Name: 使用磁粒子成像对移植的远端肺上皮祖细胞进行图像引导 体内 追踪治疗肺纤维化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T14:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: 了解磁粒子成像技术如何用于肺纤维化治疗中追踪移植的人远端肺上皮祖细胞。该方法通过SPION标记实现无创、实时监测细胞分布与滞留，为优化细胞疗法提供支持。

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本研究的部分资助来自授予 X.P.L. 的 R01HL153165-01A1 项目基金以及授予 P.W. 的 R21AI159928-01 项目基金。

所有涉及动物受试者的实验程序均已获得密歇根州立大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，涉及人类受试者的实验程序均已获得Corewell Health机构审查委员会（IRB）编号2017-198的批准。所有患者在参与研究前均签署了书面知情同意书。
从接受肺移植的特发性肺纤维化（IPF）患者中获取的人肺离体样本由Corewell Health提供。在移植手术前，所有患者均符合特发性肺纤维化（IPF）的诊断标准，表现为低氧血症、呼吸困难和肺容积减少43。对肺叶远端组织进行的病理学分析证实存在纤维化。
8周龄的雄性NOD/SCID小鼠购入后，先适应环境1周，然后饲养至12周龄再进行实验操作。
1. 人呼吸道上皮细胞的分离与扩增
<ol>
	<li>将取出的肺组织样本置于冰上，以在解剖过程中保持细胞完整性。辨认样本中存在的支气管或大气道；小气道位于肺组织样本的远端部分，距离大气道最远。使用灭菌器械切除肺组织样本的远端部分，并将其分割成较小片段，以利于组织消化。用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）冲洗样本，去除多余的血液和液体，随后将含有小气道的肺组织样本置于含有蛋白酶的缓冲液中进行消化 Streptomyces griseus，1×青霉素/链霉素，DNase I，以及1×庆大霉素加入50 mL离心管中。将组织置于37 °C水浴中振荡约4 h，或直至组织充分消化。</li>
	<li>将50 mL离心管中的内容物通过无菌的100 µm细胞滤筛。用DPBS冲洗组织3次。&#160;并通过滤网去除洗涤液。在400 × g条件下离心沉淀细胞。 g 5分钟，弃上清，用移液器将细胞重悬于1 mL培养基中，以500 µL移液器反复吹打50次。</li>
	<li>将细胞悬液加入75 cm²培养瓶中2 含有气道上皮细胞生长培养基的培养瓶。将细胞在37 °C、5% CO₂条件下培养。2 约2周。</li>
</ol>
2. 使用纳米颗粒（氧化铁示踪剂）标记气道上皮细胞
<ol>
	<li>当上皮细胞培养物达到80%融合时，用终浓度为250 µg/mL的氧化铁示踪剂标记细胞。每瓶上皮细胞培养物中加入适量体积的氧化铁示踪剂至10 mL培养基中，孵育48 h。 
	注意：评估了不同浓度的氧化铁示踪剂（50、100、200 和 250 µg/mL）用于细胞标记，随后进行其二维磁粒子成像扫描（图1A250 µg/mL 的浓度，以及每次移植 50,000 个细胞，最终确定为本研究的实验条件。</li>
	<li>48小时后，用DPBS洗涤细胞3次&#160;以去除多余的纳米颗粒。</li>
	<li>使用细胞解离试剂解离细胞，并在37 °C孵育15分钟，或直至细胞开始从培养瓶表面脱落。</li>
	<li>将细胞收集至含有1 mL胎牛血清的50 mL离心管中。用5 mL DPBS冲洗培养瓶3次，并将洗涤液加入含细胞的50 mL离心管中。</li>
	<li>通过400 × g离心沉淀细胞 g 5分钟。弃去上清液，用移液器将细胞重悬于1 mL培养基中，用设定为500 µL的移液器吹打细胞悬液50次。</li>
	<li>使用血细胞计数板确定细胞浓度，并确定所需细胞悬液的体积 体内 移植</li>
	<li>取100 µL细胞悬液，用4%多聚甲醛固定。</li>
</ol>
3. 体外 免疫染色与显微镜观察
<ol>
	<li>将100 µL细胞悬液加入含有载玻片和滤膜的细胞离心涂片机卡盒中，以1,000 rpm离心5分钟。</li>
	<li>使用疏水笔在载玻片上标记出细胞区域。</li>
	<li>用DPBS洗涤载玻片，每次15分钟，共洗2次。</li>
	<li>在室温下用含0.1% Triton X-100的DPBS孵育5分钟，对载玻片上的细胞进行通透处理。</li>
	<li>用DPBS洗涤细胞2次，每次2分钟。</li>
	<li>用含5%牛血清白蛋白（BSA）和1%山羊血清的DPBS封闭载玻片，孵育2小时。</li>
	<li>在4 °C下，用含2.5% BSA和0.5%山羊血清的DPBS稀释的一抗（抗葡聚糖抗体）孵育载玻片，过夜。</li>
	<li>移除一抗，用1× Tris-缓冲盐水-Tween 20（TBST）洗涤载玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>在室温避光条件下，用含2.5% BSA和0.5%山羊血清的DPBS以1:1,000比例稀释的二抗孵育载玻片1小时。</li>
	<li>用1× TBST洗涤载玻片3次，每次5分钟。</li>
	<li>向载玻片加入核染色试剂4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI），在DPBS中按1:1,000浓度稀释，室温孵育5分钟。</li>
	<li>用1× TBST洗涤载玻片2次，每次5分钟，并去除载玻片上多余的1× TBST。</li>
	<li>加入含DAPI的封片剂，并将盖玻片覆盖在载玻片上，注意避免产生气泡。</li>
	<li>待载玻片凝固后，用透明指甲油封固盖玻片边缘。</li>
	<li>在共聚焦显微镜下观察并成像。</li>
</ol>
4. 采用经气管灌注进行细胞移植
<ol>
	<li>准备
	<ol>
		<li>称量小鼠体重，以计算每只小鼠所需的博来霉素（bleomycin, BLM）剂量。</li>
		<li>在1.7 mL微量离心管中，用无菌生理盐水配制所需浓度的BLM&#160;溶液，体积不超过50 µL。 
		注意：药物浓度根据实验目的而定。本实验采用0.6 U/kg的BLM剂量。</li>
		<li>将BLM溶液吸入移液器中。此外，预先在注射器中吸入200 µL空气，以确保所有液体完全注入气管。 
		注意：在BLM处理72小时后，将以类似方式给予标记的细胞悬液。</li>
		<li>根据步骤2.6获得的细胞计数，计算含有50,000个细胞的细胞悬液体积，并确定给药体积。</li>
		<li>将小鼠放入连接麻醉机（提供2.5–3%异氟烷）的诱导箱中进行麻醉，直至小鼠失去意识。 
		注意：在整个实验过程中，小鼠需接受两次麻醉：（1）BLM给药当天；（2）BLM处理72小时后进行气管内细胞灌注当天。</li>
		<li>按照图2A所示设置光纤插管装置，使光纤探头穿过喉镜和导管。 
		注意：光纤的发光端应刚好位于导管管口外侧1–2 mm处。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>气管内灌注
	<ol>
		<li>通过轻捏任一后肢脚趾检查足底反射，确认麻醉效果。确认达到充分麻醉后，将小鼠仰卧位悬挂在倾斜的啮齿类动物插管架上（图2B-D）。</li>
		<li>使用钝头镊子小心夹住舌头，向上并向左移动，以充分暴露喉部结构。</li>
		<li>打开光纤探头，将其送入口腔以接近气管。使用喉镜的放大镜以更清晰地观察喉部，并定位气管开口处的声带。</li>
		<li>将导管插入气管开口，然后小心地分离并撤出喉镜。在导管上端滴加少量生理盐水（20 µL）。 
		注意：液滴水平会随小鼠呼吸节律上下移动，从而确认导管位于气管而非食管内。</li>
		<li>连接预先装有200 µL空气的注射器，推动液滴进入气管。随后将细胞悬液（≤50 µL）加入导管中，并如前所述使用充气注射器将其灌注进入气道。</li>
		<li>为防止灌注液体从气管溢出，保持导管原位5–7秒，然后轻柔地拔出导管。</li>
		<li>将小鼠保持在插管架上的相同体位至少30秒。</li>
		<li>取出小鼠并置于加热垫上的恢复笼中，持续监测直至完全从麻醉中恢复。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 磁性粒子成像
<ol>
	<li>将小鼠放入与异氟烷麻醉机（2-2.5%）相连的诱导箱中，使其麻醉直至完全失去意识。</li>
	<li>在磁粒子成像（MPI）扫描仪中设置小鼠床，并将麻醉气体管路通过适当接口从床下穿过。</li>
	<li>在小鼠麻醉过程中，准备MPI扫描仪以进行成像。启动配套软件，在项目中定义文件夹名称，并在检查名称中定义扫描名称以便识别；根据实验需求设置扫描参数。若遵循本操作流程，请使用以下参数：扫描类型：2D扫描；扫描模式：标准模式；发射通道：多通道（各向同性）；每投影平均次数：2。</li>
	<li>按照步骤4.2.1所述方法确认麻醉状态。将小鼠稳妥地放置于MPI扫描床上，如图2E所示。 
	注意：确保小鼠鼻部与床内置鼻罩正确对齐，以在扫描期间维持稳定的麻醉状态。 
	警告：扫描过程中麻醉不足可能导致小鼠在扫描运行时苏醒。</li>
	<li>将小鼠放入扫描仪后，将扫描床推入扫描孔内，然后点击开始扫描。</li>
	<li>扫描完成后，将小鼠从MPI扫描床上取出，并置于加热垫上的恢复笼中。持续监测直至其完全从麻醉中恢复。</li>
	<li>使用图像分析软件对图像进行分析。</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

气管内滴注是一种将物质直接递送至小鼠肺部的精确技术。该操作过程中多个关键步骤需格外注意。首先，应确保麻醉深度适当，以防止动物不适或移动，并将小鼠仰卧固定，颈部伸展，以使气道与气管开口对齐，便于清晰暴露。使用舌压板有助于保持气道开放。导管插入时应谨慎操作，滴注物质（如干细胞、药物、纳米颗粒）时应缓慢进行，以避免反流或误吸。滴注后，需确保小鼠完全恢复，并在放回笼子前密切监测其是否出现痛苦或呼吸系统并发症。在成像过程中，其他值得注意的步骤包括将小鼠在MPI扫描仪中正确放置，使其与成像区域对齐，并优化磁场强度和扫描模式等参数，以实现高分辨率追踪。
此外，在滴注操作与MPI成像之间，应让小鼠从麻醉状态完全恢复，以避免因长时间镇静导致的呼吸窘迫。对于MPI成像过程，干细胞的充分标记至关重要。应仔细优化纳米颗粒浓度，在维持强MPI信号的同时避免细胞毒性。在MPI图像采集过程中，应针对肺部成像优化扫描参数，如磁场强度、频率和梯度。此外，强烈建议将CT或MRI等其他成像模式与MPI结合使用，以提供MPI本身所缺乏的解剖学背景信息。与CT的共配准可实现MPI信号在肺组织复杂结构（尤其是纤维化区域）中的...

细胞治疗1,2具有再生潜力，可促进组织修复、减轻炎症，并改善白血病和淋巴瘤3,4（造血干细胞）、骨关节炎5,6（间充质干细胞）、1型糖尿病7（胰岛细胞移植）、脊髓损伤8,9、神经退行性疾病10,11,12（神经干细胞）以及肺纤维化13,14,15,16（肺祖细胞）等慢性疾病的治疗效果。尽管这些疗法展现出显著潜力，但仍面临免疫排斥和长期疗效等挑战17,18。肺纤维化（PF）是一种慢性进行性肺部疾病，其特征是肺组织出现过度瘢痕化，导致肺功能受损19。针对PF的细胞治疗旨在通过将间充质干细胞或远端肺祖细胞等再生细胞引入受损肺组织，以再生受损肺组织并减轻纤维化20。远端肺祖细胞包括基底细胞、II型肺泡细胞、支气管肺泡干细胞及其他多能祖细胞群体，具有促进组织修复、减轻炎症、潜在再生受损肺组织、逆转部分肺损伤并恢复正常肺功能的能力21。多项临床前及早期临床研究表明，将肺祖细胞移植至纤维化肺组织中，有助于再生肺泡结构、促进组织重塑并减轻炎症13,22,23。此外，这些细胞还能分泌多种生长因子和细胞因子，调节纤维化微环境，进一步促进修复。尽管在改善肺功能方面已取得令人鼓舞的结果，但在优化细胞递送方面仍存在挑战，包括高效分离、扩增这些细胞并将其整合至受损肺组织，确保长期安全性，以及预防不良副作用。仍需持续研究以优化治疗方案，并评估祖细胞治疗肺纤维化的长期安全性和有效性。
将细胞移植到肺部以治疗肺纤维化涉及多种技术，每种技术均旨在提高细胞递送效率、存活率以及与受损肺组织的整合能力。常用方法包括静脉注射24,25、支气管内递送26,27和经气管滴注28,29,30,31，每种方法均有其特定优势与挑战。干细胞的静脉给药受限于肺部归巢效率低下、在非靶器官中的滞留、输注后存活率有限以及免疫原性反应的风险。支气管内递送虽更具局部针对性，但仍受制于细胞分布不均、可能引起气道阻塞、诱发炎症反应，以及在纤维化肺组织结构中操作困难等问题。类似地，经气管滴注尽管可实现细胞直接沉积于肺部，但仍可能导致细胞分散不一致、远端肺组织渗透不足、局部刺激以及不同肺区剂量均匀性差异等问题。尽管这些技术均旨在提高移植细胞的存活率、整合能力及其在肺组织再生中的疗效，但最佳技术的选择取决于多种因素，如所移植细胞的类型、纤维化的发展阶段以及患者的整体健康状况。
尽管存在一些挑战，气管内灌注仍是将细胞直接递送至肺部最常用的方法之一，尤其在肺纤维化的研究中。该技术通过插入气管的导管将细胞导入肺内。32细胞随后被输送至肺泡腔，在此可能修复受损的肺组织。与其他递送方法（如 离体 肺灌注。由于细胞被直接递送至肺部，可提高其有效整合与修复的可能性。与静脉注射不同，气管内滴注可避免细胞进入全身循环，从而降低细胞在肝脏或脾脏等其他器官滞留的风险，使治疗效应更集中于肺部。尽管具有上述优势，该方法在细胞于肺内分布不均、滞留率低以及存活率不足等方面仍存在挑战，可能限制其治疗效果。目前相关研究正在持续优化该技术，以期获得更理想的临床疗效。研究人员可通过评估多个因素来判断气管内滴注是否适用于其具体应用，这些因素包括所递送细胞的类型、其在肺组织中存活与整合的能力，以及疾病模型的严重程度（如肺纤维化）。
成像技术是追踪细胞、评估其活力、分布及效应的不可或缺的工具，有助于加强细胞治疗的监测并优化治疗策略33。研究人员通过成像和递送后分析来评估递送效率，以追踪细胞的分布与滞留情况。已有多种技术被用于肺纤维化中标记干细胞的追踪，包括荧光成像、磁共振成像（MRI）、计算机断层扫描（CT）、正电子发射断层扫描（PET）、单光子发射计算机断层扫描（SPECT）以及超声成像。然而，这些技术存在若干局限性，例如荧光成像的穿透深度较低、MRI的灵敏度较差、CT、PET和SPECT涉及辐射暴露，以及超声成像分辨率较低34。尽管优化成像对比度、分辨率和生物相容性可在一定程度上克服上述挑战，但探索更新的成像技术对于实现肺部干细胞的精确追踪也至关重要。近年来，磁粒子成像（MPI）作为一种有前景的无辐射成像方式崭露头角，具有高灵敏度、实时定量成像能力，且成像对比度高、无背景干扰。
磁粒子成像（MPI）利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）实现直接可视化，其工作原理基于这些SPIONs在时变磁场作用下产生的非线性磁化响应35,36。通过电磁铁产生无场区（FFR），只有位于该区域内的颗粒表现出非线性磁化，并在交变磁场激发下产生信号；而位于FFR之外的颗粒则处于磁饱和状态，不参与信号生成。通过系统地在整个成像体积内移动FFR，MPI可构建纳米颗粒分布的空间图谱，进而生成图像。相较于传统成像方式，MPI具有多项优势37,38。与MRI或CT不同，MPI的信号仅来源于示踪剂，因此无背景噪声，对比度极高。它具备高时间分辨率的实时成像能力，非常适合用于追踪细胞迁移或灌注等动态过程。此外，MPI具有高度敏感性，可在无需电离辐射的情况下检测微量SPIONs，这一点优于PET或CT。同时，MPI还表现出优异的线性定量能力，可准确评估示踪剂浓度。总体而言，MPI结合了高灵敏度、安全性和精确定量的优势，成为生物医学成像中的有力工具。MPI在肺部干细胞追踪方面具有广阔前景，可实现对细胞迁移、滞留及治疗效应的精确监测。由于成像过程中无组织信号干扰，MPI能够实现标记干细胞的精确定位39,40,41,42。下文将介绍开展这些研究的具体实验方案，展示通过气管内滴注法将标记细胞递送至小鼠肺部，并利用MPI进行验证的方法。

<table><tbody><tr><td>1.7 mL 微量离心管</td><td>DOT Scientific</td><td>RN1700-GMT</td><td>用于细胞收集和制备 BLM 稀释液</td></tr><tr><td>抗葡聚糖抗体</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>60026</td><td>一抗</td></tr><tr><td>BD Luer-Lok&amp;nbsp;注射器</td><td>Becton, Dickinson</td><td>309628</td><td>气管内灌注过程中用于空气注射</td></tr><tr><td>Cytospin 3</td><td>Thermo Shandon</td><td>74010121GB</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Millipore-Sigma</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS -/-）&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A5670701</td><td></td></tr><tr><td>庆大霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗小鼠 IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Alexa Fluor&amp;trade; 568</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11004</td><td>二抗</td></tr><tr><td>山羊血清</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td>气体麻醉剂</td></tr><tr><td>异氟烷挥发器</td><td>SOMNI Scientific</td><td>VS6002</td><td>麻醉设备</td></tr><tr><td>Momentum</td><td>Magnetic Insight Inc</td><td></td><td>临床前磁性粒子成像（MPI）扫描仪</td></tr><tr><td>小鼠插管套件</td><td>OHAN</td><td>Ohan-201</td><td>包含所有必需配件的完整插管套件</td></tr><tr><td>NOD/SCID 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:001303</td><td>免疫缺陷型小鼠模型</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PneumaCult-Ex Plus 培养基&amp;nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>含 DAPI 的 ProLong Diamond 抗荧 quench 封片剂&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P36962</td><td>免疫染色切片的封片介质</td></tr><tr><td>灰色链霉菌蛋白酶&amp;nbsp;</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>手术器械包</td><td></td><td></td><td>用于固定小鼠舌头的钝头镊子</td></tr><tr><td>含 Tween20 的 Tris 缓冲盐水（TBST）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28360</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express 酶&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>VivoTrax Plus</td><td>Magnetic Insight</td><td>MIVTP01</td><td>用于体外细胞标记及后续 MPI 检测的氧化铁示踪剂</td></tr></tbody></table>

影像引导 体内 利用磁性粒子成像技术追踪移植的远端肺上皮前体细胞治疗肺纤维化

Image-guided In Vivo Tracking of Transplanted Distal Lung Epithelial Progenitor Cells for Pulmonary Fibrosis Using Magnetic Particle Imaging

肺纤维化（PF）是一种进行性慢性肺部疾病，其特征是肺泡上皮反复受损，导致细胞外基质过度沉积，进而引起组织增厚、瘢痕形成以及气体交换功能受损，最终导致呼吸功能障碍。在美国，每年约报告5万例新发病例，患者面临气胸、肺动脉高压、呼吸衰竭等严重并发症，并且肺癌风险增加。目前的治疗手段疗效有限，主要目的在于延缓疾病进展。细胞治疗作为一种有前景的干预策略，具有再生受损肺组织、调节炎症反应以及改善肺功能的潜力。然而，这些疗法的有效性在很大程度上取决于能否对移植细胞在宿主肺组织内的分布、存活及整合情况进行有效监测。
磁性粒子成像（Magnetic Particle Imaging, MPI）是一种新型的、非侵入性的临床前成像技术，利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPIONs）作为示踪剂。MPI具有高灵敏度、高特异性和无背景信号的优点，可实现对体内标记细胞的实时、定量追踪。in vivo。在本研究中，我们探讨了MPI在监测人远端肺上皮祖细胞移植到免疫缺陷小鼠肺部过程中的应用。通过不同浓度的SPION对细胞进行标记以优化信号强度，并通过免疫染色和铁含量定量加以验证。经气管灌注后，采集二维MPI扫描图像以追踪移植细胞的空间分布。为期两周的纵向成像实现了对细胞在肺组织中整合与滞留情况的可视化。成功灌注的小鼠在左右肺均检测到MPI信号，且信号随时间逐渐减弱（约减少65%）。随后处死小鼠以进行组织学验证。本研究展示了MPI在肺纤维化细胞治疗中用于非侵入性、纵向细胞追踪的实用性，并重点围绕实验过程中所采用的精细技术展开。

本项预试验共使用六只小鼠。其中仅有一只小鼠在研究结束前死亡，发生于第10天。不同标记浓度下的二维磁粒子成像（MPI）信号强度被评估为细胞数量的函数（图1A）。观察结果显示，信号强度与氧化铁示踪剂的浓度呈正比。因此，250 µg/mL 的浓度被视为最佳标记浓度，并用于后续研究。体外细胞标记还通过免疫染色及随后的荧光显微镜观察得以确认（图1B）。需要注意的是，细胞标记效率也可通过流式细胞术进行评估，但这需要额外的步骤，即将荧光染料与纳米颗粒偶联。尽管本研究未采用该方法，但它仍是一种有价值的策略，可在今后的研究中加以应用。
图1C展示了由10,000至60,000个细胞产生的二维磁粒子成像（MPI）信号强度。在移植研究中，选择50,000个细胞作为最佳细胞数量。图像显示细胞质中存在氧化铁示踪剂（红色），细胞核经DAPI染色呈蓝色。这些标记后的细胞通过气管内灌注移植到博来霉素（BLM）损伤的NO...

细胞治疗通过使用祖细胞修复受损组织并改善肺功能，为肺纤维化提供了一种有前景的干预手段。由于影像学在追踪细胞整合过程中发挥关键作用，本文描述了一种磁性粒子成像引导的 体内 在小鼠模型中追踪肺纤维化细胞治疗

肺纤维化（pulmonary fibrosis, PF）是一种进行性慢性肺部疾病，其特征是肺泡上皮反复损伤，导致过度……

本研究聚焦于经气管插管技术作为肺细胞治疗的关键递送方法，旨在优化肺纤维化模型中细胞移植及利用磁性粒子成像进行无创追踪的效果。本方案通过结合经气管灌注与磁性粒子成像技术，解决了肺纤维化中缺乏细胞治疗在体无创追踪手段的问题，从而实现细胞分布的实时监测。本方案通过经气管灌注实现精确的局部细胞递送，并利用磁性粒子成像实现优异的追踪效果，具有高灵敏度、实时成像且无背景噪声的优势。首先，称量一只12周龄的雄性NOD或SCID小鼠，以计算所需博来霉素剂量。将博来霉素溶液用无菌生理盐水配制至所需浓度，最终体积为50 µL，置于1.7 mL微量离心管中。然后将溶液吸入移液器中。在注射前，用200微升空气预填充注射器，以确保将全部液体体积注入气管。麻醉小鼠后，将光纤导光插管套件组装好，将光纤探头穿过喉镜和导管。轻捏动物的脚趾以确认麻醉充分，并在动物处于麻醉状态时，向双眼涂抹眼用软膏。将小鼠以上门齿悬挂在倾斜的小动物插管架上，呈仰卧位。使用钝头镊子夹住舌头，轻柔地向上并向左移动，以暴露喉部，便于清晰观察。打开光纤探头，将其引导进入口腔，接近气管。使用喉镜的放大镜以增强视野，识别气管开口处的声带。将导管插入气管开口，然后轻柔地取出喉镜。接着，在导管上端放置一滴20 µL的生理盐水。将预装有200微升空气的注射器连接上，推动液滴进入气管。接着，用最多50微升博来霉素填充导管，并使用充满空气的注射器将其注入。保持导管位置5-7秒，以防止液体从气管回流。然后轻柔地移除导管。将小鼠保持在插管架上相同的位置至少30秒。之后将小鼠从支架上取下，并置于放置在加热垫上的恢复笼中。持续监测小鼠，直至其完全从麻醉中恢复。从特发性肺纤维化患者体内获取经纳米颗粒标记的人气道上皮细胞。在博来霉素给药72小时后，重新麻醉小鼠，并重复气管内给药操作，将50,000个细胞溶于50 µL细胞悬液中进行给药。在进行磁粒子成像前，让小鼠恢复至少20分钟。将麻醉管路从鼠床下方穿过，并通过正确的连接器连接后，将鼠床放置于磁粒子成像扫描仪中。在小鼠麻醉过程中，准备磁粒子成像扫描仪。通过脚趾夹捏试验确认麻醉效果充分后，将小鼠小心地放置在磁粒子成像床面上。将带有小鼠的成像床推入扫描仪孔内，然后在软件界面中点击“开始扫描”以启动成像。扫描完成后，将小鼠从磁粒子成像床上取出，并放入置于加热垫上的恢复笼中。最后，使用图像分析软件分析所获得的图像。二维磁粒子成像（MPI）信号强度在所有测试的细胞数量范围内均与氧化铁示踪剂的浓度呈正比增加。选择每毫升250微克作为最佳标记浓度。荧光显微镜证实了细胞体外标记成功，显示细胞质中存在红色葡聚糖信号，细胞核经蓝色DAPI染色。二维MPI图像中的信号强度随标记细胞数量增加而增强，证实信号强度与细胞数量之间存在正相关关系。据此，选择50,000个细胞用于移植。空床对照图像未显示背景MPI信号，证实了扫描仪对标记细胞的特异性。所观察到的四个信号对应于用作对照的定位标记物。标记细胞成功移植至肺部后，产生了明显的蝴蝶形MPI信号，并在双肺中可见分布，验证了经气管递送的有效性。细胞植入不完全导致信号出现在双肺及颈部区域，表明因导管过早移除而发生泄漏。导管误插入食管而非气管，导致MPI信号出现在腹部较低位置，提示细胞沉积于胃中。移植后14天，对切除肺组织进行离体成像，证实了标记细胞的持续存在。我们的研究结果将提高肺部疾病的诊断准确性，并推动包括干细胞治疗在内的靶向疗法的开发，加速肺部成像及相关生物医学领域的进展与创新。我们的实验室将致力于增强基于干细胞的肺纤维化治疗，改进无创成像技术，同时优化细胞递送方式并监测肺纤维化治疗的疗效。

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医学

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