Name: 用于单核悬浮液的小鼠嗅觉上皮的快速解剖和解离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 42 s
Description: 学习快速解剖和解离小鼠嗅觉上皮以制备单核悬浮液的方法。该方案优先保证速度和操作简便性，适用于单核RNA测序研究，有助于深入理解嗅觉系统的遗传机制。

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作者谨此致谢贝勒医学院单细胞基因组学核心实验室。本项目得到了贝勒医学院细胞计数与细胞分选核心实验室的支持，资助来自美国国立卫生研究院（NIH）（P30 AI036211、P30 CA125123 和 SS10 RR024574），以及 Joel M. Sederstrom 提供的专业协助。本项目部分由美国国立卫生研究院/儿童健康与人类发育研究所（NIH/NICHD）[P50HD103555]、美国国立卫生研究院/神经疾病与中风研究所（NIH/NINDS）[5R01NS078294] 和美国国立卫生研究院/衰老研究所（NIH/NIA）[5F30AG076265] 资助。图3 使用 BioRender 制作。&#160;https://BioRender.com/5418352。

本研究中的所有动物实验均经贝勒医学院动物照护与使用委员会（IACUC）批准，并严格遵循其规定执行。实验使用雌性C57BL/6J（JAX:000664）小鼠。试剂与设备的详细信息列于下文 材料表.
1. 嗅觉上皮解剖
<ol>
	<li>使用任何首选方法对小鼠进行深度麻醉（遵循机构批准的方案）。通过用力捏压脚趾确认麻醉达到手术水平，随后进行至少10 mL冰冷的1×PBS经心脏灌注。去除皮肤以暴露颅骨（图2A）。 
	注意：将头部从身体上分离为可选步骤。若决定去除头部，建议在断头前先去除颅骨周围的皮肤及其他软组织。</li>
	<li>使用一对精细且尖端锋利的剪刀，在颧弓与鳞状骨交界处双侧进行剪切：将剪刀一端插入眼眶后部，另一端置于听道附近，沿图2B中绿色线条所示位置剪断颧弓。</li>
	<li>沿额骨最前缘从一侧眼眶至另一侧眼眶做一浅表切口。仅切开额骨背侧表面（深度约1–2 mm），注意避免损伤构成眼眶的任何深层结构或骨骼（图2B中蓝色线条）。 
	注意：为实现两眼眶之间的浅层切口，应将剪刀垂直于颅骨表面，并仅使用其尖端进行切割。</li>
	<li>从枕骨大孔沿颅骨中线切开，经过矢状缝和额间缝，直至与步骤1.3中在额骨上所做的眶间切口相连（图2B中红色线条）。</li>
	<li>将一对镊子插入沿颅骨中线所做切口中，牢固地将一侧颅盖向外侧牵拉。此操作将同时移除构成眼眶的骨骼（额骨、上颌骨和泪骨），从而暴露嗅甲的外侧部分（图2D）。 
	注意：自此步骤起，需格外小心，避免无意中损伤嗅上皮（OE）。</li>
	<li>用手握住鼻骨和门齿，用镊子将对侧颅盖折除。当骨片被撕离时，脑组织（包括嗅球）将随之被移除（图2E）。此步骤完成后，唯一可见的骨性结构应为颅底及围绕嗅上皮（OE）的骨骼（图2F）。</li>
	<li>使用骨剪或咬骨钳，去除残余的额骨和前上颌骨（切齿骨），直至门齿基底部（图2G）。</li>
	<li>使用骨剪沿额鼻缝剪切，使鼻骨与筛板分离，操作时需极度谨慎，避免损伤下方暴露的嗅上皮（OE）或导致筛板骨折。</li>
	<li>用镊子将鼻骨从筛板上轻轻抬起，以暴露嗅上皮（OE）（图2H）。若残余的前上颌骨遮挡背侧嗅上皮（OE），应在继续操作前将其清除（图2I中黑色圆圈所示）。</li>
	<li>使用尖头镊子轻轻夹住鼻中隔背侧与筛板连接处，向后方牵拉（图2J、K）。稍加牵引后，主嗅上皮将完整地整体分离（图2L）。</li>
	<li>立即进行嗅上皮（OE）的解离处理，或将组织速冻保存以备后续分析。</li>
</ol>
<img alt="鸟类头骨解剖过程，逐步解剖学研究，教学示意图。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig2.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图 2"> 
图 2：快速分离嗅上皮组织的技术。（A）去除周围软组织后的小鼠头部。（B）颅骨开窗切口的彩色编码指引。（C）完成颅骨开窗切口后的外观。（D）移除颅骨的一侧半球以及邻近嗅上皮组织的眼眶部分。（E）移除对侧颅骨部分及脑组织。（F）去除脑组织和颅骨后的头部。（G）沿额上颌缝切开后，移除最前部的额骨和后部的前上颌骨。（H）移除鼻骨。（I）黑色圆圈标示出可选择性去除的残余前上颌骨区域。（J）放置镊子以完整取出嗅上皮组织。（K）向后牵拉以释放嗅上皮组织。（L）嗅上皮组织完全游离。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
2. 嗅觉上皮解离与单细胞核分离
<ol>
	<li>每个样本准备一个C管和两个15 mL圆锥形离心管，并置于冰上。</li>
	<li>通过向预配制的核提取缓冲液中加入RNase抑制剂（终浓度为0.2 U/µL），制备裂解缓冲液。</li>
	<li>向每个15 mL圆锥形离心管中加入4 mL的1% BSA溶液，短暂涡旋混匀后弃去多余液体。此步骤可使BSA包被离心管内壁，以最大限度减少细胞核对管壁的黏附。</li>
	<li>对于一份完整的OE样本，向每个C管中加入2 mL预冷的裂解缓冲液。</li>
	<li>将OE样本加入C管中。使用#2镊子夹住样本，置于对应的C管上方，用精细剪刀将其剪成小块。</li>
	<li>将装有样本的C管倒置放置于自动组织解离仪的模块上。解离仪屏幕上对应模块的方格将从Free变为Selected。</li>
	<li>按下文件夹图标进入Miltenyi 文件夹。使用箭头键滚动至4C_nuclei_1 程序（解离仪中预载的程序）。按下OK 将程序应用至各模块，然后按下“开始”以启动运行。运行结束后立即从解离仪中取出C管。 
	注意：若条件允许，在解离过程中应始终保持C管处于冰上。运行结束后必须立即取出样本并继续后续操作，以避免细胞核过度裂解。</li>
	<li>使用移液器吸取C管中的匀浆液，经70 µm滤网过滤至第一个已包被BSA的圆锥形离心管中。注意避免吸取沉积在C管底部的骨碎片。</li>
	<li>用1 mL预冷的1×PBS冲洗滤网，确保完全过滤。</li>
	<li>将过滤后的悬液在4 °C下以500 × g离心5分钟（使用摆桶式离心机）。</li>
	<li>小心吸除并弃去上清液，注意不要扰动沉淀。用1 mL预冷的1×PBS轻轻吹打，彻底重悬细胞核沉淀。</li>
	<li>将重悬的细胞核悬液经30 µm滤网过滤至第二个已包被BSA的圆锥形离心管中。细胞核浓度可使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行定量。</li>
	<li>为保持样本完整性并防止降解，请立即进行后续选定的实验流程（无论是否进行FACS）（图3）。 
	​注意：强烈建议用户在正式实验前对本方案进行多次预实验，以确保操作流畅并按时完成。</li>
</ol>
<img alt="嗅觉上皮解离方案示意图；离心、过滤、PBS冲洗、测序设置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig3.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图3"> 
图3：嗅觉上皮解离与单核分离流程图。解剖后，通过机械和化学方法对嗅觉上皮进行解离。裂解物经70 µm滤网过滤，用1x PBS冲洗，并在500 × g 条件下离心5分钟。沉淀物用1x PBS重悬后，再经30 µm滤网过滤。所得的细胞核悬液可用于多种下游测序应用。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<ol><li>Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+I.+Morphological+aspects+of+differentiation+and+structural+organization+of+the+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons.</a> J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).</li>
<li>Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+and+neuron+regeneration+in+the+olfactory+system+of+mammals.+II.+Degeneration+and+reconstitution+of+the+olfactory+sensory+neurons+after+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurocytol%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. II. Degeneration and reconstitution of the olfactory sensory neurons after axotomy.</a> J Neurocytol. 8 (2), 197-213 (1979).</li>
<li>Caggiano, M., Kauer, J. S., Hunter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globose+basal+cells+are+neuronal+progenitors+in+the+olfactory+epithelium%3A+a+lineage+analysis+using+a+replication-incompetent+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Globose basal cells are neuronal progenitors in the olfactory epithelium: a lineage analysis using a replication-incompetent retrovirus.</a> Neuron. 13 (2), 339-352 (1994).</li>
<li>Iwai, N., Zhou, Z., Roop, D. R., Behringer, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+basal+cells+are+multipotent+progenitors+in+normal+and+injured+adult+olfactory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Horizontal basal cells are multipotent progenitors in normal and injured adult olfactory epithelium.</a> Stem Cells. 26 (5), 1298-1306 (2008).</li>
<li>Schwob, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cells+of+the+mammalian+olfactory+epithelium%3A+Taking+poietic+license%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cells of the mammalian olfactory epithelium: Taking poietic license.</a> J Comp Neurol. 525 (4), 1034-1054 (2017).</li>
<li>Fletcher, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deconstructing+olfactory+stem+cell+trajectories+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Deconstructing olfactory stem cell trajectories at single-cell resolution.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 817-830.e8 (2017).</li>
<li>Gadye, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injury+activates+transient+olfactory+stem+cell+states+with+diverse+lineage+capacities%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Injury activates transient olfactory stem cell states with diverse lineage capacities.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 775-790.e9 (2017).</li>
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<li>Brann, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-neuronal+expression+of+SARS-CoV-2+entry+genes+in+the+olfactory+system+suggests+mechanisms+underlying+COVID-19-associated+anosmia%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Non-neuronal expression of SARS-CoV-2 entry genes in the olfactory system suggests mechanisms underlying COVID-19-associated anosmia.</a> Sci Adv. 6 (31), eabc5801(2020).</li>
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<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+strategy+for+single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+confirms+accuracy+in+predicted+cell-type+expression+from+nuclear+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA.</a> Sci Rep. 7 (1), 6031(2017).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Ruiz Tejada Segura, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+transcriptomics+atlas+of+the+mouse+nose+sheds+light+on+the+anatomical+logic+of+smell%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A 3D transcriptomics atlas of the mouse nose sheds light on the anatomical logic of smell.</a> Cell Rep. 38 (12), 110547(2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+census+of+mammalian+olfactory+epithelium+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic census of mammalian olfactory epithelium aging.</a> Dev Cell. 59 (22), 3043-3058.e8 (2024).</li>
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<li>Gurumurthy, R. K., Kumar, N., Chumduri, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+isolation+of+high-quality+single+cells+from+the+female+mouse+reproductive+tract+tissues+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for isolation of high-quality single cells from the female mouse reproductive tract tissues for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100970(2021).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+RNA+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell RNA sequencing approaches.</a> Front Cell Dev Biol. 6, 108(2018).</li>
<li>Belfort, B. D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+AAV+serotypes+for+transduction+of+olfactory+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of AAV serotypes for transduction of olfactory sensory neurons.</a> Front Neurosci. 19, 1531122(2025).</li>
<li>Huang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immature+olfactory+sensory+neurons+provide+behaviourally+relevant+sensory+input+to+the+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Immature olfactory sensory neurons provide behaviourally relevant sensory input to the olfactory bulb.</a> Nat Commun. 13 (1), 6194(2022).</li>
<li>Barrios, A. W., Nunez, G., Sanchez Quinteiro, P., Salazar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy%2C+histochemistry%2C+and+immunohistochemistry+of+the+olfactory+subsystems+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Anatomy, histochemistry, and immunohistochemistry of the olfactory subsystems in mice.</a> Front Neuroanat. 8, 63(2014).</li>
<li>Antunes, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+nasal+septa+for+respiratory+epithelial+air-liquid+interface+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Murine nasal septa for respiratory epithelial air-liquid interface cultures.</a> Biotechniques. 43 (2), 195-204 (2007).</li>
<li>Wu, J., Cai, Y., Wu, X., Ying, Y., Tai, Y., He, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardiac+perfusion+of+the+mouse+for+brain+tissue+dissection+and+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation.</a> Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).</li>
<li>Bakulski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+the+gene+expression+effects+of+developmental+lead+%28Pb%29+exposure+on+the+mouse+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of the gene expression effects of developmental lead (Pb) exposure on the mouse hippocampus.</a> Toxicol Sci. 176 (2), 396-409 (2020).</li>
<li>Chang, C. -S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+uncovers+the+individual+alteration+of+intestinal+mucosal+immunocytes+in+Dusp6+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing uncovers the individual alteration of intestinal mucosal immunocytes in Dusp6 knockout mice.</a> iScience. 25 (2), 103738(2022).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biol. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+RNA-sequencing+profiling+of+mouse+lung.+Reduced+dissociation+bias+and+improved+rare+cell-type+detection+compared+with+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus RNA-sequencing profiling of mouse lung. Reduced dissociation bias and improved rare cell-type detection compared with single-cell RNA sequencing.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).</li>
<li>Xiong, A., Zhang, J., Chen, Y., Zhang, Y., Yang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+single-cell+transcriptomic+analyses+reveal+that+GPNMB-high+macrophages+promote+PN-MES+transition+and+impede+T+cell+activation+in+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22eBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Integrated single-cell transcriptomic analyses reveal that GPNMB-high macrophages promote PN-MES transition and impede T cell activation in GBM.</a> eBioMedicine. 83, 104239(2022).</li>
</ol>

作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。

本文所述方法可在心脏内灌注1× PBS后，稳定地完整取出嗅上皮组织。与先前方法相比，该方法在操作速度上有显著提升16，尤其重要的是，嗅觉神经元在轴突切断后即开始发生退化2，而轴突损伤在脑组织取出过程中不可避免。
仔细去除额骨、前上颌骨和鼻骨对于稳定获取完整的嗅上皮组织（OE）至关重要。此外，在使用镊子取出OE的最后步骤中，有时可能会有部分鼻中隔残留附着。由于鼻中隔含有大量呼吸上皮细胞22，建议将其与OE分离，以尽量减少后续分析中非嗅觉细胞类型的混入。此外，尽管本操作流程与组织匀浆方案一并呈现，但也可根据需要进行修改，用于多种免疫组织化学或成像应用：在初始使用1×PBS经心脏灌注后，再以10 mL含4%多聚甲醛（PFA）的1×PBS进行经心脏灌注固定，该固定方法已被广泛采用23。
与解剖方案类似，解离步骤经过优化以确保操作的一致性和高效性。...

小鼠嗅上皮（OE）是嗅觉系统的关键组成部分，负责检测气味信号并将其转导至中枢神经系统。其最表层含有嗅觉感觉神经元的气味感应纤毛，这些纤毛被一层黏液覆盖，并由支持性的足细胞和微绒毛细胞所包围1,2。嗅觉感觉神经元为双极神经元，其顶端延伸出纤毛，在黏液层内形成网状结构，而基底端则发出轴突，穿过骨性筛板，汇聚至嗅球内的肾小球结构。这些肾小球是嗅觉感觉神经元与下游神经元之间形成突触的部位。在嗅觉感觉神经元下方，存在称为球状基底细胞的神经前体细胞，它们能够持续补充因直接暴露于空气毒素、病原体和物理损伤等环境伤害而死亡的嗅觉感觉神经元3。球状基底细胞来源于位于最基底部、紧贴鼻甲骨性突起基底膜的一类多能储备细胞——水平基底细胞4,5。鼻甲结构迂曲复杂，使得嗅上皮难以完整分离和均质化处理。此外，嗅上皮被颅骨结构包围，导致该区域难以接近，传统上需要耗时较长的操作流程才能获取。
既往研究依赖于延长木瓜蛋白酶孵育时间以将嗅上皮从骨组织中释放出来6,7,8,9,10，这可能会进一步延迟单细胞悬液的后续处理。由于嗅觉感觉神经元（OSN）轴突的剪切会触发细胞凋亡11，因此必须尽量缩短从组织提取到cDNA文库构建的时间。此外，嗅上皮（OE）的结构及其向嗅球的投射使得完整细胞的提取变得复杂，从而影响单细胞RNA测序的成功率。幸运的是，单细胞核RNA测序（snRNA-seq）已成为一种强大的工具，可在保留细胞类型分布的同时对细胞进行分析，尤其适用于单细胞解离困难或不切实际的组织12,13。
尽管已有大量研究6,7,8,10,14,15对小鼠嗅上皮（OE）进行了单细胞测序，但均未提供一种针对该组织快速、稳定取材而优化的详细解剖方案。由于嗅上皮结构脆弱且被颅骨多个骨性结构包绕，获取组织时尤其需要高效而可靠的解剖方法。此外，现有的解剖指南16主要侧重于解剖结构的完整性，而非操作速度，可能导致解剖耗时较长。鉴于快速组织处理对于最大限度减少RNA降解、提高所获细胞核质量至关重要17,18，因此有必要建立一种优化的实验流程，以实现小鼠嗅上皮的快速解剖与匀浆，并制备适用于多种下游应用的单细胞核悬液。
本方案（图1）介绍了一种简化的操作方法，旨在克服上述挑战，实现小鼠嗅上皮（OE）的快速解剖以及组织的有效解离，以分离细胞核。该方法有助于高质量的单细胞核测序19，为研究嗅觉生物学的分子基础提供了一种可靠的技术手段。
<img alt="颅骨解剖缝示意图；骨区标注；鼻甲部分可视化。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68472/68472fig1.jpg" data-altupdatedat="1762509930000" data-alt="图1"> 
图1：C57BL/6小鼠颅骨相关骨缝和骨骼的解剖结构及嗅上皮的代表性横切面。（A）颅骨骨缝以不同颜色编码。颅骨一侧的骨缝以颜色标记，另一侧保持无标记以供参考（左图）。骨缝名称与对应颜色一致（右图）。（B）颅骨骨骼以不同颜色编码。颅骨一侧的骨骼以颜色标记，另一侧保持无标记以供参考（左图）。骨骼名称与对应颜色一致（右图）。（C）嗅上皮中央区域的横切面（使用本文所述方法解剖获得），一侧鼻甲以颜色编码，另一侧保持无标记以供参考（左图）。可视化的鼻甲名称（右图）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68472/68472fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>骨组织剪&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>16102-11</td><td></td></tr><tr><td>Bonn 微型虹膜剪&amp;nbsp;</td><td>Miltex&amp;nbsp;</td><td>18-1392</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 镊子&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>11231-30</td><td></td></tr><tr><td>雌性C57BL/6J小鼠</td><td>杰克逊实验室</td><td>JAX:000664</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS C 管&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>gentleMACS Octo 组织解离仪&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-427</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 30 μm&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers 70 μm&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-462</td><td></td></tr><tr><td>微型弗里德曼-皮尔逊咬骨钳</td><td>Fine Science Tools</td><td>16220-14</td><td></td></tr><tr><td>细胞核提取缓冲液&amp;nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-128-024</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS），1×，不含钙和镁，pH 7.4 &amp;plusmn; 0.1</td><td>康宁</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Protector RNase抑制剂&amp;nbsp;</td><td>默克生命科学</td><td>3335402001</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR 冷冻离心机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>50119927-5</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠嗅上皮组织快速解剖与解离以制备单细胞核悬液

Rapid Dissection and Dissociation of the Mouse Olfactory Epithelium for Single-Nucleus Suspensions

小鼠嗅上皮是嗅觉系统的起始入口，包含多种细胞类型，如嗅觉感觉神经元、具有再生能力的前体细胞以及支持细胞。嗅觉感觉神经元可将化学气味分子转化为神经信号，然而这些细胞如何发育与更新、如何与嗅球形成突触连接，以及如何调控其气味受体的机制，仍是当前深入研究的领域。嗅上皮位于鼻腔背侧，附着于称为鼻甲的复杂骨性结构上。这种解剖结构为其提取和解离带来了独特挑战，尤其是在制备具有活性的单细胞悬液时尤为困难。由于单细胞悬液制备流程通常涉及可能影响细胞活性和/或延迟文库构建的预处理步骤（例如木瓜蛋白酶解离、流式细胞分选），因此缩短组织提取时间至关重要。本文介绍了一种快速分离嗅上皮的简化方法，以及一种制备高质量单细胞核悬液的实验方案。

为了为解剖和分析提供解剖学背景，对C57BL/6小鼠颅骨的骨缝和骨骼以及嗅上皮（OE）的中央区域进行了可视化并以不同颜色标注（图1）。每张图像的一侧标注了相关的骨缝、骨骼和鼻甲结构，另一侧则保持无标记，以供对照参考。OE横切面的制备遵循既定的实验方案20，鼻甲的鉴定则基于先前的解剖学特征描述21。
尽管在细胞核分离后流式细胞术并非必需，但本文生成了成像流式细胞术的代表性数据，以展示本论文所述方法所获得细胞核的质量。图中显示了用于鉴定单个细胞核的设门策略（图 4A）以及高质量细胞核（低偏心率，高圆度）的数量（图4B）。大多数单事件为细胞核（53.69%），且所成像的细胞核大多质量较高（53.89%具有高圆度）。强烈建议用户练习本实验方案，并评估其分离细胞核样品的质量 通过 成像流式细胞术或血细胞...

本文提供了一种简化的小鼠嗅上皮解剖与解离方案，用于单核RNA测序。

小鼠嗅上皮是嗅觉系统的起始入口，包含多种细胞类型，如嗅觉感觉神经元、……

本文提供了一种旨在快速分离嗅上皮组织以进行单细胞或单细胞核测序的实验方案。本方案优先考虑操作速度与学习便捷性，适用于将组织均质化处理的单细胞测序应用，在此类应用中，快速解剖比保持解剖结构完整性更为重要，这与以往方法有所不同。本方案可实现对嗅上皮组织的快速、便捷解剖，旨在促进单细胞测序研究，并推动对嗅觉系统遗传基础的深入探索。首先，获取一只小鼠的去皮头部。使用一把精细的尖头剪刀，将剪刀的一侧尖端置于眼眶后部，另一侧紧邻听觉道，沿双侧颧弓与鳞状骨连接处进行剪切，以分离颧弓。随后，沿额骨最前缘从一侧眼眶至另一侧眼眶做一浅表切口，仅切开额骨背侧表面，深度约为1至2毫米。现在，从枕骨大孔沿颅骨中线切开，经过矢状缝和额缝，直至到达之前制作的眶间切口。将一对镊子插入中线切口，牢固地将颅盖的一侧半球向外侧牵拉。在固定住鼻骨和门齿的同时，用镊子将对侧颅盖折断移除。在撕开骨半球时，连同骨半球一起取出脑组织，包括嗅球。接着使用咬骨钳或骨剪去除残留的额骨和前上颌骨，直至门齿根部。用咬骨钳沿额鼻缝剪开，使鼻骨与筛板分离。然后使用镊子将鼻骨从筛板上抬起，以暴露嗅上皮。如果残留的前上颌骨阻碍背侧嗅上皮，应在继续操作前将其去除。现在，用一对尖头镊子轻轻夹住鼻中隔背侧与筛板连接处，向后牵拉。主嗅觉上皮将作为一个完全完整的结构分离出来。成像流式细胞术鉴定发现，所有事件中53.69%为细胞核。在单个细胞核中，53.89%具有高圆度。质控图显示四个样本的测序质量一致，基因和线粒体计数分布均匀。该数据集的标记基因与各细胞类型许多已确立的标记基因相符。

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科研

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用于单核悬浮液的小鼠嗅觉上皮的快速解剖和解离

笼锁化合物的光解能够产生快速且局部的多种生理活性化合物浓度升高。本文展示了如何获得膜片钳记录，并结合笼锁cAMP或笼锁Ca的光解，用于研究分离的小鼠嗅觉感觉神经元中的嗅觉转导过程。...

嗅觉感觉神经元纤毛中笼锁化合物的闪光光解

该视频展示了从转基因小鼠胚胎中分离动眼神经、滑车神经和脊髓运动神经元的过程。该胚胎的运动神经元表达绿色荧光蛋白（GFP）标记，便于观察和识别。在荧光显微镜下通过手术分离运动神经元，并将其维持在培养基中进行培养。...

从小鼠胚胎中分离与培养动眼神经、滑车神经及脊髓运动神经元

本视频展示了一种利用磁性分离法从小鼠幼鼠神经细胞悬液中分离原代少突胶质细胞的方法。该技术采用包被有针对少突胶质细胞抗原的特异性抗体的磁珠，从而实现这些细胞的选择性分离。...

使用免疫磁珠分离小鼠原代少突胶质细胞

本视频演示了使用穿孔膜片钳技术对小鼠嗅觉感觉神经元（OSNs）进行电生理记录的方法。从小鼠中分离出含有表达荧光标记气味受体的OSNs的嗅觉上皮组织，并将其固定在记录室中。将记录电极夹持在OSN的树突 knob...

小鼠嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录

嗅觉感觉神经元的纤毛中含有信号转导级联相关的蛋白质，但在冷冻切片中对其分布进行精细的空间分析较为困难。本文介绍了一种优化的全装片标记及纤毛蛋白的正面观（en...

小鼠主嗅觉系统中纤毛的全组织染色标记

分析嗅觉感觉神经元的生理特性仍面临技术上的局限。本文通过在基因靶向小鼠的完整嗅觉上皮组织制备中采用穿孔式膜片钳技术记录这些神经元的活动。该技术可用于表征表达特定嗅觉受体的神经元的膜特性及其对特异性配体的反应。...

完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞。本方案描述了一种从大鼠大脑皮层分离和培养其前体细胞——少突胶质前体细胞的方法，以及一种快速、可靠的定量评估少突胶质细胞生成的方法 体外...

大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

我们描述了原代小鼠少突胶质细胞的免疫磁珠分离方法，该方法可快速、特异性地分离出细胞用于 体外...

小鼠原代少突胶质细胞的快速特异性免疫磁珠分离

介绍了一种小鼠输卵管显微解剖方法，该方法可在保持RNA完整性的前提下分离并收集输卵管的各个节段。此外，还描述了一种非酶法的输卵管细胞解离步骤。这些方法适用于对功能不同的输卵管节段以及解离后的输卵管细胞进行后续的基因和蛋白质分析。...

小鼠输卵管的显微解剖与分离：各节段识别及单细胞获取

单细胞/单细胞核转录组学和多组学研究的成功在很大程度上取决于细胞/细胞核的质量。因此，从组织中分离细胞/细胞核并进行纯化的步骤必须高度标准化。本方案描述了为后续单细胞核多组学检测制备脑组织和骨髓细胞核的方法。...

高质量脑组织与骨髓细胞核制备用于单细胞核多组学分析

学习快速解剖和解离小鼠嗅觉上皮以制备单核悬浮液的方法。该方案优先保证速度和操作简便性，适用于单核RNA测序研究，有助于深入理解嗅觉系统的遗传机制。

小鼠嗅上皮组织快速解剖与解离以制备单细胞核悬液

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