Name: 氧化铁标记的胚胎干细胞和的hMSCs纳米粒子在体内的跟踪与非侵入性磁共振成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-31T21:32:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 学习利用氧化铁纳米粒子标记人胚胎干细胞和间充质干细胞的方法，通过磁共振成像实现体内无创追踪。该技术为评估新型干细胞疗法提供了重要的可视化工具。

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本项目获得了加州再生医学研究所Leon J. Thal种子基金的资助。Tobias Henning获得了德国研究基金会（DFG，HE 4578/1-2）的研究奖学金支持。我们衷心感谢Juanito Meneses在人类胚胎干细胞培养方面提供的建议。

使用 Ferucarbotran 标记 hMSC
这是一种利用基于氧化铁的磁共振成像对比剂Ferucarbotran标记人源间充质干细胞的技术：
<ol>
<li>首先，在标记操作前18-24小时，将细胞以80%融合度接种于T75培养瓶中。若使用其他培养皿，则相当于每平方厘米约10000个细胞2. </li>
<li>第二天，通过将30 µl Resovist加入8 ml无血清培养基中来制备标记培养基。该培养基可用于标记一个75 cm²培养瓶中80%融合度的细胞，对应铁浓度为100 µg Fe/ml培养基。</li>
<li>吸除培养基，用 PBS 或无血清培养基洗涤细胞一次。此步骤旨在去除可能结合对比剂并影响标记效率的残留血清蛋白及其他培养基成分。</li>
<li>将标记培养基加入培养瓶中，并将培养瓶放回培养箱。</li>
<li>2小时后，加入2 ml FCS，使FCS终浓度达到20%。此步骤旨在确保细胞不会受到诱导分化的刺激，而是在其熟悉的环境中继续生长。</li>
<li>孵育细胞超过18小时，最好过夜进行。</li>
<li>第二天，用 PBS 清洗细胞，然后按照常规方法进行胰蛋白酶消化。 </li>
<li>消化后，细胞悬液需用PBS洗涤3次，以去除培养基中残留的游离对比剂。每次洗涤均通过离心完成。&nbsp;400 rcf 离心 5 分钟。</li>
<li>最终的细胞沉淀可重新悬浮，并可用于后续实验。</li>
<li>此时对细胞进行计数，因为在之前的洗涤步骤中可能已损失部分细胞。同时使用台盼蓝排染法进行细胞活力检测，并取样进行分光光度分析以测定标记效率。 </li>
</ol>
使用 Ferumoxides 标记人类胚胎干细胞
<ol>
<li>首先，按照常规方法将人胚胎干细胞（hESC）接种于10 cm培养皿中。这些培养皿预先包被了明胶，并含有经辐照的饲养层细胞。本方案也可用于无饲养层的培养体系。</li>
<li>让hESC贴壁并生长约3–4天，使其形成中等大小的克隆。在此期间，需注意避免克隆过度生长，因为较大的克隆后续更难有效分散。</li>
<li>分化细胞可能污染这些培养物，因此根据克隆的纯净程度，&nbsp;可能需要通过显微解剖方式去除已分化的细胞区域。</li>
<li>配制标记培养基，其中包含浓度为100 µg/mL的Ferumoxides和完全hESC培养基。具体操作为：将89 µL Ferumoxides与10 mL完全生长培养基混合。</li>
<li>用完全培养基洗涤培养皿一次。</li>
<li>每皿加入10 mL标记培养基，于培养箱中孵育4小时。</li>
<li>此时，标记过程已完成。下一步需洗涤细胞，并获得单细胞悬液以供后续使用。首先用PBS洗涤培养皿一次。</li>
<li>随后，将PBS替换为5 mL 0.25%胰蛋白酶溶液，在培养箱中孵育5分钟，或直至细胞完全脱落。孵育过程中可频繁轻敲培养皿以促进细胞脱落。</li>
<li>细胞现已脱落。需注意，若原培养皿中存在较大克隆，则可能仍有少量细胞团块残留。</li>
<li>为去除这些团块，可用移液管将整个悬液轻轻吹打混合一次，然后静置2分钟。</li>
<li>我们不使用移液枪（Eppendorf pipette），因为反复通过细小枪头吸取细胞可能导致细胞膜破裂。</li>
<li>若仍有残留团块，可将细胞悬液通过40 µm细胞滤网过滤。</li>
<li>若操作正确，此时应获得单细胞悬液，其中混有较多碎片，这些碎片来源于明胶包被层、ESC基质以及死亡细胞。为去除碎片，需将细胞以400 rcf离心5分钟，洗涤两次，并每次重新悬浮于完全培养基中。</li>
<li>接下来，需将ESC与经辐照的饲养层细胞分离。可通过将细胞悬液接种至明胶包被的培养皿中高效实现此步骤。</li>
<li>若不扰动培养皿，所有细胞均会沉降，但饲养层细胞贴壁速度比ESC更快。</li>
<li>因此，在45分钟后收集上清液，其中应主要含有ESC，而饲养层细胞则大多已贴附于培养皿底部。</li>
<li>通过此方法，可获得磁性标记的人胚胎干细胞单细胞悬液，可用于后续实验。</li>
<li>与前述方案相同，此时需对细胞进行计数，并取样以评估细胞活力及标记效率。</li>
</ol>
&nbsp;

<ol><li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Oostendorp, R. A. J., Settles, M., Piontek, G., Metz, S., Heinzmann, U., Rummeny, E. J., Schlegel, J., Link, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+Hematopoietic+Progenitor+Cells+with+MR+Contrast+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Targeting of Hematopoietic Progenitor Cells with MR Contrast Agents.</a> 228, 760-767 (2003).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Piontek, G., Metz, S., Brauer, R., Debus, G., Corot, C., Schlegel, J., Link, T. M., Peschel, C., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Migration+of+iron+oxide+labeled+human+hematopoietic+progenitor+cells+in+a+xenotransplant+model%3A+in+vivo+monitoring+using+clinical+magnetic+resonance+imaging+equipment%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Migration of iron oxide labeled human hematopoietic progenitor cells in a xenotransplant model: in vivo monitoring using clinical magnetic resonance imaging equipment.</a> Radiology. 234, 197-205 (2005).</li>
<li>Henning, T. D., Saborowski, O., Golovko, D., Boddington, S., Bauer, J. S., Fu, Y., Meier, R., Pietsch, H., Sennino, B., McDonald, D. M., Daldrup-Link, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+labeling+with+the+positive+MR+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Gadofluorine+M.+Eur+Radiol%22%5BJournal%5D)">Cell labeling with the positive MR contrast agent.</a> Gadofluorine M. Eur Radiol. 17, 1226-1234 (2007).</li>
</ol>

非侵入性地显示干细胞对于监测几乎所有基于干细胞的治疗至关重要。通过磁共振图像可视化标记干细胞的体内动力学特征，有助于更深入地理解其行为，从而为合理且更有效地应用干细胞疗法提供指导。由于我们采用的是临床适用的对比剂和成像技术，所展示的实验方案可直接转化应用于患者。本方法潜在的临床应用包括对不同类型干细胞或基因工程改造干细胞的移植过程进行比较研究，以及评估治疗干预对干细胞移植效果的影响。这些结果将立即有助于干细胞疗法的临床前评估、相关临床试验的设计，以及后续在临床实践中对干细胞治疗效果的评价。值得注意的是，我们的成像技术同样适用于其他干细胞群体，例如造血干细胞或神经干细胞。

<table><tbody><tr><td>D-MEM 高糖</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>明胶</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td>用 PBS 稀释明胶至终浓度为 0.1 %</td></tr><tr><td>PBS（无钙镁离子）</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-EDTA</td><td>试剂</td><td>Invitrogen</td><td>25200-114</td><td></td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清（FBS）</td><td>试剂</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>细胞滤网（40 &amp;mu;m 尼龙）</td><td>工具</td><td>BD Biosciences</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>Knockout 血清替代物</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>b-巯基乙醇（b-Mercapt&amp;#8211;thanol）</td><td>试剂</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7522</td><td></td></tr><tr><td>非必需氨基酸</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>试剂</td><td>R&amp;D Systems</td><td>233-FB-025</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>试剂</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Ferumoxides (Endorem)</td><td>试剂</td><td>Guerbet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferucarbotran (Resovist&amp;#174;)</td><td>试剂</td><td>Bayer AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

使用氧化铁纳米颗粒标记人胚胎干细胞和人骨髓间充质干细胞以实现磁共振成像无创体内示踪

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

近年来，干细胞研究加深了我们对发育生物学、多种疾病以及其在再生医学中潜在影响的理解。一种能够无创地在活体内重复监测移植干细胞的方法，将极大提升我们解析调控干细胞死亡的机制，并识别有助于改善干细胞植入的营养因子和信号通路的能力。磁共振成像（MR imaging）已被证实是一种可在活体内以接近显微解剖分辨率显示干细胞的有效工具。为了利用磁共振成像检测干细胞，必须使用细胞特异性的磁共振对比剂对细胞进行标记。为此，通常应用氧化铁纳米颗粒，例如超顺磁性氧化铁颗粒（SPIO），因其具有高细胞检测灵敏度和优异的生物相容性。SPIO颗粒由氧化铁核心及右旋糖酐、羧基右旋糖酐或淀粉包被层组成，其作用机制是引起局部磁场不均匀性，从而导致T2加权磁共振图像上的信号降低。本视频将展示利用临床上可用的磁共振对比剂对干细胞进行标记的技术，以便后续通过磁共振成像对标记细胞进行无创的活体追踪。

关键词：干细胞研究，发育生物学，再生医学，无创监测，活体成像，磁共振成像，MR，干细胞追踪，氧化铁纳米颗粒，超顺磁性氧化铁颗粒，SPIO，细胞标记，对比剂，T2加权成像，信号降低，生物相容性，磁场不均匀性

为了评估新的干细胞疗法，重要的是能够以非侵入性方式在活体内追踪注射的细胞。本视频将向您展示如何在活体内用基于氧化铁的对比剂标记人类间充质干细胞和胚胎干细胞，以便随后进行活体磁共振成像。

近年来，干细胞研究加深了人们对发育生物学、多种疾病以及其在再生医学中潜在影响的理解。

欢迎来到哈库·达尔·林克博士的实验室。我们感谢加州再生医学研究所对本项目提供的资助，该项目旨在评估新的干细胞疗法。对注射的细胞进行体内无创追踪非常重要。这可以通过在体外使用针对磁共振成像或光学成像的特异性或多功能对比剂对细胞进行标记来实现。本视频将向您展示如何标记人源间充质干细胞和人源胚胎干细胞，以便后续进行活体成像。大家好，我是来自加利福尼亚大学旧金山分校放射科分子与功能成像中心对比剂研究组的 Tobias Henning。今天我将向您展示使用佩里克（peric）和卡罗纳（carone）对人类间充质干细胞进行体外标记，以及使用菲姆氧化物（phem oxides）对人类胚胎干细胞进行体外标记的操作步骤。该技术可用于在体内定位注射的细胞，或获取有关其功能状态的信息。胚胎干细胞与间充质干细胞的MRI造影剂标记步骤有所不同，但两种技术均包含以下基本流程：细胞培养的准备（即贴壁细胞的接种）、标记培养基的配制、通过简单孵育对干细胞进行标记、胰酶消化干细胞、洗去游离的造影剂、评估标记效率以及细胞活力。那么让我们开始标记一些细胞。首先，我们以使用 Theo Carbatrol 标记间充质干细胞为例。接下来，我将展示如何利用基于铁氧化物的对比剂 theo carron，对人源间充质干细胞进行标记，用于磁共振成像（MR Imaging）。首先，在标记操作前18至24小时，将细胞以80%的融合度接种于T75培养瓶中。或者，若使用其他类型的培养皿，确保次日细胞密度约为每平方厘米10,000个细胞。随后，开始制备标记培养基：将30微升Reservist加入8毫升无血清培养基中。该体系适用于一个融合度为80%的T75培养瓶，对应培养基中铁浓度为100微克/毫升。接着，吸除原有培养基，用PBS或无血清培养基洗涤细胞一次。这样做是为了去除残留的血清蛋白及其他可能结合对比剂并影响标记效率的培养基成分。将标记培养基加入培养瓶中，并将培养瓶放回培养箱。两小时后，加入 2 ml 胎牛血清（FCS），使 FCS 的终浓度达到 20%。我们这样做是为了确保细胞不会受到任何诱导分化的刺激，并使其在熟悉的环境中生长。现在将细胞孵育18小时。第二天，用PBS清洗细胞，然后根据标准的细胞培养操作规程进行处理，以去除游离的对比剂。胰酶消化后，将细胞悬液在400 RCF条件下离心5分钟，用PBS重悬，重复洗涤三次。至此完成。最终的细胞沉淀可重新悬浮，即可用于后续实验。我们现在对细胞进行计数，因为在之前的洗涤步骤中可能已损失部分细胞。同时，我们在此时使用台盼蓝排阻法进行细胞活力检测，并取样进行光谱分析，以测定标记效率。接下来，我将演示如何用酚氧化物标记人类胚胎干细胞。首先，我们将人胚胎干细胞接种于10厘米培养皿中。通常情况下，这些培养皿预先包被有明胶，并含有经辐照处理的饲养层细胞。本方案也可用于无饲养层细胞的培养体系。我们让人类胚胎干细胞贴壁并生长约三到四天，使其形成中等大小的克隆。在此期间，我们确保克隆不会生长过大，因为较大的克隆更难解离。后期，分化细胞可能会污染这些培养物。因此，根据菌落的洁净程度，我们可能需要通过显微解剖去除已分化的培养物。接下来，我们准备标记培养基，该培养基包含四氧化三铁，铁浓度为每毫升100微克，并加入完全的人类胚胎干细胞培养基。具体操作为：将89微升四氧化三铁与10毫升完全生长培养基混合。对于间充质干细胞，我们使用完全培养基洗涤培养皿一次，以去除死细胞或碎片。然后每皿加入10毫升标记培养基，将细胞孵育4小时。此时标记过程即已完成。下一步，我们需要洗涤细胞并获得单细胞悬液。为此，我们首先用 PBS 冲洗培养皿，然后将 PBS 替换为 5 mL 的 0.25% 胰蛋白酶，并在培养箱中孵育 5 分钟，或直至细胞脱落。在细胞已脱离时，可频繁轻敲培养皿。需要注意的是，如果培养皿中含有较大的细胞集落，可能会残留一些团块，需将其去除。我们使用刻度移液管将整个悬液上下吹打混匀，然后静置两分钟。在使用胰蛋白酶时，我们不使用Eppendorf移液器，因为通过细小的吸头反复吹打细胞可能会破坏细胞膜，如果操作正确的话。现在我们得到了单细胞悬液，其中混杂着大量来自包被胚胎干细胞基质的明胶以及死亡细胞的碎片。现在，我们可以通过将细胞悬液经40微米细胞滤筛过滤，以去除残留的细胞团块或复合物。接下来，我们需要将人胚胎干细胞从经辐照的饲养细胞中分离出来。这一步可通过将细胞悬液接种至明胶包被的培养皿中高效实现。如果我们不操作培养皿，所有细胞都会发生沉降，但饲养层细胞的贴壁速度会快于人胚胎干细胞。因此，若在45分钟后移除上清液，其中应主要含有人胚胎干细胞，而饲养层细胞则应主要贴附在培养皿上。通过这种方法，我们可获得磁性标记的人胚胎干细胞单细胞悬液，可用于后续实验，如同前一个实验方案所述。此时，您需要对细胞进行计数，并取样以评估细胞活力和标记效率。以上即为我今天要向您展示的全部实验方案。接下来，让我们看看如何在体内追踪已标记的干细胞。此幻灯片显示了经OC Carone标记的干细胞。将这些细胞注入小鼠脑内时，我们取20,000个细胞重悬于75纳升体积中，并将其注射至脑室下区。植入细胞中的氧化铁会在磁共振成像（MR Images）上产生磁敏感伪影，可被观察到。我们刚刚向您展示了如何标记胚胎干细胞和间充质干细胞。利用Mr.Contrast造影剂在体外标记间充质干细胞和胚胎干细胞，并在体内进行示踪，对于评估新型干细胞疗法具有巨大潜力。以上就是全部内容。感谢观看，祝您的细胞标记实验顺利。

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氧化铁标记的胚胎干细胞和的hMSCs纳米粒子在体内的跟踪与非侵入性磁共振成像

本视频展示了使用荧光染料标记人类胚胎干细胞和间充质干细胞的技术。该技术可用于通过光学成像对移植的干细胞进行体内示踪，并通过荧光显微镜进行组织病理学相关性分析。...

使用荧光染料标记干细胞以实现光学成像的无创检测

在本视频中，我们展示了如何使用氯化锰（MnCl2）标记人类胚胎干细胞（hESC），当细胞处于生物活性状态时，氯化锰可通过电压门控钙通道进入细胞。此外，我们还展示了将MnCl2作为细胞磁共振成像（MRI）对比剂，用于评估hESC的体外存活能力。...

体外标记人胚胎干细胞用于磁共振成像

本演示的目的是展示一种高度可重复的方法，用于在软骨缺损中生成可被磁共振成像（MR成像）可视化的基质相关干细胞植入物。干细胞使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁颗粒Ferumoxides进行标记，与琼脂糖混合后植入软骨缺损区域，并使用7T磁共振扫描仪进行成像。...

植入氧化铁标记的人类间充质干细胞修复软骨缺损

用于评估纳米颗粒在细胞内生物分布的生物成像方法，适用于纳米制剂化合物的治疗和诊断监测。通过组织学共定位分析，本文所述方法具有高灵敏度和特异性。这些方法为从啮齿类动物到人类的应用提供了转化路径。...

用于诊断与治疗监测的纳米材料注册生物成像

我们介绍一种使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁（SPIO）——菲柔莫醇（Feraheme）对干细胞进行标记和追踪的技术。该细胞成像技术利用磁共振（MR）成像进行可视化，可便捷地用于患者干细胞移植成功或失败的长期监测与诊断。...

使用美国食品药品监督管理局批准的氧化铁纳米颗粒 Ferumoxytol 标记干细胞

本文介绍了一种优化的多模态成像流程，用于在啮齿类动物脑内对细胞移植物进行多模态成像，包括：（i）活体生物发光成像与磁共振成像，以及（ii）死后组织学分析。在单个动物上联合使用这些成像方式，可实现对细胞移植物的高分辨率、高灵敏度和高特异性的评估。...

小鼠中枢神经系统干细胞移植的多模态成像

近年来，利用磁共振成像（MRI）进行细胞示踪受到了广泛关注。本实验方案描述了使用富含氟（19F）的颗粒对树突状细胞进行标记、将标记后的细胞体内应用，以及通过19F/1H...

监测树突状细胞迁移的19F / 1H磁共振成像方法

用于再生研究的谐波纳米颗粒

组合使用5种荧光蛋白标记造血干细胞和祖细胞可实现 体内 通过共聚焦和双光子显微镜进行克隆追踪，揭示造血再生过程中骨髓造血结构的动态变化。该方法可在移植后长期、非侵入性地对光谱编码的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）来源的细胞在完整组织中进行命运图谱绘制。<br...

体内 克隆追踪标记有五种荧光蛋白的造血干细胞与祖细胞：基于共聚焦与多光子显微镜技术

靶向细胞递送在多种生物医学应用中具有重要意义。本实验方案旨在利用超顺磁性氧化铁纳米颗粒（SPION）标记细胞，从而实现磁性细胞靶向，以高度可控的方式进行细胞递送与定位。...

使用超顺磁性氧化铁纳米颗粒进行细胞标记与靶向

本文介绍了一种在创伤性脑损伤小鼠模型中进行非侵入性间充质干细胞（MSC）递送与示踪的实验方案。采用超顺磁性氧化铁 纳米颗粒作为磁共振成像（MRI）探针，对MSC进行标记，并通过实时MRI技术在经鼻递送后实现非侵入性的活体示踪。...

通过鼻内递送后利用磁共振成像追踪超顺磁性氧化铁标记的间充质干细胞在创伤性脑损伤小鼠模型中的分布

学习利用氧化铁纳米粒子标记人胚胎干细胞和间充质干细胞的方法，通过磁共振成像实现体内无创追踪。该技术为评估新型干细胞疗法提供了重要的可视化工具。

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