Chromobacterium violaceum 中紫色杆菌素的定量及其被生物活性化合物的抑制

我们的研究旨在鉴定能够抑制群体感应的化合物，该过程调控着关键的表型特征。本实验方案用于筛选在不影响细菌生长的前提下减少紫色杆菌素产生的分子，从而提示其具有干扰群体感应的潜力。近期研究已鉴定出多种新型生物活性化合物，这些化合物可在不影响细菌生长的情况下抑制群体感应，进一步支持其作为抗毒力因子用于应对耐药菌感染的潜力。

主要挑战包括群体感应抑制的特异性，因为化合物可能影响细菌的生长或其他性状。在本方案中，称为差异与溶解度影响平衡定量，需要谨慎操作。我们建立了一种在亚抑制浓度下用于生物活性化合物的方案，该浓度不会影响细菌生长。

这是启动群体感应信号研究与抗菌研究不同的一个关键前提。我们将重点鉴定新的群体感应抑制剂，并阐明其对通讯机制的抑制作用，特别是在与食品和健康相关的细菌中。首先，在5毫升Luria Bertani（LB）肉汤培养基中培养一株粘质沙雷氏菌ATCC 12472。

将培养物置于30摄氏度、220转/分钟的摇床培养箱中培养24小时。使用LB肉汤测定过夜培养物的光密度，并将其调整至约1 × 10⁸ 菌落形成单位/毫升。

进行化合物配制时，称取生物活性化合物，并根据其溶解度，用纯DMSO或DMSO与水1:1的混合液进行稀释。取平底96孔板，按照倍比稀释方案，向各孔中加入LB培养基和生物活性化合物。为计算每孔所需母液的体积以达到目标浓度，请应用以下公式。

在每组谷物稀释液的第一列中，向第三、第五和第七列加入 196 微升的LB肉汤。随后在用于稀释的后续各列中，向第四、第六和第八列加入 100 微升的LB肉汤。

开始梯度稀释时，向每组的第一个孔中加入 4 微升生物活性化合物，对应第 3、5 和 7 列。混匀后，从每个孔中转移 100 微升至相邻的下一列，继续进行梯度稀释，直至第 4、6 和 8 列。

每种化合物在每个浓度下均需使用新的枪头重复整个实验三次，以避免交叉污染。在所有孔的B至D行中加入80微升的LB肉汤，使每孔总体积达到180微升。

然后根据分光光度计的兼容性，向每个孔中加入20 µL上一步制备的标准紫色色杆菌（Chromobacterium violaceum）培养液，使最终体积达到200 µL。用微孔板盖或密封膜盖住微孔板，以防止蒸发。

将密封的培养板在30摄氏度、130转/分钟振荡条件下孵育24小时。孵育结束后，将培养板转移至设定为60摄氏度的干燥培养箱中。打开盖子，使其完全干燥，约需八小时。

干燥后，从培养箱中取出培养板，向每孔加入 200 µL 纯 DMSO。盖好培养板，在 25 °C、130 rpm 振荡条件下孵育 30 分钟，以溶解紫色素。孵育结束后，小心将 100 µL 溶解后的紫色素溶液转移至新的微孔板中。

避免移液枪枪头与孔板孔壁接触。使用酶标仪在595纳米波长下测定紫色素的吸光度，检测时保持盖子盖上以避免污染。每次读数前振荡5秒，并在盖上盖子的条件下进行读数以避免污染。

为计算紫色杆菌素的产量，首先从每个样品的吸光度中减去空白对照的吸光度，以排除背景干扰，然后使用未处理对照作为参考，通过公式计算紫色杆菌素的百分比。测试了三种生物活性化合物——白藜芦醇、法尼醇和芳樟醇——对野油菜黄单胞菌 ATCC 12472 紫色杆菌素产生的抑制能力。与未处理对照组的 100% 相比，法尼醇在 200 微克/毫升浓度下显著将紫色杆菌素的产量降低至 9%，在 100 微克/毫升浓度下降低至 19%。

在200和100微克/毫升浓度下，香叶醇处理均导致紫罗兰素产量为对照组的32%，相对于对照组抑制率达68%。白藜芦醇在25微克/毫升时使紫罗兰素产量降低至15%，在12微克/毫升时降至30%，而未经处理的对照组为100%。微孔板图像直观证实，所有处理组的紫罗兰素色素沉着均较未经处理的对照组减少。