Name: 体外 相分离的巨型单层囊泡 （GUV） 内细胞骨架网络的重建 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: 学习在相分离巨型单层囊泡内重建细胞骨架网络的方法，利用脂质混合物和离心技术封装FtsZ和肌动蛋白等生物分子，为合成细胞系统中细胞骨架动力学研究提供新见解。

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作者感谢马克斯·普朗克生物化学研究所核心设施在蛋白质纯化方面的协助，感谢Michaela Schaper在质粒克隆方面的帮助，感谢Kerstin Röhrl在蛋白质纯化方面的支持，以及感谢Sandra Ortmeier在脂质制备方面的贡献。作者还感谢Adrián Merino-Salomón和Shunshi Kohyama就拥挤剂条件和蛋白质封装问题提供的有益讨论。M.R.-L. 是IMPRS-ML和由德国联邦教育与研究部（BMBF）以及巴伐利亚自由州在联邦政府与各州卓越战略框架下支持的ONE MUNICH项目成员。作者同时感谢慕尼黑纳米科学中心（CeNS）提供的支持。

本研究中使用的试剂和设备列于材料表中。
1. 脂质混合物的制备
<ol>
	<li>取0.5 mL氯仿于5 mL玻璃小瓶中。加入17.5 µL DOPC、7.4 µL DOPG、29.6 µL DPPC（均来自以氯仿配制的25 g/L脂质储备液）、32.2 µL 10 g/L DPPG和20.6 µL 18 g/L胆固醇。再加入1.2 µL 1 g/L Atto655-DOPE染料。轻轻涡旋混合脂质溶液，随后在氮气流下蒸发除去氯仿，并将所得脂膜重新悬浮于总共400 µL氯仿中。</li>
	<li>用于包封FtsZ时，最终配制的脂质混合物摩尔比为DOPC:DOPG:DPPC:DPPG:Chol（17.499:7.5:31.5:13.5:30），并以0.001 mol% Atto655-DOPE标记。用于制备包封束状肌动蛋白（bundled-actin）的GUVs时，脂质混合物中含有生物素化脂质，其组成为DOPC:DOPG:DPPC:DPPG:Chol:Biotinyl CAP PE（17.499:7.5:30.5:13.5:30:1），并以0.001 mol% Atto655-DOPE标记。</li>
	<li>将脂质混合物（32 mM，50 µL）溶于氯仿中，在玻璃小瓶中通入N2气体干燥约15分钟。</li>
	<li>随后将玻璃小瓶置于干燥器中抽真空保存约30分钟，以彻底去除残留的微量氯仿。</li>
	<li>将干燥后的脂膜分散于20 µL正癸烷和500 µL矿物油的混合液中，使最终浓度达到3.2 mM，并使用水浴超声仪在较高温度（约50 °C）下超声处理约30分钟。</li>
	<li>将脂质油相混合物转移至离心管中，在进行后续步骤前于37 °C孵育约10分钟。</li>
	<li>制备用于蛋白质包封的内相混合液。</li>
</ol>
2. 包封用内相溶液的制备
<ol>
	<li>FtsZ 丝状体混合物
	<ol>
		<li>在微量离心管中以总体积 10 µL 配制 FtsZ 蛋白混合液。为形成 FtsZ 丝状网络，向 5.71 µL FtsZ 反应缓冲液（RB）中加入 0.87 µL 的 23 µM FtsZ-YFP-mts、1.31 µL 的 381 g/L Ficoll70、1.11 µL 的 271 g/L BSA 以及 1 µL 的 25 mM GTP。最终溶液总体积为 10 µL，其中含有 2 µM FtsZ-YFP-mts、50 g/L Ficoll70、30 g/L BSA 和 2.5 mM GTP。在用于 GUV 封装前，将混合液置于冰上保存。 
		注意：FtsZ 反应缓冲液（RB）包含 50 mM Tris-HCl（pH 7.5）、150 mM GluK、5 mM GluMg。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肌动蛋白束混合物
	<ol>
		<li>为封装肌动蛋白束，首先在水中配制 10 µL 的肌动蛋白主混合液（A-Mix），其中包含 86% G-肌动蛋白、10% Atto488-肌动蛋白和 4% 生物素标记的肌动蛋白。在此步骤中，按照制造商说明书配制蛋白储备液。然后，为达到 35.42 µM 的 A-Mix 终浓度，加入 6.39 µL 的 2 g/L G-肌动蛋白、1.48 µL 的 1 g/L Atto488-肌动蛋白、1.19 µL 的 0.5 g/L 生物素标记肌动蛋白以及 0.9 µL H2O。混合后置于冰上，并避光保存。</li>
		<li>为防止肌动蛋白在 GUV 外部提前聚合和成束，在封装前几分钟内配制最终的肌动蛋白溶液。最终溶液包含 7% 碘克沙醇、0.01 g/L 中性亲和素、2.4 µM A-Mix、0.6 µM Fascin、10 g/L BSA、20 g/L Ficoll70 和 5 mM ATP，溶于肌动蛋白聚合缓冲液中。
		<ol>
			<li>配制该最终溶液时必须始终置于冰上，按以下顺序依次加入：2.92 µL 的 60% 碘克沙醇、10.25 µL H2O、2.5 µL 的 0.1 g/L 中性亲和素、0.92 µL 的 271 g/L BSA、1.31 µL 的 381 g/L Ficoll70、2.5 µL 的 10x 肌动蛋白聚合缓冲液、1.69 µL 的 35.42 µM A-Mix、1.65 µL 的 9 µM Fascin 以及 1.25 µL 的 100 mM ATP。充分混匀后迅速取出所需的 5 µL 用于封装。 
			注意：使用渗透压计测量该内相溶液的渗透压（约 430 mOsm/Kg）。必须通过将葡萄糖溶于水并调节至相同渗透压值来配制具有匹配渗透压的外相溶液混合物&#160;（见步骤 3.2）。10x 肌动蛋白聚合缓冲液包含 100 mM Tris-HCl（pH 7.5）、500 mM KCl 和 50 mM MgCl2。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. GUV 的制备与 体外 包封
<ol>
	<li>在离心管中制备GUV：FtsZ的包封
	<ol>
		<li>为包封FtsZ，向一个1.5 mL塑料离心管中加入500 µL FtsZ反应缓冲液（RB），然后轻轻加入200 µL油中脂质混合物（按上述步骤1.6制备），以形成油-水界面，并在该界面处沉积一层脂质单分子层。</li>
		<li>为形成乳液，先取另一个1.5 mL离心管，加入200 µL油中脂质混合物。在形成乳液前，将该离心管在37 °C下孵育约10分钟。</li>
		<li>孵育完成后，向该离心管中加入5 µL FtsZ蛋白混合物（按步骤2.1.1制备）。这5 µL水相中的蛋白会以液滴形式沉降至离心管底部。</li>
		<li>通过轻轻敲击离心管底部5–6次，形成乳液，直至溶液明显变浑浊。</li>
		<li>用移液器轻柔吸取该乳液，并将其置于油-水界面（按上述步骤3.1.1制备）之上。</li>
		<li>在预热至37 °C的条件下，以6000 × g离心30分钟，并在整个囊泡制备过程中维持该温度。</li>
		<li>离心后让样品冷却至室温，持续约30分钟，再进行成像。</li>
		<li>用移液器从管顶小心吸除上层油相，留下约100–200 µL溶液用于成像。</li>
		<li>用剪刀将移液器吸头斜角剪开，从离心管底部轻柔吸取50–100 µL GUV溶液。该溶液将用于成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>直接在96孔板中制备GUV：肌动蛋白的包封
	<ol>
		<li>为包封肌动蛋白，首先配制与内层肌动蛋白混合液具有相同渗透压的外层溶液混合物（葡萄糖水溶液）。为匹配内层混合液约430 mOsm/Kg的渗透压，将198 µL 2 M葡萄糖加入802 µL H2O中，制备外层溶液混合物。</li>
		<li>为直接在孔板上形成囊泡，首先对96孔板中的一个孔进行钝化处理。向孔中加入100 µL浓度为10 g/L的BSA溶液，孵育10–15分钟。随后，用100 µL外层溶液小心清洗孔内壁5次，注意避免移液器吸头接触已钝化的玻璃底面。清洗完成后，在孔中保留100 µL外层溶液混合物。</li>
		<li>轻柔地向孔中加入50 µL油中脂质混合物，以在外层溶液上方形成脂质单分子层。为确保油相正确沉积在水相之上，将移液器吸头靠在孔的一侧，让油沿孔壁滑下。</li>
		<li>为形成乳液，先取一个1.5 mL离心管，加入100 µL油中脂质混合物。在形成乳液前，将该离心管在37 °C下孵育约10分钟。</li>
		<li>向含有100 µL油中脂质混合物（按上述步骤1.6制备）的离心管中加入2.5 µL最终肌动蛋白溶液（来自步骤2.2.2）。这2.5 µL水相中的蛋白会以液滴形式沉降至离心管底部。</li>
		<li>通过轻轻敲击离心管底部10–20次，形成乳液，直至溶液明显变浑浊。</li>
		<li>用移液器轻柔吸取该乳液，并将其置于油-水界面（按上述步骤3.2.3制备）之上。将移液器吸头小心插入脂质单分子层中间，释放乳液。乳液会在脂质单分子层相中形成一团局限的浑浊云状物。</li>
		<li>将96孔板在预热至37 °C的条件下，以200 × g离心20分钟，并在整个囊泡制备过程中维持该温度。 
		注：可采用400 × g离心10分钟以缩短囊泡制备时间。但为获得最佳结果，建议使用上述离心参数。离心力超过400 × g会导致囊泡压缩，并在成像孔板底部形成脂质聚集体。</li>
		<li>让样品冷却至室温，持续约30分钟后再进行成像。 
		注：可直接在孔中进行成像，无需去除上层油相或将囊泡转移至其他腔室或孔中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成像与三维图像重建
<ol>
	<li>取一个96孔成像板，用BSA封闭约10分钟，然后将样品转移至成像板中（参见步骤3.2.2）。</li>
	<li>将GUV溶液转移至钝化处理的孔板中。</li>
	<li>将培养板置于倒置共聚焦显微镜载物台上，使用40倍水镜物镜进行观察。</li>
	<li>聚焦任意感兴趣区域（ROI），并以固定的 z 轴步长间隔对该选定 ROI 采集 z 轴层扫图像序列。该方案可制备直径为 5–30 µm 的大单层囊泡（GUVs），因此可根据需要将步长间隔设定为 0.5–1 µm。</li>
	<li>将每个z轴堆栈图像序列保存为.tiff格式。</li>
	<li>在图像处理软件（ImageJ/Fiji）中打开感兴趣的图像序列。确定信号强度最高的图像。保持 ctrl+shift+c 调节亮度 &amp;#38; 对比度窗口并单击 自动.</li>
	<li>从 ImageJ/Fiji 菜单中，前往 分析 &#62; 设定比例尺 输入每个图像像素对应的实际物理距离及其单位。</li>
	<li>从 ImageJ/Fiji 菜单中，前往 图像 &#62; 堆叠 &#62; Z轴投影 从z轴堆栈重建三维图像。设置 投影类型 作为 标准差其余设置（起始切片和终止切片）可使用默认选项。 
	注意：在三维重建中，需警惕由重叠的z层图像堆叠（z-stacks）引起的标准差投影伪影。为确保无伪影产生，应去除球体下半部分的z层图像堆叠，仅观察其上半部分的投影。</li>
</ol>
5. 基于大小的GUV频率统计分析
<ol>
	<li>按照步骤 4.4 和 4.5 所述，获取目标 GUV 的 Z 轴层扫图像。为了在宽视野中尽可能成像更多的 GUV，以 1x 或 2x 放大倍数采集共聚焦层扫图像。</li>
	<li>按照步骤 4.6 所述，在图像处理软件（本例中为 ImageJ/Fiji）中打开 Z 轴层扫序列。</li>
	<li>通过点击图像下方标记为 c 的栏，选择获取膜荧光信号的显示通道。按照步骤 4.6 所述，调整图像的亮度和对比度。</li>
	<li>通过点击打开图像下方的 z 栏，浏览所采集的不同层面图像，选择待分析囊泡直径最大的层面。</li>
	<li>在 ImageJ/Fiji 中，通过点击 分析 &#62; 工具 &#62; ROI 管理器，打开 ROI 管理器。</li>
	<li>在 ImageJ/Fiji 主面板的工具中，点击 椭圆选区 工具。</li>
	<li>根据 GUV 膜的荧光强度绘制一个与 GUV 轮廓相匹配的圆形。要绘制圆形选区，请按住 Shift 键并拖动鼠标，将圆扩展至囊泡大小。通过按住鼠标左键点击囊泡中心并拖动鼠标，可移动圆形选区至所需位置。</li>
	<li>在 ROI 管理器的选项面板中点击 添加 [t]，将绘制的圆形选区保存至 ROI 管理器。</li>
	<li>为获得以微米为单位的囊泡尺寸，请点击 ROI 管理器面板中的 测量。此时将弹出一个新窗口。取“主轴”或“次轴”列中显示的数值作为囊泡直径的测量值（两列数值应相同，因其对应椭圆的两个轴）。</li>
	<li>使用绘图软件（Excel、Origin、Prism）创建柱状图，标明不同尺寸范围 GUV 所占的比例。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无竞争利益。

主要挑战之一是 体外 基于膜的模型系统重构难点在于将蛋白质包裹进相分离的GUV中，这源于其在高温下制备。事实上，此类相分离囊泡的生成 通过 一步合成法在高温下可能导致蛋白质降解，从而引发困难。因此，本方案描述了在生理温度下通过双重乳化法制备巨型脂质体（GUV）后观察膜相分离的优化条件，同时维持包封蛋白质的活性。该方法为两个脂质相均引入负电荷，以便在需要静电相互作用时促进任意目标蛋白质的结合。以包封FtsZ为例，尽管两个相均带负电，细胞骨架网络仍可形成，并优先结合至L相d 结构域，表明除了负电荷外，膜的流动性也是蛋白质结合的必要条件18此外，在肌动蛋白包封的情况下，网络结构会在掺入了生物素化脂质的膜区域上形成19.
尽管乳液转移法在文献中被广泛使用，但其仅被应用于均质GUVs的制备。因此，本方案对这一方法进行了多项改进，以实现对膜上相区形成的观察。其中关键因素之一是温度。为了观察相区形成，同时维持蛋白质的功能（特别是细胞骨架网络的形成），本方案采用37 °C来制备GUVs。一方面，若在较高温度下制备GUVs，所包封的蛋白质会失去功能，滞留在腔内而无法聚合成高级结构；另一方面，若在较低温度下制备GUVs，则无法在膜上观察到相分离现象。因此，37 °C成为本实验中GUVs制备的最优温度。
需要注意的是，本方案提供了两种可能的检测体系，均基于相同的乳液转移原理来制备GUVs&#160;：试管体系和孔板体系。这两种体系各有优缺点，用户在实验设计阶段需加以权衡，以确定哪种体系更符合自身需求。塑料试管无需配备适用于孔板的离心机转子，操作更为简便，并可在成像前对囊泡生产后的稀释倍数进行调控。然而，该体系需要较大的体积（油相和水相均需较多），且在生产后需去除油层以提取GUVs，若此步骤操作不当，可能导致成像孔中残留油迹。相比之下，孔板体系所需样品体积较小，可同时并行封装多种不同的内相环境，且无需额外提取GUVs，囊泡可在同一生产孔中直接进行成像。孔板体系的主要缺点是囊泡易发生聚集，且需要优化离心参数，才能达到与试管体系相当的囊泡产率。
无论采用何种封装系统（试管或孔板），该方法均表明，产生 Giant Unilamellar Vesicles（GUVs）以及促进封装蛋白的聚合均需要最佳的拥挤条件。具体而言，按照本方案，封装 FtsZ 的 GUVs 最佳条件为 30 g/L BSA 和 50 g/L Ficoll7018；而对于肌动蛋白（actin），则需要 10 g/L BSA、7% 碘克沙醇（Iodixanol）和 20 g/L Ficoll70 的混合物19。
GUV 制备的另一个重要方面是离心速度和时间。在上述拥挤浓度条件下形成 FtsZ 网络时，以 6000 × g 离心 30 分钟，可获得在成像孔板中分布均匀且彼此分离的 GUV 群体。相反，对于肌动蛋白，以 200 × g 离心 20 分钟则可实现较高的 GUV 制备产率。如果降低离心速度或时间，GUV 的产率会受到影响；而超过上述值提高离心参数则会导致 GUV 聚集。在所述条件下，本方案可生成封装效率最高、且各个 GUV 之间不发生粘连的囊泡。
尽管本方案可推广至任何脂质和包封的生物分子，但囊泡的膜组成及其内容物决定了离心参数，从而实现相分离囊泡的制备。因此，本方案旨在提供指导，以实现具有膜结构域的多种囊泡的制备。
在相分离的 GUVs 中进行 in vitro 体外重建等方法对于理解由脂质结构域介导的复杂蛋白质-膜动力学至关重要，同时兼顾细胞膜的复杂性14。这些脂质结构域的小尺寸和高度动态特性使得在 in vivo 体内难以表征其界面相互作用。因此，GUVs 由于制备相对简便、可进行理化调控，以及适用于光学显微镜分析，成为一种重要的研究工具20。
此外，在异质生物界面内包封功能分子在纳米医学领域展现出广阔的应用前景。特别是，由于生物分子在表面受限区域的非对称分布与分区，从而赋予功能化药物递送系统不同的特性21。药物与脂质之间的相互作用在药物的药代动力学性质（如转运、分布和蓄积）中起着重要作用，最终影响所用药物的疗效22。因此，理解这些相互作用对药物药代动力学性质的影响，对于开发高效药物至关重要。可通过模型脂质膜研究其与肽、聚合物及纳米载体相互作用的机制23。因此，某些疾病状态下细胞和组织中脂质成分的变化可能改变其生物物理相互作用，这一特性可用于开发靶向特异性药物及药物递送系统24。
综上所述，本文所述方案提供了一种简便的策略，用于制备相分离的大单层囊泡（GUVs），其内层脂质双分子层上锚定有包封的蛋白质。这类囊泡系统的构建在生物技术和合成生物学等领域具有广阔的应用前景，其中具有复杂功能的多组分组装体系可模拟细胞样功能，从而带来创新性的解决方案和新的应用方向。

巨型囊泡作为模型系统用于研究细胞功能1,2其制备简便、易于观察、可调控性强以及 体外 生物分子的重组使这些仿生模型成为众多研究的首选体系3,4,5已知有多种制备GUV的方法，例如电形成法6cDICE7,8乳液转移及其他基于微流控的方法9,10文献中已有关于使用此类方法制备GUV的报道3,11此外， 体外 利用乳液转移法在GUVs内重建细胞骨架网络此前已有描述，该方法为一步成形法，操作简便，无需任何复杂装置。12然而，这种重组在均质GUVs中被广泛报道，而该体系并不能完全模拟细胞膜的复杂性。
本方案描述了 体外 在相分离的GUVs内重建细胞骨架网络，展现出脂质膜的复杂性。尽管此前已有报道表明此类网络可结合于膜表面（外部），但尚未见其被限制在巨型囊泡内部的报道。13,14目前的乳液转移技术侧重于实现相分离的实验方案，同时保持细胞骨架网络形成的活性。该技术的主要挑战之一是温度。生成相分离 giant unilamellar vesicles（GUVs）的标准制备方法需要使用升高的温度，具体温度取决于组成脂质的相变温度。然而，细胞骨架蛋白在如此高的温度下无法聚合形成高级结构。15,16,17因此，本方案不仅采用了一种可在室温下使GUVs发生相分离的脂质组成，还优化了条件，以在生理温度下获得较高产量的GUVs。
在制备重建的GUV体系时，另一个需要考虑的因素是所包封生物分子所需的体积。对于大多数蛋白质而言，制备较大量的样品既昂贵又耗时，通常需要进行多轮纯化。此外，体外（in vitro）重建实验通常需要一个初步的探索阶段，以测试生物分子浓度、缓冲液组成等条件，从而优化内腔溶液的成分。因此，本方案针对两种不同的实验方法进行了优化，以适应上述需求。一方面，本方案描述了一种优化后的标准倒置乳液法，该方法需要相对较高量的蛋白质，可在离心管中实现高产量的GUV制备，随后将GUV转移至成像用96孔板中。另一方面，本文所述方法还优化了直接在成像用孔板中进行相分离GUV制备的流程，该方法所需生物分子体积较小（约为管中制备所需量的1/4），并可实现系列化GUV生成，一次离心步骤即可获得多种包封条件。因此，本方案介绍了一种包封技术，但允许使用者根据自身需求选择其中任一种实验设置。
此外，本方案描述了一种针对两种不同细胞骨架网络（FtsZ和肌动蛋白）的优化封装方法。由于这两种蛋白质需要不同的缓冲体系和分子拥挤条件，本方案阐述了为实现最佳网络重建所必需的相应调整步骤。因此，本文提出的方法可用于在相分离的GUVs内封装任何所需的生物分子，并可推广应用于类似场景。

<table><tbody><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（钠盐）(DOPG)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>840475</td><td>溶于氯仿</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DOPC)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>850375</td><td>溶于氯仿</td></tr><tr><td>1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺-N-(生物素帽)（钠盐）(18:1 生物素帽 PE)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>870273</td><td>溶于氯仿</td></tr><tr><td>1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-外消旋-甘油)（钠盐）(DPPG)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>840455</td><td>溶于氯仿</td></tr><tr><td>1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 (DPPC)</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>850355</td><td>溶于氯仿</td></tr><tr><td>96孔平底微孔板（SensoPlate）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白（α-肌动蛋白，骨骼肌，兔）</td><td>HYPERMOL</td><td>8101-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto488标记的肌动蛋白（α-肌动蛋白，骨骼肌，兔）</td><td>HYPERMOL</td><td>8153-01</td><td></td></tr><tr><td>Atto655-DOPE</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 655-16</td><td>粉末</td></tr><tr><td>超声波清洗仪</td><td>Branson&amp;nbsp;</td><td>1510R-MTH</td><td>Bransonic 超声波清洗机</td></tr><tr><td>生物素标记的肌动蛋白（α-肌动蛋白，骨骼肌，兔）</td><td>HYPERMOL</td><td>8109-01</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5804 R</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>胆固醇（绵羊来源）</td><td>Avanti Polar lipids</td><td>700000</td><td>溶于氯仿</td></tr><tr><td>癸烷</td><td>TCI Deutschland GmbH</td><td>D0011</td><td></td></tr><tr><td>束蛋白（人源，重组）</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>CS-FSC01-A</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll70</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2878</td><td></td></tr><tr><td>碘克沙醇（OptiPrep）</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>LSM800 共聚焦激光扫描显微镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>C-Apochromat 40&amp;thinsp;&amp;times;&amp;thinsp;/1.2 水浸物镜。二极管泵浦固态激光器：488&amp;thinsp;nm 和 640&amp;thinsp;nm。</td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8042-47-5</td><td></td></tr><tr><td>肌球蛋白 II（兔骨骼肌）</td><td>Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)</td><td>MY02-A</td><td></td></tr><tr><td>中性亲和素（Neutravidin）</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>渗透压测定仪</td><td>Fiske Associates</td><td></td><td>Fiske Micro-Osmometer model 120</td></tr><tr><td>Greiner Bio-One</td><td>&amp;nbsp;GmbH</td><td>07-000-109</td><td></td></tr></tbody></table>

体外在相分离的巨大单层囊泡（guvs）内重建细胞骨架网络

In vitro Reconstitution of Cytoskeletal Networks inside Phase Separated Giant Unilamellar Vesicles (GUVs)

以巨大单层囊泡（GUVs）形式存在的仿生脂质膜因其易于在GUVs内重构蛋白质、便于观察以及有助于理解细胞膜-蛋白质动态行为而被广泛用于模拟细胞膜行为。然而，细胞膜中含有由不同脂质组成的脂筏（或称膜区室）。通过在模型系统中引入此类复杂性，可构建出具有相分离特性的GUVs，从而精确调控其脂质组成。尽管均相GUVs的包封制备方法已广为人知，但在相分离GUVs中包封蛋白质的方法仍较为有限。本文所述方案提出了一种简化的“一步法”制备相分离GUVs，其组成包括液态无序相（Ld）和液相有序（Lo）结构域，可高效包封多种细胞骨架蛋白（如FtsZ和肌动蛋白），使该方法成为最小细胞制备的多功能工具。具体而言，该方法采用乳液转移法来制备具有高包封效率的巨大单层囊泡（GUVs）。在此方法中，首先通过将蛋白质溶液乳化于脂质/油混合物中形成单层脂膜，其中选择具有不同相变温度的脂质，以在最终生成的GUVs中实现相分离。随后，将该乳液轻柔转移至另一试管中含脂质的油溶液上方，形成水-油界面。接着在较高温度下（理想条件下为37 °C，以保持蛋白质活性）进行离心，之后收集GUVs用于成像。该方法简化了 体外 在相分离的GUVs内重建细胞骨架蛋白，无需使用复杂的实验装置，因此为研究受限条件下细胞骨架-膜相互作用的力学特性提供了一种便捷的方法。

首先，采用改良的倒置乳液法制备具有膜相分离的GUVs（图1A）。该方法可获得高产率的GUVs，其膜分为Ld和Lo两种相区，其中Ld相区由Atto 655-DOPE荧光标记显示，而未标记的Lo相区则呈现为暗区（图1B）。该方法在较高温度下（所有步骤均在37 °C下进行，成像在室温下进行）可生成尺寸范围为5–30 µm的相分离GUVs（图1C）。此外，通过调整离心速度，确保原始组分脂质有效包封入GUVs中，同时避免过度聚集。
此外，为了验证本实验方案中所述乳化法成功包封生物大分子的能力，分别在独立实验中重建了FtsZ和肌动蛋白网络。FtsZ网络在GUVs内得以重现，形成优先结合L的丝状结构d 结构域 通过 其膜靶向序列（MTS）在 2.5 mM GTP 和 50 g/L Ficoll70 存在下的情况（如图所示） 图2）。在包封步骤约1小时后观察到这些网络结构。然而，肌动蛋白-肌球蛋白网络在GUVs内重建后呈现为细束状结构（与FtsZ形成的较厚网络相反）。图3）。需要注意的是，生物素化脂质在肌动球蛋白网络与GUV膜的结合中起着至关重要的作用。若无生物素化脂质，肌动球蛋白束无法形成弯曲构型，而是保持为短而僵直的束状结构悬浮于腔内，无法在膜上附着形成由长束交织而成的网状结构。图4).
在改良的乳化法方案中，需调整离心速度以获得相分离的GUVs，如前所述。实际上，当含有肌动球蛋白网络的样品以较高的离心速度处理时（600 × g，15分钟），囊泡会在生成孔内聚集形成类似组织的结构。因此，在所有标准的肌动球蛋白网络重建实验中，最佳离心速度设定为200 × g，以获得未聚集的GUVs（图5）。
<img alt="Lipid emulsion centrifugation process diagram, fluorescence microscopy, GUV size distribution chart." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig1.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 1"> 
图1采用双乳液转移法一步生成相分离GUVs (A一步法生产相分离囊泡关键步骤的实验方案 通过 双重乳液转移。B) 按照A中所述方法制备的GUVs的共聚焦Z轴投影图像。比例尺为50 µm。C柱状图显示根据直径统计的相分离GUVs所占比例。实验重复3次（n = 3），每次实验分析的GUVs总数为100个。数据以平均值表示，单个数据点代表三次独立实验的结果。误差线表示三次实验的标准差。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="3D Z-projections: Atto655-DOPE/FtsZ-YFP fluorescence microscopy, cell membrane structures." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig2.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="Figure 2"> 
图2相分离囊泡包裹FtsZ网络 (A对含有 FtsZ 网络的相分离 GUV 完整 z-stack 进行共聚焦 3D 投影成像。B仅对囊泡的上半部分进行共聚焦Z轴投影成像。由于大单层囊泡（GUV）表面脂质区域的形成具有异质性，所获取的共聚焦光学切片的三维重建会呈现囊泡顶部与底部区域脂质结构域的重叠。为避免重叠并便于对结构域进行直观观察，将获取的Z轴堆栈图像的下半部分从文件中剔除，仅保留上半部分用于三维投影。 通过 标准差。比例尺均为 20 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜，Atto655-DOPE/Atto488-肌动蛋白脂质囊泡，3D Z投影。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig3.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图3"> 
图3：包裹肌动球蛋白网络的相分离囊泡。（A）囊泡生成后，对整个采集图像堆栈进行共聚焦Z投影，显示微孔的宏观视图。获得的囊泡产率较高，可用于研究囊泡内不同类型的肌动球蛋白结构。比例尺为50 µm。（B）对单个囊泡的上半部分进行共聚焦Z投影成像。为便于脂质结构域的视觉分析，仅使用图像切片的上半部分进行3D投影。比例尺为10 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Atto655-DOPE、Atto488-肌动蛋白在囊泡膜中的荧光显微镜图像；三维Z投影。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig4.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图4"> 
图4：生物素化脂质在相分离囊泡内形成膜结合肌动球蛋白网络中的关键作用。 共聚焦三维投影显示相分离囊泡中存在未与膜连接的肌动球蛋白网络。若未将生物素化脂质掺入混合物中，肌动球蛋白结构将在囊腔内部形成，并无法在囊泡内层获得弯曲构型（右侧面板，肌动蛋白用Atto488标记）。比例尺为50 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="荧光显微镜图像；Atto655-DOPE、Atto488-肌动蛋白；细胞膜与细胞骨架研究。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68530/68530fig5.jpg" data-altupdatedat="1783396841000" data-alt="图 5"> 
图 5：离心速度对乳液转移法制备相分离囊泡的影响通过乳液转移。共聚焦二维图像显示，采用600 × g 离心力离心15分钟所生成的GUV样品。所使用的离心速度高于优化条件下的200 × g，导致囊泡在孔内聚集形成类似组织的结构。比例尺为100 µm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68530/68530fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

本文介绍了一种在相分离的巨大囊泡内简单的一锅法重建细胞骨架网络的方法。该方法具有普适性，可推广应用于多种生物大分子的包封或限域。

体外在相分离的巨大单层囊泡（GUVs）内重建细胞骨架网络

以巨大单层囊泡（GUVs）形式存在的仿生脂质膜因其制备简便，常被用于模拟细胞膜行为。

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体外 相分离的巨型单层囊泡 （GUV） 内细胞骨架网络的重建

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体外在相分离的巨大单层囊泡（GUVs）内重建细胞骨架网络

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