化合物90表现出明显的浓度依赖性抑制作用，在0.125至1微摩尔浓度范围内观察到超过95%的抑制率，而在低于0.007微摩尔浓度时活性完全丧失，提示其抑制效应存在明显的阈值。根据嘧啶并氮杂环庚三烯化合物90的数据拟合的剂量-反应曲线得出IC50值为0.013微摩尔，表明其对靶标活性具有高抑制效力。