Name: 多模态广域傅里叶变换拉曼显微镜 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-30T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: 学习多模态广域傅里叶变换拉曼显微镜技术，实现快速并行采集拉曼和光致发光光谱。该方法采用双折射干涉仪，可在约5毫秒每像素的速度下获得约23 cm⁻¹的光谱分辨率，有效分离微弱拉曼信号与强荧光背景，适用于神经科学和材料科学等领域的高通量光谱成像研究。

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G.C. 感谢欧洲联盟玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动计划 ENOSIS H2020-MSCA-IF-2020-101029644 项目以及欧洲联盟“地平线欧洲”（HORIZON）研究与创新计划下玛丽·斯克沃多夫斯卡-居里行动 PIONEER（资助协议编号 101066108）提供的支持。G.V. 和 G.C. 感谢欧洲联盟“下一代欧盟”计划通过 IPHOQS 基础设施 [IR0000016，ID D2B8D520，CUP B53C22001750006] &#34;光子学与量子科学综合基础设施计划&#34; 提供的支持。

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 样品制备
警告：制备过程中需佩戴乳胶手套，因为硫化镉（CdS）颜料具有毒性，尤其是吸入时更为危险。
<ol>
	<li>使用刮刀将每种颜料粉末各 20 mg 置于精密天平上，获得 1:1:1 的质量比例。 
	注意：每次取样后需仔细清洁刮刀尖端，以避免交叉污染。</li>
	<li>用研钵混合粉末，以去除结块。</li>
	<li>将混合后的样品倒入显微镜载玻片上；用刮刀尖轻轻按压，使样品层接近均匀厚度。</li>
	<li>在显微镜盖玻片的边缘涂抹指甲油。将盖玻片放置在样品上，指甲油面朝下，施加适当压力以密封样品。静置数秒，使指甲油固化。</li>
</ol>
2. 显微镜设置
警告：激光开启时请佩戴安全护目镜，因为样品平面上可达到的最大功率为 300 mW。
注意：只要泵浦激光器在数据手册规定的温度范围内工作（例如，本文报道的激光器为10–40 °C），其性能不受温度变化的影响。 材料表).
<ol>
	<li>将TWINS干涉仪沿显微镜的检测光路进行对准。 
	注意：如Candeo等人17所述，干涉仪模块必须安装在管镜与探测器之间，并确保二者之间保持适当距离。对于本研究中使用的显微镜，只有在移除目镜模块时才能满足该条件。</li>
	<li>为将科勒照明系统适配至激光激发，需移除显微镜内置的激发光源，并使用显微物镜收集大芯径多模光纤输出端的光。 
	注意：当光纤端面与样品平面共轭时，物镜的放大倍数决定了照明图案的大小。可选方案之一是使用10倍、数值孔径0.25–0.30的物镜。</li>
	<li>选择激发波长，并将激发激光聚焦至大芯径多模光纤的输入端。打开相机并运行可视化软件。
	<ol>
		<li>将光纤中段固定于音圈的振动膜上，以消除散斑效应。通过紧密弯曲光纤实现机械扰模，使所有空间模式充分混合。开启激光器。</li>
		<li>准备用于对准的测试样品，例如载玻片上的荧光红色标记条带。</li>
		<li>使用精密平移台移动光纤，调节光纤端面相对于照明光学系统的位 置，使样品平面上的光斑具有均匀的强度分布和清晰的边缘。 
		注意：所有报道的测量均采用532 nm激光。使用芯径为400 µm的光纤时，光斑直径覆盖相机视场宽度的82%。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在激发和检测光路中使用滤光片组，遵循以下准则（补充图2）：
	<ol>
		<li>使用中心波长为532 nm、带宽为2.0 nm的窄带通滤光片，以净化激光线并抑制光纤传输过程中因非线性展宽产生的泵浦边带。</li>
		<li>使用二向色镜（DM，见图1）将激光反射至样品，同时透射物镜收集的红移背向散射光。</li>
		<li>使用截止波长为532 nm的长通滤光片（LPF，见图1）以滤除残余的激发光。</li>
		<li>在进行拉曼散射测量时，使用截止波长为600 nm的短通滤光片（SPF，见图1）以抑制背景荧光。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用功率计测量样品平面上的光功率。将泵浦光束衰减至样品表面的光强不致造成损伤的程度（如表1所示，约为2 W/cm2）。在设置其他测量参数时，使用激光快门控制光路通断。 
	注意：由于自发拉曼散射的截面很小，需要较高的功率密度以增强信号采集。然而必须考虑样品的损伤阈值。与点扫描系统不同，宽场照明会照射较大区域，导致散热效率降低，因此需谨慎管理光功率以避免样品损伤。</li>
	<li>将样品置于显微镜载物台上，并调节焦距。 
	注意：为便于快速找到焦点，可先使用白光灯以透射或反射模式照明样品。在反射模式下，可在显微镜旁放置一个白炽灯作为光源。随后将使用泵浦激光进一步优化样品的焦平面。</li>
</ol>
3. 测量参数
<ol>
	<li>开启执行楔形板平移的电机驱动器。同时控制硬件组件（相机和电机）以进行高光谱测量（用户界面示例如补充图3所示）。</li>
	<li>设置相机采集参数、曝光时间及硬件 binning，以优化信号强度，遵循以下指导：
	<ol>
		<li>由于时间信号中较高的信噪比（SNR）可带来重建光谱中较高的信噪比，因此优先选择较长的曝光时间，以更好地充分利用传感器的动态范围。 
		注意：对于信号较弱的情况（如拉曼散射），需在信号水平与总测量时间之间取得平衡：最长曝光时间可能不可行。</li>
		<li>选择硬件 binning 模式，以便在读出前从更多像素中收集电荷。 
		注意：在读出前对电荷进行累加并执行单次读出，其噪声性能优于分别读出多个像素后再在后期处理中对其信号求和。binning 的选择还需考虑可接受的空间分辨率降低程度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>根据以下标准选择扫描参数、总扫描长度和采样步长：
	<ol>
		<li>为实现拉曼峰的高光谱分辨率，设置非对称长程楔形板平移（-2526 fs → -36 fs）。相反，为获取光致发光（PL）信号更宽的宽带光谱特征，应在零延迟位置附近进行对称扫描（-65 fs → 65 fs）。</li>
		<li>利用公式1，将延迟τ表示为楔形板平移x的函数，选择采样步长以满足目标光谱带宽的奈奎斯特极限。 
		注意：给定光谱的最小波长 λmin，应满足（公式2）。 
		<img alt="与光学分辨率极限相关的衍射极限公式 Δx ≤ λmin/2sinαΔn。" src="/files/ftp_upload/68515/68515eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式2"> 
		其中双折射率Δn是波长的函数（参见Sellemeier方程）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>打开快门，使激光照射样品。若观察到信号强度下降，请等待样品达到稳态（通常数秒）。 
	注意：为补偿信号强度的下降，可调整 binning 和曝光时间，以维持良好的信噪比。</li>
	<li>开始对每个楔形板位置采集一幅单色图像，即来自2D传感器各点的复制光束之间的时间延迟。 
	注意：采集软件应保存两个变量：时间超立方体（2D图像集）和扫描过程中编码器记录的电机位置向量。</li>
	<li>测量完成后，关闭激光器并开始数据分析。</li>
</ol>
4. 所获取数据立方体的处理
<ol>
	<li>根据以下说明，从采集的数据集生成光谱超立方体：
	<ol>
		<li>加载针对特定步进电机的电机位置校正文件（参见讨论部分）。</li>
		<li>加载针对特定干涉仪的频率校准文件，以将测量的空间频率（伪频率）与真实光学频率相关联（参见讨论部分）。</li>
		<li>选择将通过傅里叶变换所有像素的干涉图所计算的光谱频率范围。</li>
		<li>在可用的加窗函数12中，选择一种在光谱展宽与降低伪影之间具有良好权衡的函数，例如 Happ-Genzel（Hamming）窗，用于对测量的干涉图进行加窗处理。</li>
		<li>通过对所有像素的加窗干涉图进行傅里叶变换生成光谱超立方体。以复数形式保存。 
		注意：傅里叶变换得到的复数光谱包含额外信息，可用于对数据集去噪，并提取选定像素组的平均光谱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在计算出光谱超立方体后，进行多种分析，例如：获取选定区域的平均光谱；生成伪彩色 RGB 图像；绘制光谱峰分布图；扣除背景。</li>
	<li>为降低可能掩盖显著峰的光谱噪声（尤其在拉曼光谱中），按照以下步骤实施奇异值分解（SVD）18：
	<ol>
		<li>将时间域超立方体重构为矩阵 A，其行对应各干涉图。</li>
		<li>对矩阵进行奇异值分解，得到矩阵 U、S 和 V，使得 A = USVT。 
		​注意：U 的列是 V（列向量）特征向量的空间分布，而 S 是按降序排列的奇异值（SV）的对角矩阵。</li>
		<li>将 U 的每一列重构成像素矩阵，并对其执行二维傅里叶变换，以获得其空间频率。</li>
		<li>由于高频成分通常与图中剧烈变化相关，可将其视为噪声；在计算得到的傅里叶空间中定义一个中心对称的方形区域，用以区分低频（主要为信号）和高频（主要为噪声）成分。 
		注意：该区域边长可取傅里叶空间尺寸的 1/4 作为参考。</li>
		<li>通过将边界内像素强度（复数模）之和除以边界外强度之和，计算每个奇异值的空域信号比（SSR）。绘制 SSR 随奇异值序号变化的曲线。</li>
		<li>设定 SSR 阈值，即保留显著奇异值的数量，以减少数据集中噪声贡献并避免伪影。 
		注意：SSR 通常随奇异值数量增加而下降，随后趋于平缓形成平台。经验法则是保留至平台起始点之前的奇异值。</li>
		<li>将对角矩阵 S 中低于阈值的所有奇异值设为零，得到去噪后的 Sdenoised，并计算去噪后的时间域超立方体 USdenoised VT。 
		注意：SVD 是一种矩阵分解方法，也可应用于重构成行表示光谱（而非干涉图）的光谱超立方体矩阵。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用去噪后的时间域超立方体重复步骤 4.1–4.2，以恢复光谱。</li>
	<li>从参考文献19提供的链接下载程序，使用多元曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）算法对数据集进行深入分析。 
	注意：软件开发者提供了该算法的详细说明20。这是一种用于解决混合物分析问题的迭代方法：每个光谱被表示为纯光谱轮廓的线性组合。以矩阵形式表示为：B = C RT+E，其中 B 为数据集，C 包含各光谱的浓度，R 的列为组分的参考光谱，E 表示误差。
	<ol>
		<li>将光谱超立方体重构为 Npix × Nfreq 矩阵，其中 Npix 为总像素数，Nfreq 为频率向量长度。</li>
		<li>选择样品中预期的组分数目，并加载其参考光谱。 
		注意：参考光谱可分别对每种色素单独测量。否则，程序将对数据集进行 SVD，并以与所选组分数目相同的主成分作为初始估计。</li>
		<li>选择约束条件：反演得到的光谱轮廓必须非负，且尽可能接近参考光谱。</li>
		<li>绘制每种组分的浓度分布图（C 的列重构成图像）和光谱图（R 的列）。</li>
		<li>导出这些分布图，并用于生成伪彩色图像（图 4A），完成分析。 
		注意：本文所用分析程序未公开发布，但可根据请求向作者索取。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Dicker, D. T., Lerner, J. M., El-Deiry, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperspectral+image+analysis+of+live+cells+in+various+cell+cycle+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Hyperspectral image analysis of live cells in various cell cycle stages.</a> Cell Cycle. 6 (20), 2563-2570 (2007).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。

一种宽场傅里叶变换多模态显微镜已被用于获取自发拉曼散射和发光图像，并适用于材料科学领域。Candeo 等人17展示了其在生物样品中的适用性，&#160;提供了染色人源细胞的高光谱荧光图像。该领域拉曼散射测量的主要挑战是防止因广泛照明区域散热效率低而导致的光损伤。一种可能的解决方案是采用更长的激发波长（例如，&#160;785 nm）以减少光功率吸收，但其缺点是会降低拉曼散射截面。另一种方法是使用水浸物镜，以提高散热效率。
多模态性是时域方法的内在特性。它使得采样策略能够根据所研究的信号（光致发光或拉曼散射）进行选择。为了说明这一概念，回顾傅里叶变换操作的两个性质（见图6）：（1）信号的光谱带宽与其自相关函数（干涉图）的持续时间成反比；（2）由于傅里叶变换算子的线性性质，多个信号线性组合的干涉图等于各个信号对应干涉图的组合。由此可知，持续时间较长的干涉图振荡对应于较窄的光谱特征，而零延迟附近早期的振荡主要来源于宽带光谱成分。因此，仅对干涉图尾部进行采样即可获取关于拉曼峰的信息，...

光谱成像是一种同时提供光谱信息和空间信息的技术，已广泛应用于从显微成像1到遥感2等多个领域。多光谱成像与高光谱成像的区别在于：前者对二维传感器的每个像素仅记录若干离散的光谱波段，而后者则记录连续光谱。拉曼成像是光谱成像的一种特定实现方式。
拉曼散射显微技术是一种用于测量系统振动频率 νR 的强大方法。振动模式与化学键相关，因此拉曼光谱3 可用于研究生物4 和材料科学5 中样品的化学组成。在自发拉曼光谱中，样品被频率为 ν0 的单色辐射照射，该辐射称为 泵浦光。部分泵浦光与振动模式相互作用后可能发生非弹性散射，产生频率为 νS (νAS)=ν0-(+) νR 的光子，其中 νR 是样品内分子的振动频率。能量较低的散射光（νS）称为斯托克斯辐射，而能量较高的散射光（νAS）称为反斯托克斯辐射。在热平衡状态下，大多数分子处于较低能级，因此反斯托克斯信号远弱于斯托克斯信号。基于这一原因，拉曼散射显微技术通常检测斯托克斯光子。由于分子和固体具有多种振动模式，拉曼光谱呈现出多个不同的谱带，这些谱带共同构成独特的化学指纹，可用于材料的识别与分析。该方法的主要挑战在于自发拉曼散射的截面极小，每 109–1012 个光子中仅有一个会发生此类散射过程。
在拉曼散射显微镜的标准配置中，激发光被紧密聚焦于样品的某一点。通过光谱滤光片剔除弹性散射的泵浦光子后，收集剩余的光并利用频域光谱仪（例如色散光栅）进行表征；这类设备的光谱分辨率可达到约 ~0.5–1 cm-1。通过一种称为点扫描或光栅扫描6的方法，对样品视场（FOV）内的每个点(x,y)重复进行测量。该方法存在两个主要问题：（1）由于自发拉曼散射的截面较小，通常需要较长的积分时间（0.1–1 秒）才能为光谱仪的每个像素收集到足够的光子，因此对较大面积样品进行拉曼成像可能需要很长的测量时间；（2）泵浦光激发还会产生光致发光（PL），其信号与自发拉曼信号重叠，并常常会掩盖拉曼信号。
为了提高采集速度，可以采用线扫描7方法，其中泵浦光被聚焦在视场（FOV）的一条线上（例如坐标x处），收集到的信号（光致发光或拉曼散射）由带有二维传感器的光谱仪进行色散，从而对给定的坐标x生成一个二维数据集，其中一个轴对应光谱，另一个轴对应空间坐标y。然而，这种实现方式仍然存在显著的光损失，这是由于光谱仪的入射狭缝造成的：狭缝宽度越窄，光谱分辨率越高，但同时也限制了收集到的光通量。
宽视场配置可更有效地减少测量时间：该方法通过同时照射样品的较大区域，并利用二维传感器对所有像素同步采集光谱。此时，可通过在单色成像相机前使用一组带通滤光片8 或可调谐光谱滤光片9 来获取光谱信息。此外，该方法基于频域技术，仅能采集有限数量的离散光谱波段。
测量光谱的另一种方法是傅里叶变换（FT）法。这是一种基于维纳-辛钦定理10的时域技术，该定理指出，信号的功率谱密度是其时间自相关函数的傅里叶变换。在光学中，这一原理通过使用干涉仪产生波形的两个延迟副本在实验上实现。探测器测量这两个副本随相对延迟变化的干涉信号，从而得到所谓的干涉图11。傅里叶变换法被广泛应用于红外光谱区域的光谱测量，该技术称为傅里叶变换红外光谱法（FTIR）12。FTIR 常用于测量中红外波段（波长约 2.5−25 µm）内振动跃迁的吸收光谱。
与传统的色散型光谱仪相比，时域傅里叶变换（FT）方法具有一些优势：由于无需狭缝，因而具有更高的通量（雅克尼奥通量优势12）；其光谱分辨率灵活，仅取决于扫描范围。此外，该方法非常适合宽场配置：事实上，当使用二维探测器时，该方法可并行地为每个像素测量一个干涉图，从而实现对所有像素连续光谱的同步记录。然而，傅里叶变换成像系统必须满足两个具有挑战性的要求：（1）两束光复制光束之间的相对延迟必须控制在光学周期的极小分数范围内；（2）在单个像素内发生干涉的光线之间的相位偏移必须受到限制，以保证良好的相干性，从而获得高对比度。已有研究提出基于共路13,14或近共路15干涉仪的一些解决方案，但这些方案往往结构复杂，或光谱分辨率低于100 cm-1。
本研究介绍了一种新型宽场显微镜，可实现光致发光和拉曼散射成像。该系统的核心创新部件是一个紧凑且超稳定的共路双折射干涉仪，称为基于平移楔的相同脉冲编码系统（Translating-Wedge-based Identical pulses eNcoding System, TWINS）16。该装置可在数百个光周期范围内进行延迟扫描，相位精度达到光周期本身的一小部分，并具有高稳定性。两个光复制脉冲具有正交偏振态，并沿同一共路共线传播，因此不受双光束干涉仪中典型的光程长度波动影响。如图1插图所示，该方案由两块光学轴正交的双折射晶体组成：其中一块（B2）长度固定，另一块（B1）被分割为两个楔形部分，可沿共同的斜边方向移动。入射光经起偏器P1偏振至与双折射晶体光轴成45°角，使一半光能量沿寻常偏振方向传播，另一半沿非寻常偏振方向传播。当两束正交分量在双折射晶体块中传播时，会积累相对延迟，通过调节楔形部分的插入深度来改变B1块的总厚度，从而精细调节该延迟量。第二个偏振片P2将两束场分量投影到同一线性偏振方向，使其发生干涉。复制光脉冲之间的延迟τ随楔形部分沿共同斜边的位移x变化，关系如下（公式1）：<img alt="静态平衡方程 τ=(xsin(α)Δn)/c；在物理学中相关，数学公式。" src="/files/ftp_upload/68515/68515eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="公式 1">，其中c为光速，α为楔形部分的顶角，Δn = ne - no为寻常与非寻常折射率之差（即双折射率）。由于光谱分辨率Δv与扫描范围T = |T2 - T1|成反比，其中T1、T2分别为干涉图的初始和最终延迟，拉曼光谱所需的高光谱分辨率要求使用高双折射材料并实现长距离楔形位移。在常见的双折射晶体中，YVO4（正钒酸钇）因其在可见光至近红外波段具有高Δn值和良好的透光性而尤为适用。楔形部分设计为10°顶角，当扫描长度为15.3 mm时，干涉仪可在600 nm波长下引入2500 fs的延迟，从而在整个目标光谱范围内（上限由硅基相机灵敏度决定）实现23 cm-1的光谱分辨率。本文将阐述如何合理设置干涉图的采样参数（即步长和扫描范围），以达到所需的光谱分辨率，并有效处理宽带背景信号，实现拉曼信号与光致发光信号的分离。
如 Candeo 等人17所述，该双折射光谱仪可与商用光学显微镜耦合，以进行高光谱测量。所需组件如下：可重构的光学显微镜主体、TWINS 双折射干涉仪、低噪声单色相机（例如 CCD 或 sCMOS）以及窄带激光光源。对于后者，拉曼和荧光光谱常用的激发波长包括 355 nm、488 nm、514 nm、532 nm、633 nm 和 785 nm。尽管高光谱纯度的激光器（如材料表中所列）是最佳选择，但由于仪器的光谱分辨率有限，线宽较宽的激光器（例如约 0.1 nm）也可使用。通过将 TWINS 安置于检测光路中、管镜与单色探测器之间，可实现显微镜的升级。该配置可在视场范围内提供均匀的光程延迟，平均对比度达 55%。激发光路设计旨在实现样品的均匀照明：实际操作中，将大芯径多模光纤输出端成像于样品平面。通过使用机械扰模器，光纤芯中各模式被强烈耦合，从而在样品平面上产生平顶光强分布。此外，振动音圈可平均化单色辐射特有的散斑图案。该平顶照明的表征结果见补充图 1。激发光束由无限远校正物镜聚焦至样品，并由同一物镜收集返回的拉曼散射光和发光信号，送入检测光路。用于抑制激发光的滤光片配置将在下文详述。
为了展示如何利用该高光谱显微镜测量宽带和窄带光谱特征，本实验选择了一种具有代表性的测试样品，分别测量其发光和拉曼散射信号。样品由三种已知拉曼光谱的粉末颜料混合而成：两种二氧化钛（TiO2）的同质多象变体，即金红石型和锐钛矿型，以及硫化镉黄色颜料（CdS）。然而，该方法同样适用于从材料科学到生物学的更广泛领域。
本文的目的是介绍执行高光谱测量的步骤，而TWINS干涉仪的组装与校准则由Candeo等人详细描述17。因此，感兴趣的实验人员应从基于该技术的预组装干涉仪开始。
该方案从样品制备开始，介绍如何设置显微镜以激发并收集拉曼散射和光致发光（PL）光子。随后，根据待测信号的要求设定扫描参数（扫描长度、采样步长）和采集参数（曝光时间、硬件 binning）。最后，将介绍后续处理流程，详细说明如何从采集到的时间序列数据集（时间超立方体，图 2A）中提取每个像素点的光谱信息（光谱超立方体，图 2B），并概述用于降噪和高级光谱分析的算法。整个工作流程如图 3所示。

<table><tbody><tr><td>锐钛矿</td><td>Kronos</td><td>1200</td><td>白色TiO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;颜料的同质多象变体</td></tr><tr><td>硫化镉粉末</td><td>Kremer Pigmente GmbH &amp; Co.</td><td>21060</td><td>镉黄，色标深色/PY35</td></tr><tr><td>相机</td><td>Andor</td><td>Luca R</td><td>电子倍增CCD相机，像素为1004×1002，每个像素尺寸为8&amp;micro;m × 8&amp;micro;m</td></tr><tr><td>滤光片（净化用）</td><td>Semrock</td><td>LL01-532-12.5</td><td>&amp;Oslash;1/2&quot;，在532 nm处带宽为2.0 nm（FWHM）的激光线滤光片</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>BRAND GmbH &amp; Co</td><td>4700 55</td><td>硼硅酸盐玻璃显微镜盖玻片，尺寸为22×22×0.15 mm</td></tr><tr><td>二向色镜</td><td>Semrock</td><td>Di02-R532-25x36</td><td>25.2×35.6 mm单边激光二向色分光镜，工作波长为532 nm</td></tr><tr><td>光纤</td><td>Thorlabs</td><td>M74L05</td><td>纤芯直径400&amp;micro;m，数值孔径NA为0.39的多模光纤</td></tr><tr><td>激光器</td><td>Hubner Photonics</td><td>Cobolt Samba 1000</td><td>连续波二极管泵浦激光器，波长532 nm，最大输出功率1000 mW</td></tr><tr><td>长通滤光片</td><td>Semrock</td><td>LP03-532RU-25</td><td>在532 nm处具有超陡长通边缘的滤光片</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica</td><td>DMRBE&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>三目研究型显微镜&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Leica</td><td>PL-FLUOTAR, 10x/0.30</td><td>激发与信号收集用物镜，放大倍数10倍，数值孔径0.3</td></tr><tr><td>物镜</td><td>Newport</td><td>M-10X</td><td>照明光路中的物镜，放大倍数10倍，数值孔径0.25</td></tr><tr><td>金红石</td><td>Kronos</td><td>2900</td><td>白色TiO&lt;sub&gt;2 &lt;/sub&gt;颜料的同质多象变体</td></tr><tr><td>短通滤光片</td><td>Thorlabs</td><td>FESH600</td><td>&amp;Oslash;25.0 mm短通滤光片，截止波长600 nm</td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Marienfeld</td><td>1000612</td><td>76×26×1 mm显微镜载玻片</td></tr></tbody></table>

一种多模态宽场傅里叶变换拉曼显微镜

A Multimodal Wide-Field Fourier-Transform Raman Microscope

拉曼显微技术是一种用于确定样品化学成分的强大方法。当前主流的自发拉曼显微镜基于点扫描频率域检测，其主要挑战在于获取大面积拉曼图谱时通常需要较长的像素驻留时间（0.1–1 s），导致效率低下。本文介绍的宽场傅里叶变换（FT）显微镜可实现对大尺寸样品的快速测量，空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23 cm-1。该系统基于一种超稳定且紧凑的共路双折射干涉仪，可集成于商用显微镜的检测光路中，实现二维探测器所有像素点光谱的并行采集，显著缩短测量时间（比传统方法快10–100倍）。这种时域方法还有效解决了频率域技术的另一局限性，即从光致发光背景中分离拉曼信号——在某些情况下，拉曼信号可能被淹没在强烈的荧光背景中。本实验方案详细描述了如何在升级后的商用显微镜上进行高光谱测量，包括照明光路的调节、测量参数的选择标准，以及光谱数据的提取与分析方法。

图4A展示了粉末混合物选定区域的拉曼成像图。该图是通过MCR-ALS方法获得的丰度分布图的伪彩表示，具体方法如步骤4.5所述。由于在视场内可清晰区分三种物质，因此该图提供了有关样品组成的信息。图4B展示了在成像图选定区域内获得的平均光谱，其光谱分辨率为23 cm-1，由所选扫描长度决定。所用滤光片组允许测量105–2130 cm-1范围（补充图2），但仅展示285–750 cm-1范围，因为该范围内包含用于物质鉴别的主要峰。与文献中的参考光谱21,22相比，每种颜料的特征峰均可识别（以垂直虚线标示），但由于各物质位置接近甚至重叠，存在交叉污染现象。未显示金红石相在144 cm-1处的峰，因其强信号会扩散至锐钛矿区域，因而无法有效区分这两种同质多象变体。这可能归因于两种粉末不同的拉曼散...

基于紧凑且超稳定的双折射干涉仪的宽场傅里叶变换显微镜，可对二维探测器的所有像素并行采集光谱。该时域方法能够分离光致发光信号与拉曼信号，并实现快速拉曼成像（约5毫秒/像素），空间分辨率约为1 µm，光谱分辨率约为23 cm-1。

拉曼显微技术是一种用于确定样品化学成分的强大方法。当前最先进的自发拉曼技术面临的主要挑战是……

我们开发了一种多模态高光谱显微镜，可从图像的每个像素获取拉曼或光致发光光谱，从而缩短测量时间。传统的逐行扫描方法依赖于色散光谱仪。先进技 术通过使用共振光或同步的短激光脉冲来增强拉曼信号，这些脉冲可驱动分子振动。较低的拉曼散射截面带来了两个主要挑战。首先，信号微弱，需要较长的采集时间。其次，拉曼信号可能被强烈的光致发光背景所掩盖。傅里叶变换光谱技术能够实现所有像素的并行光谱采集，从而加快测量速度，并可通过可调采样获取特定的光谱信息，例如从强烈的发光背景中分离出微弱的拉曼峰。傅里叶变换方法支持智能采样和数据分析，可充分利用时间轨迹中的信息。我们的目标是定制欠采样策略，以进一步缩短采集时间。首先，使用刮刀将每种色素粉末各20毫克置于精密天平上，以获得1:1:1的重量比例。用研钵混合粉末以去除结块。将所得混合物倒入载玻片上。然后，使用刮刀尖端轻轻按压，使该层接近均匀的厚度。在显微镜盖玻片的边缘涂抹指甲油，将盖玻片有指甲油的一面朝下放置在混合物上，并施加足够的压力以密封。接下来，设置激发波长，并将激发激光聚焦到大芯径多模光纤的输入端。将测试样品放置在显微镜载物台上，打开相机以观察激光照射的光斑。将光纤的中段连接至音圈的振动膜上，以消除散斑。通过紧密弯曲光纤，机械地扰乱其所有空间模式。插入中心波长为532纳米、带宽为2.0纳米的窄带通滤光片，以净化激光谱线并滤除任何不需要的泵浦光谱旁带。使用二向色镜将激光反射至样品，同时使物镜收集的红移背向散射辐射透射通过。在532纳米处插入一个长通滤光片，以滤除残余的激发光。使用功率计测量样品平面上的光功率。调节泵浦光束，使样品处的光强不会导致样品损伤。现在，将样品放置在显微镜载物台上并调节焦距。打开执行楔形平移的电机驱动器，然后按下采集选项。接着，设置相机采集参数，如时间帧和硬件二乘二合并，以优化信号强度。现在，设置步长、参考位置和步数。输入目录名称和文件名。将十字点移动到目标位置，然后单击“测量”以开始采集每个楔块位置的单色图像。测量完成后，在进行数据分析前先关闭激光器。接下来，通过加载针对步进电机的电机位置校正文件以及对应于干涉仪的频率校准文件，从采集的数据集生成光谱超立方体。设置光谱的波长范围，对所有像素的干涉图进行傅里叶变换以计算光谱。应用一种在光谱展宽与伪影抑制之间具有良好折衷效果的切趾函数，例如 Happ-Genzel 窗函数。然后生成光谱超立方体，并以复数形式保存。启动分析软件，并以复数形式打开光谱超立方体。生成伪彩色RGB图像，并获取选定区域的平均光谱以分析光谱超立方体。对于同一视场的拉曼测量，在检测光路中添加一个带通滤光片。设置时间范围和硬件二分法，然后设置步长、起始位置和步数。在按下“测量”之前，选择文件名和保存目录。根据拉曼光谱特征，视野中可清晰区分出三种颜料：金红石在454和616 cm⁻¹处具有特征峰，锐钛矿在396、514和641 cm⁻¹处具有特征峰，而铬黄在301和605 cm⁻¹处具有特征峰。而在光致发光图中，铬黄是唯一在视野中明显分布的颜料，其强发射信号主导了整幅图像。事实上，金红石和锐钛矿的微弱缺陷发射在光谱上无法与黄色粉末区分开来。

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一种多模态宽场傅里叶变换拉曼显微镜

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