一种基于荧光的天然来源蛋白质合成抑制剂初步筛选方案

一种基于荧光的天然来源蛋白合成抑制剂初步筛选方案。蛋白合成涉及高度调控的过程，包括转录和翻译。转录主要由转录因子、染色质修饰和调控性RNA进行调控。

尽管翻译过程受到起始因子、信号通路和RNA稳定性机制的调控，这些调控系统使细胞能够维持正常的细胞功能，并有效应对压力或损伤。癌细胞通过劫持翻译机制来扰乱蛋白质合成，以满足其高能量需求和不受控制的生长。

这种重编程几乎导致所有主要致癌信号通路的失调，促进细胞存活、增殖和转移，同时抑制细胞死亡通路。由于增强的蛋白质合成对癌症的存活至关重要，因此靶向并阻断这一过程的治疗方法有望成为潜在的治疗策略。为鉴定蛋白质合成抑制剂，可采用以下蛋白质合成抑制荧光检测方法。

在开始实验之前，为了获得可靠的结果，化合物必须在其毒性阈值以下的适当浓度下给药。为确定起始浓度，应进行细胞毒性检测，以测定该化合物的半数有效浓度（EC 50）。如果此方法不可行，则可在本实验中以剂量依赖的方式测试化合物，以确定最有效的浓度参数。

如果化合物浓度引发细胞死亡，则有必要在较低浓度下进行测试。此外，染料在不使用时必须始终避光保存。长时间暴露于光照下会导致荧光淬灭，从而影响数据质量。

步骤 3.1，配制主混合液 A，标记一个离心管为 A，然后向其中加入 598.5 µL 培养基和 1.5 µL 蛋白标记物。通过上下吹打混匀该混合物，确保其均一性。接下来配制主混合液 B。标记另一个离心管为 B，向其中加入 1.5 µL 蛋白标记物、6.6 µL 环己酰亚胺和 591.9 µL 培养基。同样通过上下吹打混匀该混合物，确保其均一性。在两个孔中分别加入 1 µL 待测化合物和 1 µL 溶剂对照后，轻轻向这两个孔中各加入 99 µL 主混合液 A，加样时应倾斜移液枪头，沿孔壁缓慢加入，以避免对细胞造成机械扰动。

将100微升B号主混合液移液至两个未经处理的孔中。移液时应倾斜地将移液器对准孔壁，以防止对细胞造成机械扰动。轻轻敲击培养板，使目标组分充分进入细胞内。

将细胞在37摄氏度下孵育30分钟至2小时。通过抽吸去除细胞培养基。倾斜培养板，从孔的侧壁而非中心位置进行抽吸，以避免对细胞造成机械扰动。

然后向每个孔中加入 100 µL PBS 缓冲液，并在 900 × g 条件下离心 5 分钟。离心后，需通过抽吸去除 PBS 缓冲液。第五步，固定与透化处理。

向每个孔中加入 100 µL 固定液。然后将细胞在室温下避光孵育 15 分钟。随后吸除固定液。

用100微升洗涤缓冲液洗涤细胞，并通过抽吸去除。重复此步骤两次。向每个孔中加入100微升透化缓冲液。

此后，在室温下孵育10分钟。通过抽吸去除透化缓冲液。第六步，蛋白质反应与染色。

配制反应鸡尾酒主混合液。向离心管中加入651 µL PBS缓冲液，然后加入7 µL 100倍浓度的铜试剂。

然后加入7 µL荧光叠氮化物。最后，向离心管中加入35 µL还原剂。添加试剂时请严格遵循此顺序，随后将100 µL反应混合液加入每个孔中。

将细胞在室温避光条件下孵育30分钟，以防止光漂白。以900g离心5分钟。吸除上清，洗涤细胞，然后再一次吸除液体。

制备总DNA染料的1倍稀释液，向每孔中加入100微升。将细胞在室温下避光孵育20分钟，以防止光漂白。以900×g离心5分钟。

用100微升洗涤缓冲液洗涤细胞，通过抽吸去除。重复此步骤两次。最后，用100微升预冷的PBS缓冲液重悬细胞，以准备成像。

第八步，成像。将培养板插入酶标仪中，并将放大倍数设置为 20 倍。使用 GFP 469/525 纳米通道分析细胞核染色。

使用自动弯曲和自动聚焦功能以增强成像效果。利用Texas Red 586/647纳米通道分析活性蛋白质合成。使用自动弯曲和自动聚焦功能以增强成像效果。

荧光探针易受光漂白影响，光漂白是指光照辐射导致荧光分子失去荧光特性的现象。染料在不使用时应始终避光保存。此外，还需限制每个孔内的扫描次数以及暴露在光照下的时间。

长时间光照会导致光漂白，最终影响数据质量。让我们来看一下代表性结果。此处活细胞显示为绿色，而活跃的蛋白质合成则以红色表示。

已知的蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺导致蛋白质合成显著减少，如图1B所示，与图1A中的阴性对照DMSO相比，红色荧光信号减弱。化合物一处理组如图1C所示，出现细胞脱落或细胞死亡现象。因此，我们无法对其蛋白质合成抑制活性作出明确结论。

这需要进一步开展剂量反应研究，以确定其在较低浓度下是否仍能抑制蛋白质合成。化合物二表现出中等程度的蛋白质合成抑制作用，如图1D所示。该荧光检测法是一种有价值的研究工具，也是一种适合用于培训本科生的易行化学生物学方法。

通过提供一种易于操作、高效且数据处理量最少的实验方案，使学生能够获得实践经验和现代药物发现技术，同时加快药物发现进程。该方案采用荧光底物和先进的荧光显微技术，系统性地检测并量化天然产物化合物一和化合物二的抑制能力。以环己酰亚胺作为参考抑制剂，两种天然产物均表现出不同程度的蛋白质合成抑制活性。

随着对新型蛋白质合成抑制剂的需求不断增长，该方法为本科生提供了富有意义的研究机会，同时推动了癌症治疗领域的进步。