Name: 用于研究小鼠视网膜中神经胶质细胞相互作用的 离体 外植体模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-15T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 了解小鼠视网膜外植体模型的详细分离与培养方法，用于研究青光眼神经炎症中的星形胶质细胞和小胶质细胞相互作用。该方案能更好地保留视网膜细胞的自然环境，为研究神经退行性疾病提供关键技术支持。

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M.A.M. 获得了美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI）R01EY035312 项目、青光眼研究基金会“治愈催化剂奖”（Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award）、Melza M. 和 Frank Theodore Barr 基金会、Robert M. Sinskey 医学博士基金会、Ruettgers 家族慈善基金会以及 B.L. Manger 基金会的支持。P.F.C. 获得了美国国立卫生研究院/国立眼科研究所（NIH/NEI）2T32EY007145 项目的支持。本研究还得到了美国国立卫生研究院视觉科学研究核心资助 P30 EY003176 的支持。&#160; 图 1 使用 BioRender 生成。作者谨此感谢 Nasir&#160;Uddin 博士对&#160;稿件提出的&#160;意见，以及 Qiurong Zhu 博士在&#160;协助与支持方面所做的贡献。

所有涉及动物的实验程序均经施佩恩斯眼科研究所机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准（方案编号 # 2022N000030，批准日期 2025年3月4日）。动物的饲养与操作遵循视力与眼科学研究协会（ARVO）关于动物在眼科与视觉研究中使用的声明。
注意：图1 展示了从小鼠摘除眼球中分离活体视网膜的关键步骤。
<img alt="视网膜提取过程示意图；在培养皿装置中逐步展示解剖工具的使用。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68482/68482fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：从小鼠摘除眼球中分离活体视网膜关键步骤的示意图。 关键步骤的相应序号以圆圈标注。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68482/68482fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
1. 准备
<ol>
	<li>在生物安全柜中对1 mL移液器和一对弯头镊子进行消毒，并将其放置于其中。这些工具将在本方案的第3节中使用。</li>
	<li>通过在移液管管身距离储液端约2 cm处（此处孔径最宽）垂直于轴线切割，对转移移液管进行改造，以缩短移液管并扩大开口。确保切口平整，避免视网膜组织被刮伤。 
	注意：若保持清洁并在每次使用后用无菌水冲洗，该工具可重复使用。</li>
	<li>在生物安全柜中，以无菌操作方式配制50 mL外植体培养基：将47.5 mL Neurobasal培养基中加入500 µL N-2补充剂、1 mL B-27补充剂、500 µL Glutamax以及500 µL青霉素-链霉素混合液（终浓度为青霉素100 U/mL，链霉素100 mg/mL）。 
	注意：每次分离操作前均应新鲜配制外植体培养基；多余培养基可在4 °C保存最多1周，必要时用于换液。Neurobasal培养基开封后，1个月后应丢弃未使用部分。N-2和B-27补充剂应分装成单次使用量并冷冻保存，避免反复冻融。</li>
	<li>在生物安全柜中，通过将插入物放入每个待用孔中，以无菌操作方式准备培养板，操作时应握住插入物边缘伸出的“爪状结构”，避免触碰将与培养基接触的表面。
	<ol>
		<li>向插入物中加入1 mL外植体培养基，随后在孔内再加入3 mL培养基。向未使用的孔中加入2–3 mL无菌水，以控制蒸发。</li>
		<li>将培养板转移至37 °C、5% CO2的培养箱中，平衡约30分钟，以备组织分离。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备滤膜小方块，作为组织稳定与转移的基底。使用刀片或手术刀沿瓶顶过滤装置滤膜边缘切割，将其从装置中取出。操作时需小心，避免受伤或因折叠、撕裂而损坏滤膜。 
	注意：使用坚固的刀片将透明塑料储液端切除，通过切割螺纹接头与储液端连接处较柔软的不透明塑料部分，可简化滤膜取出过程，但需格外注意防止受伤。
	<ol>
		<li>滤膜切割分离后，使用镊子将其取出。注意记录滤膜取出过程及之后的方向；在后续步骤2.16中用于视网膜安装和转移时，哑光面（原朝向储液端的一面）应朝上。</li>
		<li>将滤膜切成约7 mm × 7 mm的小方块，每个视网膜外植体需使用一块。将小方块预先浸泡于盛有无菌水的100 mm培养皿中，至少20分钟。 
	注意：滤膜小方块可在无菌水中浸泡保存最多1周后再使用。由于干燥状态下滤膜小方块易产生较强静电，在使用前仅准备所需数量即可。剩余的干燥滤膜材料可长期保存于无菌100 mm培养皿中，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 分离与装片
<ol>
	<li>采用批准的方法处死小鼠，并通过二次方法确认；本研究使用二氧化碳窒息法，随后进行颈椎脱位。用弯头钝头镊子摘除双眼，并将其置于无菌 PBS 中。</li>
	<li>在双目解剖显微镜的载物台上放置一个盛有无菌 PBS 的 100 mm 培养皿，以准备操作区域。
	<ol>
		<li>剪取一条宽1 cm的实验室擦拭纸，浸入培养皿中，作为稳定基底。</li>
		<li>将一只眼睛转移至解剖皿中，另一只保留在 PBS 中，并置于冰上或冰箱内 4 °C. 
		注意：由于视网膜对较长的死后间隔时间较为敏感，建议每次仅处死一只小鼠。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>固定并稳定眼球。使用镊子将眼球移至浸没的实验擦拭纸上，以辅助稳定。
	<ol>
		<li>确定一个合适的持握点，用弯头镊子夹住该位置，轻轻滚动眼球，使其从侧面或理想情况下从下方被固定。确保眼球的前-后轴（即从角膜到视神经）处于水平位置。此方向可改善解剖过程中的视野可见性，并最大限度减少对眼球的压力。 
		注意：如果可能，应抓取眼眶外组织，避免刺破或挤压眼球，优先选择肌肉或结膜，而非视神经或脂肪组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在用有角度的镊子固定的同时，确保眼球完全浸没并牢固固定。使用#11手术刀的刀尖在距角膜缘约0.5 mm的后方平行做一切口，此处为角膜向巩膜移行的位置。 
	注意：切口应刚好足够容纳弹簧剪一个刀片的尖端。由于手术刀尖的锋利度对于干净地刺穿眼球至关重要，因此每处理两个视网膜后即应更换刀片。
	<ol>
		<li>将弹簧剪的一侧刀片插入眼球内部，开始围绕眼睛进行环形切割，必要时使用镊子轻轻调整眼球位置。 
		注意：切口应尽可能平直且与角膜缘平行；重新定位眼球时，可能需要放下剪刀，双手各持一把镊子操作。视网膜暴露后，在整个解剖过程中应始终保持其浸没状态。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当切口已环绕眼球一周后，小心移除眼前节和晶状体，然后将视杯旋转至朝上位置，以便于观察和清除玻璃体。若仍有较长的视神经残存，将其修剪至较短（1-2 mm）长度，以方便操作。</li>
	<li>检查视网膜是否有可见损伤，并观察玻璃体腔内是否存在碎屑，例如在去除前节过程中可能进入的来自视网膜色素上皮（RPE）或脉络膜的色素细胞。使用斜头镊子在此位置固定眼球杯。 
	注意：为了获得最佳效果，必须清除玻璃体腔内的碎片，并尽量减少视网膜周边部残留的玻璃体及睫状体粘连组织。该操作过程可能具有挑战性，更多相关说明可参见“代表性结果”部分中的“机械性损伤的识别与故障排除”和“代谢性损伤”章节。
	<ol>
		<li>使用改良的移液管用PBS冲洗玻璃体腔，以去除微小颗粒碎片；操作时应将移液管尖端保持在液面以下，并在储液泡中维持足够的PBS量，以避免产生气泡。</li>
		<li>使用细头水彩画笔清除较大的碎屑，尽量减少与视网膜表面的接触。如有必要，可使用尖头精细镊子去除较顽固的碎屑；但应避免金属工具尖端直接接触视网膜，以防造成损伤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>清除可见碎屑后，用移液管反复冲洗玻璃体腔3至5次，操作如上所述。此步骤可去除在清除碎屑后仍可能松散附着的玻璃体。使用细刷轻轻探查玻璃体腔，尤其当睫状体部分结构仍有残留时，应重点检查周边区域。尽管玻璃体在光学上透明，但其会对刷毛产生阻力，借此可被检测到。 
	注意：视网膜上残留的少量玻璃体似乎不会对视网膜的分离或保持产生负面影响 离体但在视网膜周边区域存在大量此类结构，常与睫状体的残余结构相关，若不予以清除，可能导致视网膜折叠和样本丢失。
	<ol>
		<li>如果仍有明显的玻璃体残留，可使用刷子轻轻向外周扫动以清除，确保刷毛接触视网膜时呈浅角度，并采用拖拽方式使玻璃体从眼腔移出，避免推动。 
		注意：去除玻璃体需要特别小心操作，以避免造成视网膜损伤，此类损伤可能在宏观上不可见；有关识别和避免此类损伤的建议详见“代表性结果”部分的“机械性损伤的识别与故障排除”和“代谢性损伤”章节。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>当玻璃体腔内的碎片已被清除，仅剩少量玻璃体时，继续用斜向镊子固定样本，同时轻柔地将外层视网膜与眼杯分离。操作过程中应避免损伤视神经乳头，并保持该结构完整，以作为视网膜的锚定点。
	<ol>
		<li>使用一对镊子，保持镊子闭合并使尖端相接触，轻轻将镊子插入视网膜与脉络膜之间，若有可能，利用先前操作形成的间隙。使用镊子的扁平臂部而非尖端，扩大视网膜与脉络膜之间的腔隙，直至这两层结构完全分离。 
		注意：应强调横向移动，而非推动镊尖，以扩大视网膜与脉络膜之间的间隙。在进行这些操作时轻轻扭转镊子，可在改善组织分离效果的同时，减少镊子与组织间摩擦产生的剪切应力。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将视网膜外层与脉络膜分离后，继续固定样本，同时使用另一把镊子将眼球杯（包括巩膜、脉络膜等）向下牵拉。若视网膜已成功分离，其应通过视盘处的视神经乳头保持原位固定，此时眼球杯可由一把镊子单独夹持。若视网膜随眼球杯一同下压，则需继续轻柔探查并分离除视盘以外的其他黏连部位。</li>
	<li>在视神经乳头处固定视网膜，继续稳定组织，并用第二对镊子在视神经乳头下方聚拢眼杯。
	<ol>
		<li>检查视网膜周边部是否因残留睫状体与视网膜之间夹角处存在过多玻璃体而发生折叠粘连。如有需要，使用移液管以PBS冲洗前房，清除额外碎屑，并用刷子轻柔操作以展开组织，去除多余玻璃体，注意避免过度牵拉组织。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>视网膜双侧暴露后，使用弹簧剪进行一系列间隔约 90° 分开，从周边沿直线延伸至视神经乳头，距离中心约1 mm处停止。这可最大限度减少视网膜神经节细胞轴突在视网膜中的横断，从而提高培养外植体的质量。</li>
	<li>在固定浸没的组织时，用镊子轻轻将实验室擦拭纸从组织侧向拉开，然后从培养皿中取出。避免擦拭纸接触视网膜，以防组织黏附于擦拭纸上导致样本丢失。</li>
	<li>接着，继续固定组织，使用弹簧剪在视网膜正下方切断视神经，然后将剩余的眼杯从培养皿中取出。</li>
	<li>将视网膜从眼球其余部分分离后，用 PBS 填充一个 35 mm 的培养皿，用镊子将滤膜方片置于皿底，粗糙的哑光面朝上。操作时需注意避免滤膜产生褶皱，以免影响其作为移动视网膜基底材料的使用。</li>
	<li>用移液管轻轻吸取视网膜，并小心转移至35 mm培养皿中。用刷子调整视网膜位置，确保视网膜内表面朝上，且组织位于滤膜方块正上方。</li>
	<li>用移液管缓慢吸出培养皿中的PBS，使视网膜缓慢下降并贴附于滤膜上。如有必要，可暂停操作以调整组织位置，然后继续吸液，直至视网膜完全贴附于滤膜。 
	注意：快速吸液可能导致视网膜突然发生侧向移动，从而造成损伤或组织丢失。整个视网膜必须平整地贴附于载玻片表面，以避免损伤；然而，若视网膜附着位置不佳，可向培养皿中重新加入磷酸盐缓冲液（PBS），直至视网膜重新悬浮，随后可再次尝试封片。</li>
	<li>一旦视网膜沉降到滤膜上，使用刷子将可能折叠的周边视网膜展开。小心调节PBS的液面高度，使视网膜不易从滤膜上移位，同时确保留有足够液体以防止样品干燥，并使刷子能够平稳移动而不损伤内层视网膜。</li>
	<li>再次检查视网膜是否有残留碎片。为避免损伤组织，使用移液管从距组织约1 cm的高度将PBS滴加至视网膜表面以清洗，过程中避免直接接触视网膜。此操作可冲走任何残留的碎片，但若向培养皿中加入过多PBS，视网膜可能重新浮起。若发生此情况，需再次进行抽吸以重新固定组织。 
	注意：“假手术”样本可通过将视网膜转移至24孔板中进行固定、封闭/通透化及抗体染色来制备，具体步骤参见其他部分描述21这些假手术对照有助于排查在视网膜分离过程中可能发生的机械性损伤。</li>
</ol>
3. 转移至培养基并维持培养
<ol>
	<li>将35 mm培养皿盖上盖子后运送至生物安全柜，运送过程中保持培养皿水平，以避免视网膜从滤膜上脱落。若发生脱落，按上述方法重新安装。</li>
	<li>将装有视网膜的封闭式35 mm培养皿放入生物安全柜中，注意在消毒或更换手套前，避免触碰柜内任何设备或表面。</li>
	<li>用乙醇去污手套和/或更换手套，然后将预装有外植体培养基的6孔板从培养箱转移至生物安全柜中。在生物安全柜内执行步骤3.4和3.5，使用步骤1.1中已放置在柜内的工具。</li>
	<li>取下含有视网膜的35 mm培养皿盖，用斜口镊子小心提起滤膜方块，避免直接接触视网膜。取下6孔板的盖子，将滤膜置于合适孔中插入件的中央上方，然后缓慢将其降入培养基中。在此过程中，视网膜将从滤膜上脱落，并漂浮于气液界面下方。</li>
	<li>视网膜与滤膜分离后，缓慢将滤膜从视网膜移开，并从培养基中取出。使用1 mL移液器，吸除 500 µL 通过将视网膜夹在插入物底部与气液界面之间，吸除插入物中的培养基，以确保视网膜平展。</li>
	<li>将盖子重新盖回培养板上，并将其放回培养箱中 37 °C 含5% CO2，注意将视网膜保持在孔的中央附近。单个培养板中最多可容纳6个视网膜。 
	注意：若将外植体保存 24 小时或更短时间，可将其留在培养箱中直至实验结束。若保存时间更长，则在 1 天后进行 50% 培养基更换 体外 此后建议隔日进行。</li>
</ol>
4. 免疫染色固定（可选）
<ol>
	<li>若进行免疫染色，请参考以下步骤进行固定；尽管免疫染色可采用先前针对平铺视网膜所述的参数进行21，但离体视网膜的固定需考虑特定条件。</li>
	<li>从6孔培养板中取出带有外植体和培养基的细胞培养插件，并将其放置于非多孔表面（如培养板的塑料盖）上，该表面在固定后可妥善丢弃，因为插件具有轻微孔隙性，少量固定液会渗入下方表面。</li>
	<li>轻轻移除插件中的培养基，然后向每个插件中加入1 mL 4%多聚甲醛（PFA）。在通风橱中固定15分钟，随后移除PFA，并根据机构规定进行处理。 
	警告：多聚甲醛具有危害性，是甲醛的前体物质，而甲醛为已知致癌物。操作时应谨慎，并在通风橱内采取适当防护措施。</li>
	<li>用PBS洗涤视网膜3次，每次5分钟，以去除PFA，然后使用改良的转移移液管将PBS中的视网膜转移至24孔板的各个孔中，用于封闭、通透化及免疫染色，具体方法见其他文献21。根据机构规定处理被PFA污染的塑料制品（移液枪头、插件以及固定过程中使用的非多孔表面）。 
	注意：该转移移液管可保留用于将固定并染色后的视网膜转移至载玻片上进行封片和成像。尽管其不应直接接触PFA，但仍建议分别使用不同的转移移液管来处理活体和固定后的组织。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

器官型培养32 视网膜外植体等方法在保留大部分组织结构和细胞相互作用的同时，兼具细胞培养实验灵活性高和周转时间短的优势 原位 上下文 体内 研究，使其成为探究细胞类型间复杂相互作用的有力途径。本实验方案旨在为那些在眼部研究方面已有丰富经验、能够熟练操作固定视网膜但尚未掌握新鲜视网膜处理的研究人员提供入门指导。因此，我们重点在于降低分离与操作过程中相关的技术难度和变异，因为根据我们的经验，这些因素是获得稳定、可靠样本的主要障碍。然而，眼球是一个结构复杂的器官，其组成结构和组织在功能上差异显著，在材料特性上同样存在巨大差异；而小鼠眼球体积较小，进一步加大了无损伤提取视网膜的难度。因此，在分离过程中必须具备一定程度的灵活性，以避免对视网膜造成过度的结构或代谢损伤，并可靠地获取高质量的组织样本。针对识别和最小化这些并发症的建议，已在结果部分的相关内容中予以说明（“机械性损伤的识别与处理”和“代谢性损伤”）。
尽管我们及其他研究团队此前主要在青光眼的背景下描述了组织外植体的应用——这既反映了我们课题组的研究重...

对光敏感的视网膜是位于眼球后部的中枢神经系统（CNS）延伸部分，对视觉至关重要，但易受急性损伤和慢性疾病的损害。与其他中枢神经系统区域一样，成年视网膜中的神经元一旦丢失便无法再生，而视网膜神经节细胞（RGCs）在青光眼中尤为容易发生功能障碍和死亡，这些细胞负责汇聚并传递视觉信息至大脑，其损伤将导致不可逆的视力丧失1,2青光眼是全球范围内导致失明的主要原因之一3，然而尽管该病对患者个人造成毁灭性影响，并给社会带来巨大负担，关于其早期阶段的许多机制仍不明确&#160;疾病导致视网膜神经节细胞丢失4胶质细胞在青光眼病理生理学中是一个重要的研究领域，因为这些非神经元支持细胞对视网膜神经节细胞的存活至关重要5 但在疾病状态下会发生表型改变，可能削弱其有益行为6 或甚至促进有害表型的出现7. 尽管胶质细胞这一术语涵盖了中枢神经系统中多种特化的细胞类型8，这些细胞大致可分为两类——与神经元具有共同发育谱系并提供营养、能量和结构支持的细胞9以及起源于髓系、执行特异性免疫监视和应答功能的细胞10两类细胞的代表性细胞——前者为星形胶质细胞和 Müller 细胞，后者为小胶质细胞——均存在于视网膜中5 并在青光眼中发生重大改变，这对其在疾病进展和视网膜神经节细胞存活中的作用提出了重要疑问11.
回答这些问题的努力在一定程度上受到视网膜胶质细胞内在特性的限制，这些特性给研究带来了挑战 体内 和 体外 研究。与神经元不同，它们在电生理上相对静默，这使得诸如ERG等能够对RGCs和光感受器进行功能评估的方法 体内 不适合用于研究胶质细胞功能和行为的变化。尽管可诱导的12 和自发的13 尽管已有多种青光眼模型，但对于疾病最早期时间点上胶质细胞的变化仍知之甚少，这些变化可能早于可检测到的视网膜神经节细胞（RGC）丢失。这一问题在许多模型中因疾病表型的可变外显率而变得更加复杂。此外，来自临床和实验性青光眼的证据表明，外周免疫细胞可能参与疾病过程，其作用尽管有迹象显示与小胶质细胞的影响方向不同，但其贡献仍难以与小胶质细胞的作用明确区分。14,15.
研究视网膜胶质细胞也面临诸多挑战 体外尽管星形胶质细胞的分离与培养16,17 和小胶质细胞18 来自大脑的胶质细胞具有明确的特征，但近期研究强调了中枢神经系统不同区域之间胶质细胞的高度异质性，尤其是在星形胶质细胞中19，且某一区域存在的表型在另一区域的胶质细胞中可能并不存在，例如视网膜中的胶质细胞20,21然而，直接分离视网膜星形胶质细胞和小胶质细胞用于研究尤为困难，因为这两种细胞类型均较为稀少——每种细胞仅占小鼠视网膜约650万个细胞的不到1%22,23,24此外，与神经元不同，胶质细胞具有高度可塑性，能够迅速适应周围环境的剧烈变化。16,18,25；因此，在这些细胞中观察到的行为 体外 可能代表了它们对新环境的特定适应，而非在健康或疾病状态下通常观察到的表型模式。鉴于这两方面的局限性 体内 视网膜胶质细胞的实验研究与原代培养，我们采用了一种折中方法——视网膜外植体，其中胶质细胞、视网膜神经节细胞（RGCs）及其他视网膜结构成分均得以保留 原位 在 离体 背景。相对于 体内 模型，该方法可缩短实验周期26，可实现对视网膜胶质细胞的直接实验操作27，并避免了外周免疫细胞浸润可能产生的干扰影响14相反，与原代细胞培养不同，该方法对细胞外环境的干扰极小，胶质细胞保持完整且形态可辨，从而避免了在酶学和机械性解离后几乎需要重新生长并鉴定这些细胞所面临的挑战16,25.
与先前描述的视网膜离体培养方法相比，本方法更注重技术的可靠性、可重复性，并最大限度地提高操作的“用户友好性”，以增强其可及性26,28。在与其他研究人员的交流中，我们&#160;发现，操作活体视网膜所面临的技术挑战是许多希望使用离体培养技术的研究者遇到的主要障碍，而对已有适当细胞培养条件的实验室而言，离体视网膜在培养中的维持则相对简单。因此，本实验方案包含多项创新，旨在降低视网膜分离操作的学习难度，使研究人员能够更快地开始收集实验数据。最后，尽管我们特别强调了该离体模型在研究视网膜胶质细胞行为方面的潜力，并主要通过免疫荧光显微镜对其进行表征，但其他视网膜细胞类型&#160;和结构也基本得以保留，且离体视网膜仍适用于多种其他研究技术。

<table><tbody><tr><td>#11 手术刀片</td><td>Bard-Parker</td><td>3,71,311</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 移液器（“Pipetman P1000”）</td><td>Gilson</td><td>F144059M</td><td></td></tr><tr><td>100 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>16% 多聚甲醛</td><td>Ted Pella Inc</td><td>18,505</td><td>稀释至 4% 用于固定</td></tr><tr><td>24 孔板</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>用于固定、封闭和抗体孵育</td></tr><tr><td>35 mm 培养皿</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板及插件套装</td><td>Greiner bio-one</td><td>657641</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-驴抗兔 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&amp;nbsp;</td><td>711-545-152</td><td>1:800 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 驴抗大鼠 IgG (H+L) 高度交叉吸附</td><td>Invitrogen</td><td>A-21209</td><td>1:800 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-F(ab')2 驴抗小鼠 IgG (H+L)&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&amp;nbsp;</td><td>715-586-150</td><td>1:800 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-驴抗豚鼠 IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&amp;nbsp;</td><td>706-605-148</td><td>1:800 稀释</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647-F(ab')2 驴抗鸡 IgY (IgG) (H+L)&amp;nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&amp;nbsp;</td><td>703-606-155</td><td>1:800 稀释</td></tr><tr><td>弯头镊子（“5/45”）</td><td>FST / Dumont</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>抗 Brn3a 抗体（小鼠）</td><td>Chemicon</td><td>MAB1585</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗 CD206 抗体（大鼠）</td><td>Biorad</td><td>MCA2235</td><td>1:200 稀释</td></tr><tr><td>抗 GFAP 抗体（鸡）</td><td>Abcam</td><td>ab4674</td><td>1:1000 稀释</td></tr><tr><td>抗 Iba1 抗体（兔）</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>019-19741</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>抗 Tmem119 抗体（豚鼠）</td><td>Synaptic Systems</td><td>400 004</td><td>1:500 稀释</td></tr><tr><td>B-27，50x</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>钝头弯镊（“Extra Fine Graefe”）</td><td>FST</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td>封闭和抗体孵育时使用 1% w/v</td></tr><tr><td>滤器套装（0.2 &amp;micro;m aPES 膜，150 mL 瓶顶滤器）&amp;nbsp;</td><td>fisherscientific</td><td>FB12566508</td><td></td></tr><tr><td>细毛刷，3/0 号</td><td>princeton art &amp;amp; brush co.</td><td>06435-1030</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>实验室擦拭纸（Kim wipes）&amp;nbsp;</td><td>KIMTECH</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>N-2，100x</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 培养基，无酚红</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>12349015</td><td></td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.&amp;nbsp;</td><td>017-000-121</td><td>封闭和抗体孵育时使用 10%</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Gibco (Thermofisher)</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>移液器吸头，1000 &amp;micro;L</td><td>TipOne</td><td>1126-7810</td><td></td></tr><tr><td>弹簧剪刀（“Cohan-Vannas”）</td><td>FST</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>无菌水（“无 DNase、RNase”）</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>经无菌过滤的 PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>直头镊子（“mini”）</td><td>FST / Dumont</td><td>11200-14</td><td></td></tr><tr><td>移液管，5.8 mL</td><td>fisherscientific</td><td>13-711-9AMMD</td><td></td></tr><tr><td>吐温 X-100</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>A16046.AP</td><td>封闭和抗体孵育时使用 0.5%</td></tr></tbody></table>

一个 离体 研究小鼠视网膜胶质细胞相互作用的外植体模型

An Ex Vivo Explant Model for Studying Glial Interactions in the Mouse Retina

胶质细胞在青光眼中的作用正成为日益重要的研究课题，但关于这些支持性细胞群体——特别是星形胶质细胞和小胶质细胞——如何影响视网膜神经节细胞存活，仍有许多未知之处。尽管 体内 和 体外 模型均能在一定程度上提供研究视角，但两种方法均存在显著局限性：前者受外周免疫反应的影响，后者则因细胞分离与培养过程引发生理功能的改变。为最大限度减少这些混杂因素，我们开发了一种 离体 视网膜外植体系统，可用于维持星形胶质细胞、小胶质细胞及其他视网膜细胞类型 原位 至少持续3天，从而实现比通常可行的方法更高的通量靶向研究 体内 模型。至关重要的是，该方法适用于在活体动物中难以或无法实现的技术手段，同时仍可兼容对完整神经组织进行的常见下游检测。本文介绍了一种适用于完整视网膜外植体的分离与培养的实验方案，并展示了免疫荧光显微镜的代表性结果，记录了胶质细胞和视网膜神经节细胞在培养过程中所发生的变化 离体 视网膜

在宏观尺度上，分离的视网膜在培养1天和3天后基本保持不变，但在后者时间点时组织会变得相对脆弱，因此在固定或其他实验终点前需小心操作。视网膜应保持相对平坦，避免折叠（折叠可能导致氧气和营养物质扩散的局部受阻），并应悬浮于培养基中，位于气液交界面与细胞培养插入物之间。到第3天时，在插入物底部、悬浮组织下方可能出现一条微弱的条纹；通过明场相差显微镜观察提示有中等程度的细胞碎片脱落，可能为变性光感受器的外节段，尤其在24小时至72小时之间更为明显。这并不意外，因为光感受器本身较为脆弱，且依赖于视网膜色素上皮（RPE）基质，而该基质在视网膜分离过程中大部分已丢失。然而，若培养基本身出现浑浊，则应考虑微生物污染的可能性。尽管在初始分离过程中视网膜曾暴露于生物安全柜外环境，但我们未能在任何样本中检测到微生物污染，表明使用无菌缓冲液、在培养基中添加青霉素（100 U/mL）和链霉素（100 µg/mL），以及在组织培养环境中严格执行无菌操作，足以在研究的时间范围内避免可检测的污染。
通过免疫荧光进行显微评估 
在视网膜中，星形胶质细胞和小胶质细胞（以及神经节...

此处，我们提供了一种详细的从小鼠眼球中分离视网膜的方法，适用于后续的长期研究 离体 实验。本方案旨在使这一技术要求较高的方法更易于研究人员掌握，以便利用在维持视网膜胶质细胞活性条件下所提供的研究路径 原位 在活体组织中。

胶质细胞在青光眼中的作用正成为日益重要的研究课题，但关于这些支持细胞群体——即……

我们希望深入了解青光眼中的神经炎症，青光眼是全球不可逆性失明的首要原因。具体而言，我们正在研究视网膜中的胶质支持细胞在疾病进展过程中如何影响神经元的丢失。人们认为星形胶质细胞和小胶质细胞等神经胶质细胞会影响青光眼的进展，但目前用于在活体动物模型中研究神经元功能的许多工具并不适用于这些细胞。视网膜外植体可用于研究神经炎症和胶质细胞功能，但其技术学习曲线较为陡峭。我们的实验方案使其更易于掌握，有望促进该技术的广泛应用。与传统的体外细胞培养相比，我们的外植体方法能更好地保留视网膜内层细胞的天然环境，从而更准确地研究其生理功能。[旁白] 首先，将提取的小鼠眼球置于盛有无菌、室温磷酸盐缓冲液（PBS）的解剖皿中。选择合适的持握位置，用弯头镊子夹住，并轻轻将眼球放置在浸没的实验擦拭纸上，确保从角膜到视神经的前后轴呈水平方向。在用弯头镊子牢固固定的同时，使用11号手术刀的刀尖在角膜与巩膜交界处（即角膜向巩膜过渡的位置）后方约0.5毫米处做一平行切口。将弹簧剪的一侧刀片插入眼球内部，并沿角膜缘周围环形剪开，必要时用镊子调整位置。完成环形切口后，用镊子移除前段组织和晶状体。如果残留较长的视神经，使用精细剪刀将其修剪至1–2毫米长度。然后旋转视杯使其开口朝上，以便进行肉眼检查并便于玻璃体的清除。继续使用弯头镊子固定视杯，检查视网膜是否有可见损伤，并观察玻璃体腔内是否存在来自视网膜色素上皮或脉络膜的色素细胞碎片。使用改良的移液管以PBS冲洗玻璃体腔，保持移液管尖端浸没于液体中，防止产生气泡。接着，用精细的水彩画笔轻轻去除较大的碎片，同时尽量减少与视网膜的接触。对于顽固性碎片，应小心使用尖头镊子操作，避免金属直接接触视网膜。清除可见碎片后，用移液管对玻璃体腔进行3至5次PBS冲洗，并用水彩画笔探查周边区域是否存在残留的睫状体组织，通过画笔纤维受到的阻力来判断玻璃体的存在。若仍有玻璃体残留，应将画笔向外周扫动，保持纤维呈浅角度向后拖曳，以防止损伤视网膜。将一对镊子闭合并使尖端相接，利用操作过程中形成的自然间隙，轻轻插入视网膜与脉络膜之间。利用镊子的扁平臂逐步扩大视网膜与脉络膜之间的间隙，直至完全分离。用一对镊子继续稳定样品，同时使用另一对镊子轻轻向下牵拉包含巩膜和脉络膜的视杯组织。如果视网膜随视杯一同下移，使用镊子轻轻探查并分离任何剩余的连接点，注意避开视盘区域。当视网膜仍固定于视盘时，保持组织稳定，用第二对镊子将视杯组织在视盘下方聚拢。检查确认视网膜周边未因残留玻璃体而发生折叠，尤其是在睫状体残留部位。如有需要，使用移液管向腔内滴加PBS，并用画笔轻轻展开折叠的视网膜，清除多余的玻璃体。当视网膜双面均暴露后，使用弹簧剪从视网膜周边向视盘方向做数个间隔约90度的释放切口。在固定浸没组织的同时，用镊子将实验擦拭纸从样品旁横向拉出，并将其从皿中取出，避免接触视网膜。在固定视网膜位置的同时，使用弹簧剪在视网膜下方切断视神经。然后小心提起并移除剩余的视杯组织。现在，向一个35毫米的培养皿中加入PBS，并用镊子将一片滤膜置于底部，粗糙的哑光面朝上，避免产生褶皱。随后，使用移液管轻轻吸起视网膜并转移至培养皿中。用画笔调整视网膜方向，使其内表面朝上，并正对滤膜上方定位。缓慢吸除PBS，使视网膜缓缓沉降到滤膜上。一旦视网膜落定于滤膜，使用画笔轻轻展开任何周边的折叠部分。调节PBS液面高度，以平衡视网膜的稳定性与水合状态，确保画笔可顺畅移动而不使组织干燥。接着，使用移液管从约1厘米高处滴加PBS，冲洗表面，并再次检查视网膜是否有碎片残留。盖上35毫米培养皿的盖子，将其转移至生物安全柜中。将密闭的培养皿放入生物安全柜内，避免接触柜内任何表面或设备。在转入无菌操作前消毒或更换手套，并将预装有外植体培养基的六孔板从培养箱转移至生物安全柜中。在柜内打开35毫米培养皿的盖子，使用弯头镊子提起滤膜，避免接触视网膜。然后打开六孔板，将滤膜缓慢、轻柔地放入其中一个插孔的中央，使其逐渐浸入培养基中。待视网膜从滤膜上自然分离后，缓慢将滤膜移至一旁，并用弯头镊子将其从孔中取出。使用1毫升移液器从插孔中吸出500 µL培养基，使视网膜被夹在插孔与气液界面之间。最后，盖上六孔板盖子，并将其放回培养箱，确保视网膜保持在孔中央位置。为观察视网膜胶质细胞的大规模变化，将培养三天的视网膜外植体与假手术组（即分离后立即固定但未进行培养）进行比较。假手术组视网膜中的小胶质细胞呈现规则、互不重叠的分布模式，而在第3天，外植体视网膜的细胞排列变得不规则，细胞出现聚集现象，提示发生了迁移。假手术组视网膜中的星形胶质细胞与血管结构紧密对齐，但在体外培养3天后该特征显著减弱。假手术组中穆勒细胞的GFAP表达微弱或缺失，而在体外培养第3天则明显增强，尤其在组织边缘区域更为显著。体外培养1天后，小胶质细胞出现突起回缩和早期活化迹象，并在第3天进展为致密的阿米巴样形态。在24小时时间点，使用Brn3a对视网膜神经节细胞密度进行定量，结果显示培养外植体较假手术组有轻微但显著的下降。TMEM119作为稳态小胶质细胞标志物，在假手术组中高表达，但在体外培养3天后几乎无法检测到。标记玻璃体细胞（hyalocytes）的CD206表达在体外培养3天后保持稳定。GFAP染色显示，在解剖和操作过程中因机械损伤部位周围，星形胶质细胞和穆勒细胞均出现反应性变化。

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生物学

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一个离体研究小鼠视网膜胶质细胞相互作用的外植体模型

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