Name: 使用超极化 13C NMR 对活细胞进行实时代谢检测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-08T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 了解超极化¹³C核磁共振技术用于活细胞实时代谢检测的方法。该技术通过动态核极化实现丙酮酸代谢追踪，为药物筛选和代谢研究提供标准化、可重复的实验方案。

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本研究由日本学术振兴会（JSPS）科学研究费补助金（KAKENHI）23KJ2179 和 24K17833（授予 T.U.）、23K27561（授予 Y.T.）；文部科学省（MEXT）Q-LEAP 项目 [JPMXS0120330644（授予 Y.T.）]；以及文部科学省共同利用·共同研究推进项目：卓越研究大学联盟计划（CURE）资助编号 JPMXP1323015488（Spin-L 项目编号 spin24XQ007）资助。

1. 生物反应器设置（图2A-B）
<ol>
	<li>组装核磁共振管
	<ol>
		<li>使用带螺口的核磁共振管（直径 10 mm，长度 178 mm），并配备可插入管路的开放式管盖。</li>
		<li>准备一个硅胶/聚四氟乙烯（PTFE）瓶垫（直径 9 mm），并将聚醚醚酮（PEEK）管穿过其中，以实现紧密密封（补充图 1）。</li>
		<li>将带有耐化学腐蚀 PEEK 管（内径 1.0 mm，外径 1.6 mm，壁厚 0.3 mm，长度 1 m）的瓶垫插入改装后管盖的开口中。</li>
		<li>将瓶垫置于核磁共振管与开放式管盖之间，并通过牢固旋紧管盖将其固定。该结构可使瓶垫保持就位，并在灌注或注射过程中提供足够的密封性，防止泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置培养基输送管路（图 2C）
	<ol>
		<li>将 PEEK 管连接至核磁共振管的进样口和出样口，以实现连续灌注。使用无法兰接头组件固定连接处，防止泄漏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>安装培养基加热组件
	<ol>
		<li>将 PEEK 管连接至可调节流速的蠕动泵，设定稳定流速约为 0.2 mL/min，通过外部循环装置实现培养基的持续循环。将培养基储液瓶置于设定为 37 °C 的水浴中，以维持温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>添加凝胶防漏组件
	<ol>
		<li>裁剪一块致密海绵，使其适配核磁共振管的直径。将海绵插入管底，以防止海藻酸盐凝胶泄漏，同时允许培养基流动。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制造并插入 3D 打印的海绵固定组件（图 2D-F）
	<ol>
		<li>使用适用于立体光刻 3D 打印的光敏聚合物树脂打印一个圆柱形支架（外径 9.1 mm，长度 20 mm，中心孔直径 1.5 mm）。设计参数详见所附的 补充文件 1。</li>
		<li>将一根硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 1.5 mm，内径约 0.9 mm，长度 90 mm）穿过 3D 打印支架的预制孔。</li>
		<li>使用具有防水性能的紫外光固化树脂将海绵固定在支架平台之上。在紫外光下照射 30 秒，确保充分固化。</li>
		<li>将组装好的带海绵支架插入核磁共振管中。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞准备（在测量前两周开始）
<ol>
	<li>将冻存的细胞（SCCVII 或 HeLa）在 37 °C 水浴中快速解冻。将约 1 × 106&#160;个细胞转移至 10 mL RPMI-1640 培养基中，该培养基需添加 10% (v/v) 胎牛血清和 1% (v/v) 青霉素-链霉素。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2&#160;条件下培养细胞，当细胞融合度达到 70%–80% 时，每 2–3 天传代一次。持续培养约 2 周，以获得约 4 × 107&#160;个细胞，该数量估计自五个 10 cm 培养皿，每个培养皿培养至约 90% 融合度（每个可收获约 8 × 106&#160;个细胞）。</li>
</ol>
3. 海藻酸盐凝胶的制备
<ol>
	<li>海藻酸盐溶液的制备
	<ol>
		<li>将生物研究级海藻酸钠粉末溶于去离子水中，配制 2% (w/v) 的溶液。在 25 °C 或更高温度下，以轻柔的翻转混匀方式孵育溶液过夜。使用转速约为 10–20 rpm 的管式旋转仪，以防止产生气泡并确保溶解均匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞在海藻酸盐凝胶中的包封
	<ol>
		<li>向 10 cm 培养皿中加入 2 mL 0.25% (v/v) 胰蛋白酶-EDTA 溶液。倾斜培养皿使溶液覆盖整个表面，随后吸除过量的胰蛋白酶-EDTA。</li>
		<li>将培养皿在 37 °C 下孵育 2 分钟。</li>
		<li>向培养皿中加入 10 mL 培养基，轻轻吹打使细胞脱落。将全部细胞悬液收集至 15 mL 锥形离心管中。</li>
		<li>取约 10 µL 悬液，使用细胞计数仪计数细胞数量。后续实验通常需要约 1 × 107&#160;个细胞，但实际数量应通过测量确认。</li>
		<li>将剩余的细胞悬液在 120 × g 条件下离心 5 分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于 4 mL 2% (w/v) 海藻酸盐溶液中。缓慢吹打以尽量减少气泡产生。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过钙离子交联形成凝胶（图 3）
	<ol>
		<li>向 50 mL 离心管中加入 10 mL 50 mM CaCl2&#160;溶液（图 3A）。</li>
		<li>取 300 µL 细胞-海藻酸盐混合液，吸入配有 30G、10 mm 针头的 0.5 mL 注射器中，并将其固定在离心管盖上（图 3B）。</li>
		<li>将注射器固定后，紧密盖上离心管盖，整个组件在 200 × g 条件下轻柔离心 5 分钟。离心后弃去上清液，将载有细胞的凝胶重悬于培养基中（图 3C-D）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将凝胶装入核磁共振管
	<ol>
		<li>使用巴斯德吸管将包封细胞的凝胶转移至核磁共振管中。插入海绵固定装置，并确保密封严密。</li>
		<li>将步骤 1.3.2 中制备的培养基储液（含 5% (v/v) D2O）在水浴中预热至 37 °C，并以约 500 µL/h 的流速循环，以维持稳定条件。</li>
		<li>在将核磁共振管插入磁体前，确保无泄漏。保持 PEEK 管路笔直，插入核磁共振管。根据细胞类型和实验需求调整凝胶尺寸、凝胶珠数量及移液速度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 使用DNP极化仪制备超极化探针（图4）
<ol>
	<li>样品瓶的准备
	<ol>
		<li>将 18 µL 的[1-13C]丙酮酸（14.2 M）加入样品瓶中，该丙酮酸掺杂有 25 mM OX063。将样品瓶连接至 DNP 极化仪系统的流路。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>样品的极化
	<ol>
		<li>将样品瓶插入 DNP 极化仪的腔体单元（6.7 T，1.25 K，1.2 mbar）。在约 188 GHz（22 mW）条件下施加微波辐照，持续 60–80 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>极化过程中信号的监测
	<ol>
		<li>使用集成在 DNP 系统中的固态核磁共振波谱仪监测 13C 信号强度。通过核磁共振软件（SPINit）每 5 分钟记录一次信号数据。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>溶解并制备超极化溶液
	<ol>
		<li>用 3.2 mL 预热的溶解缓冲液（40 mM Tris，50 mM NaCl，80 mM NaOH，100 mg/L EDTA）迅速溶解极化后的样品。在转移至核磁共振测量前，确保溶液达到生理温度（308–313 K，pH ~7）。 
		注意：操作高压部件时需谨慎。将溶解缓冲液预热至约 461 K，以确保高效转移并保持样品完整性。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 核磁共振设置
<ol>
	<li>核磁共振波谱仪的准备
	<ol>
		<li>将样品装入核磁共振管中，并插入波谱仪。</li>
		<li>在核磁共振控制台中，使用已插入样品的自动程序进行锁场、调谐、匹配和匀场，以优化谱图分辨率和信号稳定性。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>设置采集参数
	<ol>
		<li>加载一个启用质子去耦的13C脉冲-采集序列（例如，zg2d）（例如，13-CPD）。</li>
		<li>使用1 µs脉冲（P1）将翻转角设为90°。将采集时间设为1.376 s，谱宽设为23,663 Hz，采集点数（TD）设为65,536。将弛豫延迟（D1）设为0 s。</li>
		<li>将时间增量数（TD1）设为150，以在伪二维模式下连续采集150张谱图。将接收增益设为较低值（例如，~1），以避免超极化样品的信号饱和。 
		注意：由于超极化核磁共振信号强度很高，应将接收增益设为较低值（例如，~1），通常对应最大可用增益的不到1%。接收增益是一个无单位的内部参数，用于控制信号放大。过高的值可能导致信号饱和。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 核磁共振测量
<ol>
	<li>测量前准备
	<ol>
		<li>用溶解缓冲液填满从进样管路到核磁共振（NMR）管的整个进样路径，以避免夹带空气（图2B）。该进样管路用于培养基灌注和超极化探针的注射。</li>
		<li>仔细检查进样管路及NMR管内部是否存在气泡，该区域内的气泡可能干扰NMR测量过程中的信号采集。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>超极化溶液注射前准备
	<ol>
		<li>在通过进样管路注射超极化溶液前，停止蠕动泵以暂时中断培养基循环。</li>
		<li>在溶解超极化底物前约10秒开始光谱采集，以确保注射后底物一到达NMR检测位置即可立即捕获信号。</li>
		<li>当溶液从动态核极化（DNP）极化器中流出时，用注射器吸取1 mL溶液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射超极化溶液并确认信号
	<ol>
		<li>将生物反应器入口处的三通阀切换至B位，以将超极化溶液注入NMR管中。</li>
		<li>注射完成后，将阀门切换回A位，以恢复培养基循环并防止倒流。</li>
		<li>通过采集软件中自由感应衰减（FID）信号的增强，确认注射成功及底物已到达。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 数据处理与分析
<ol>
	<li>处理谱图数据
	<ol>
		<li>将时间分辨核磁共振谱图载入数据处理软件中。如果数据以ser文件格式存储，请找到并载入相应的文件。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>谱图分析
	<ol>
		<li>进行傅里叶变换（FT），将原始自由感应衰减信号（FID）转换至频域。通过手动或自动方式实施相位校正。进行基线校正以消除畸变。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>代谢物转化的可视化
	<ol>
		<li>绘制丙酮酸C1（~171 ppm）和乳酸C1（~183 ppm）随时间变化的信号曲线。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>代谢转化的定量分析
	<ol>
		<li>计算丙酮酸和乳酸峰的曲线下面积（AUC）。</li>
		<li>通过将乳酸的AUC除以丙酮酸的AUC，计算[乳酸]/[丙酮酸]比值。 
		注意：使用曲线下面积（AUC）而非峰高，以减小由超极化[1-¹³C]丙酮酸信号引起的振铃伪影的影响。AUC值通过对每个峰在指定积分范围内信号强度进行简单加和获得。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

实验方案的关键步骤 
该实验方案的成功取决于若干关键步骤。首先，必须确保超极化13C丙酮酸盐的充分溶解和准确转移，以维持较高的信噪比。为了捕捉丙酮酸向乳酸早期代谢转化的过程，必须同步控制超极化探针的注射时间与核磁共振（NMR）信号采集时间。此外，整个实验过程中需保持细胞活性。若偏离上述参数，可能导致代谢活性降低和信号丢失。
方法的改进与故障排除 
尽管本方案为实时代谢监测提供了一种可靠的方法，但某些改进可提高其适用性。例如，调整核磁共振（NMR）采集的翻转角，可在信号强度与极化衰减之间取得平衡，从而优化数据采集。此外，虽然已介绍了一种稳定制备特定尺寸海藻酸盐凝胶的方法，但通过选择不同规格的注射器或针头可轻松调节所制备凝胶的尺寸。这不仅有助于重现缺氧环境24，还能防止细胞从NMR管中逃逸。另外，海藻酸盐凝胶在NMR管内部，特别是在NMR检测区域，会变得致密且黏稠。若在通过PEEK管注入培养基或超极化探针时混入空气，气泡很可能滞留在NMR检测位点，从而导致谱图质量下降。
该方法的局限性 
尽管超极化测量具有核磁共振信号高灵敏度的优点，但其本身存在局限性。由于超极化13C丙酮酸的T1&#160;弛豫作用，代谢测量的持续时间被限制在约1分钟内，从而限制了对长期代谢变化的观察。此外，细胞样本在一次测量后数小时内难以再次进行测量，这可能与单次测量中加入大量丙酮酸有关。这一点与相关研究组在一天后才进行谱图测量的结果一致18，表明测量间隔需要达到如此长度。
与现有技术相比，该方法的重要性 
与传统的代谢检测方法相比，本方法相较于质谱和生化检测等终点检测具有优势，能够实时反映细胞代谢状态。尽管不使用生物反应器也可获得类似的超极化核磁共振谱，但使用生物反应器可实现测量的即时启动 原位 混合是有益的，鉴于弛豫过程的快速性。此外，在注射前可将细胞预先置于稳定的环境中，从而提高代谢分析的可重复性和动力学准确性。这一优势得到了一项补充实验的支持（补充图2），其中使用台式核磁共振系统在外部分段混合后采集时间分辨谱。在此装置中，混合与信号采集之间约30秒的延迟导致了显著的极化损失，尤其影响乳酸的检测。这证实了 原位 混合可提高在快速T条件下动力学测量的保真度1 衰变。然而，值得注意的是，该信号强度在此 原位 设置较低，可能是由于培养基灌注引起的稀释所致——这一问题仍有待优化。
重要性与潜在应用 
该方法可能为研究多种生命形式的代谢特性开辟新途径。实时测量代谢通量使研究人员能够动态评估代谢抑制剂的作用效果。将该方法与其他测量技术相结合，可进一步提高细胞内代谢分析的准确性。
我们设想了一种实用的实验工作流程：首先利用破坏性、高通量的代谢组学方法鉴定候选代谢通路，随后通过超极化13C NMR进行实时验证，以评估活细胞中酶的功能及代谢通量动态。该方法能够在生理条件下直接检测瞬时的代谢响应——而使用免疫测定或荧光传感器通常难以实现这一点，因为这些方法通常仅测量静态的代谢物水平，或需要外源性探针。尽管荧光成像和免疫测定分别在空间定位和高通量筛选方面不可或缺，但超极化NMR提供了一种互补的功能性读出手段，能够以非破坏性方式捕捉反应动力学。该策略不仅有助于在细胞水平上获得机制性认识，还可作为通向组织或整体生物尺度诊断应用的桥梁。特别是，实时捕捉功能性代谢变化的能力，可能有助于在复杂的生物系统中实现对代谢紊乱及治疗响应的早期检测。
在针对不同代谢通路的代谢探针以及为特定酶设计的合成底物的开发方面也取得了进展，这拓展了代谢研究的可能性25,26。此外，超极化技术的进步，例如通过磁隧道将超极化底物直接从极化仪输送至核磁共振仪27，可能有助于提高信号保留能力，并拓展该方法在生物医学研究中的潜在应用。

超极化核磁共振（NMR），特别是通过动态核极化（DNP）技术，可显著增强NMR信号强度1，并以大幅提高的灵敏度实现对代谢变化的实时追踪2,3。该技术已成功应用于多种生物体系，包括酵母4,5、癌细胞模型6,7,8以及微生物9,10。此外，该技术还被用于监测关键代谢通路，如糖酵解11,12、氧化还原稳态13,14以及pH调控15,16。除基础研究外，超极化NMR目前还通过磁共振成像（MRI）应用于临床影像学，实现了从细胞水平到整体水平的代谢评估17。这些进展凸显了建立易于获取的实验方案的迫切需求，以促进超极化NMR在多种生物学背景下的广泛应用。
尽管超极化核磁共振（NMR）具有多功能性，但在活细胞中实现其实时代谢测量在技术上仍具挑战性。传统系统通常依赖复杂且实验室特定的装置，这些装置缺乏可重复性，并且在没有丰富专业知识的情况下难以操作8,18,19,20。这对希望将该技术应用于生物学或转化医学研究的研究人员构成了主要障碍。与光学成像或质谱等其他方法相比，超极化13C NMR 能够在无需破坏性取样的情况下，对特定代谢反应进行无创、时间分辨的监测。它可提供具有时间精度的直接生化信息，因此非常适用于细胞代谢的动态研究。
为解决这些局限性，本研究提出了一种实用且可重复的实验方案，专门设计用于帮助研究人员以最低的技术门槛开展活细胞代谢的超极化核磁共振（NMR）检测。本文详细描述了在活细胞中进行丙酮酸代谢基础检测的完整方法。尽管该方案可适用于其他13C标记的探针，但丙酮酸尤为合适，因其具有快速的细胞摄取能力、已被充分表征的代谢通路以及在细胞代谢中的核心作用。该实验流程包括：（i）细胞样品的制备，（ii）海藻酸盐凝胶包封，（iii）使用动态核极化（DNP）极化仪进行超极化，以及（iv）在400 MHz核磁共振波谱仪中进行实时13C NMR检测（图1）。此外，本文还提供了构建生物反应器系统的关键参数，以确保实验的可重复性及与标准NMR设备的兼容性。该方案采用市售组件进行优化，便于实施，旨在帮助研究人员——尤其是初次接触该技术的研究者——评估其是否适用于自身的实验需求。

<table><tbody><tr><td>[1-&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C] 丙酮酸</td><td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td><td>CLM-8077</td><td></td></tr><tr><td>3D 打印机</td><td>Elegoo</td><td>Saturn 2</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>06729-55</td><td></td></tr><tr><td>D&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>泵用外部循环套件</td><td>AS ONE</td><td>1-4141-02</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>无法兰接头套装</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>6010-46390</td><td></td></tr><tr><td>带芯玻璃毛细管</td><td>Narishige</td><td>GDC-1.5</td><td>内径约 0.9 mm，长度 90 mm</td></tr><tr><td>磁力循环泵</td><td>AS ONE</td><td>1-4141-01</td><td></td></tr><tr><td>MestReNova</td><td>Mestrelab Research</td><td></td><td>NMR 谱图处理与分析软件</td></tr><tr><td>My Shot 注射器</td><td>Nipro Corporation</td><td>8277</td><td>0.5 mL/100U，30G × 10 mm，140 个</td></tr><tr><td>OX063</td><td>&amp;nbsp;Oxford Instruments Co. Ltd.&amp;nbsp; 和 Polarize IVS Co. Ltd.&amp;nbsp;</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>PEEK 管</td><td>AS ONE</td><td>3-780-05</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>26252-94</td><td></td></tr><tr><td>Peristaltic Bio Mini 泵</td><td>ATTO</td><td>1221200</td><td>高精度、宽流速型，用于稳定培养基流动</td></tr><tr><td>树脂</td><td>Siraya Tech</td><td>Smoky Black</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培养基</td><td>Nacalai Tesque, Inc.</td><td>30264-85</td><td></td></tr><tr><td>硅胶/PTFE 瓶塞</td><td>GL Sciences Inc.</td><td>1030-50009</td><td></td></tr><tr><td>海藻酸钠 80-120</td><td>FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation</td><td>194-13321</td><td></td></tr><tr><td>SPINit 软件</td><td>RS&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;D</td><td></td><td>DNP 极化器中的 NMR 软件</td></tr><tr><td>海绵</td><td>-</td><td>-</td><td>市售海绵，按尺寸裁剪用于凝胶固定</td></tr><tr><td>三通旋塞阀</td><td>AS ONE</td><td>3-6247-04</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin</td><td>Bruker</td><td></td><td>NMR 数据采集与处理软件</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.25%)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>07086-74</td><td></td></tr><tr><td>紫外光固化树脂</td><td>BONDIC</td><td>BD-SKCJ</td><td></td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>AS ONE</td><td>1-5832-41</td><td>Thermal Robot TR 系列 TR-1&amp;alpha;，用于维持 37 &amp;deg;C 温度</td></tr><tr><td>Wilmad 螺口 NMR 管</td><td>Sigma</td><td>Z271977</td><td>频率 400 MHz，直径 10 mm，长度 178 mm</td></tr></tbody></table>

使用超极化13c核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

Real-Time Metabolic Detection in Living Cells Using Hyperpolarized 13C NMR

本方案介绍了一种将自制生物反应器系统与超极化13C核磁共振（NMR）波谱技术相结合的方法，用于实时检测活细胞中的丙酮酸代谢。该方案详细描述了生物反应器系统的构建过程，该系统可在维持稳定细胞培养环境的同时，精确控制超极化底物的注入时机和NMR信号的采集。该方法可在60秒的测量窗口内可靠地检测丙酮酸向乳酸的代谢转化，并在整个过程中保持足够的信噪比。原位混合功能可加速NMR信号的检测，并减少T1&#160;弛豫损失。本方案还包括制备海藻酸盐凝胶以包封细胞并将其置于生物反应器内的详细操作步骤。与传统方法相比，该方法具有更高的可重复性和动力学准确性，显示出在癌症代谢研究和药物筛选中的潜在应用价值。通过进一步优化系统，例如采用其他类型的凝胶基质，可提升其在多种生物学研究中的适用性。

本研究中，将一个制备的系统与超极化13C NMR 波谱技术联用，以实时测量活细胞中的丙酮酸代谢。在 1D 13C NMR 谱图中检测到的主要信号对应于丙酮酸（约 171 ppm）和乳酸（约 183 ppm）21，使我们能够在生理条件下评估丙酮酸向乳酸的代谢转化（图 4）。
光谱质量与信号动力学 
在使用 SCCVII 细胞（一种常用于超极化 MRI 研究的小鼠鳞状细胞癌细胞系）对同一样本进行重复测量所获得的代表性结果如图所示 图5首次测量显示出乳酸信号明显升高，表明存在活跃的代谢转化。然而，在间隔1.5小时的后续测量中，代谢活性呈进行性下降。这种随时间推移而减弱的现象可能反映了由初始丙酮酸注射所诱导的生物学应激或适应性反应。值得注意的是，已有文献报道过类似的短暂性代谢调节现象 体内 使用超极化 MRI 和电子顺磁共振成像（EPRI），在给予丙酮酸后，肿瘤氧合水平出现暂时性下降22这些结果表明，该测量方法的可重复性能够实现对动态代谢变化的非破坏性追踪，这一优势是破坏性方法难以实现的23.
为了评估本方案在其他细胞类型中的适用性，使用了HeLa细胞（一种广泛使用的人类癌细胞系）进行了额外的测量。如图6所示，HeLa细胞也表现出明显的丙酮酸向乳酸的转化。尽管由于T1弛豫导致信号强度逐渐下降，但在整个60秒的采集期间，信噪比仍保持充足。这些结果表明，当前的方案具有广泛的适用性，可作为多种细胞类型实时代谢谱分析的通用工具。
尽管快速信号衰减是基于DNP的NMR固有的局限性，但我们的 原位 混合系统可最大限度缩短溶解与检测之间的时间延迟，从而提高检测灵敏度。进一步优化凝胶基质组成等改进措施，有望拓展该方法在更广泛生物体系中的适用性。
<img alt="用于核磁共振的海藻酸盐细胞包封；示意图显示了DNP极化器和400 MHz核磁共振波谱仪装置。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 1"> 
图1：从细胞培养到超极化核磁共振检测的整体工作流程示意图。该流程始于细胞培养（约2周），随后制备海藻酸盐凝胶（约60分钟），以包封细胞实现稳定检测。接着使用DNP极化系统进行超极化处理（约60分钟），并利用400 MHz核磁共振波谱仪进行核磁共振检测（约5分钟）。右侧照片展示了该工作流程中所使用的相应仪器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="核磁共振装置示意图及超极化探针入口和海藻酸盐凝胶细胞系统的照片。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图2"> 
图2：用于超极化核磁共振测量的生物反应器装置。（A）生物反应器装置的示意图。培养基通过入口A进入核磁共振管，随后被导向废液。含有活细胞的海藻酸盐微珠被放置在核磁共振管内。在进行超极化核磁共振测量时，超极化探针通过标记为“超极化探针入口”的入口B注入。（B）整个生物反应器装置的照片，进样和出样管路已明确标注。（C）进样管路切换装置的特写图，显示入口A（培养基灌注）和入口B（超极化探针注入）。（D）计算机辅助设计图和（E）置于核磁共振管内的3D打印海绵固定组件的代表性照片。该组件包含一个用于引导输送超极化底物溶液的玻璃毛细管的孔洞，以及一个用于固定海绵的平台。该组件本身并不紧密贴合核磁共振管的内壁；（F）相反，在其周围插入一块海绵以填充间隙。该结构可稳定组件，并使废培养基通过海绵向上流动，从而无需额外设置出样孔。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="海藻酸盐中的细胞包封：示意图、离心管、细胞微球（显微镜图像）、聚合步骤。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图3"> 
图3：海藻酸盐凝胶的制备。（A）海藻酸盐凝胶微球形成装置的示意图，以及（B）其实际装置照片。左侧图像显示了完整的装置，包括离心管及其经改造的管盖上固定的注射器。右上方图像显示了带有小孔的管盖，用于插入注射器针头；右下方图像显示了带有方形开口的管盖，可稳定固定注射器。离心管预先加入10 mL氯化钙溶液，使从注射器针头挤出的海藻酸盐溶液发生胶凝，形成海藻酸盐凝胶微球。（C）代表性显微图像，显示不含细胞的海藻酸盐凝胶微球的形态。（D）代表性显微图像，显示包封HeLa细胞的海藻酸盐凝胶微球的形态。比例尺 = 200 µm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="时间分辨一维¹³C核磁共振波谱图，显示超极化与化学位移。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 4"> 
图4核磁共振测量与超极化制备步骤的示意图。 在约60分钟的DNP信号累积过程中，同步进行NMR实验装置的准备工作，以最大限度减少延迟。准备工作包括将海藻酸盐微珠装入NMR管，随后进行 1H 锁场调节、匀场和探头调谐，以确保系统处于可立即进行测量的状态。溶解后 原位 混合，时间分辨 13C NMR 谱显示清晰的丙酮酸和乳酸峰。约在 171 ppm、179 ppm 和 183 ppm 处观察到的峰分别对应于丙酮酸、丙酮酸水合物和乳酸。约 4 × 107 用于核磁共振测量的海拉细胞被包埋在海藻酸盐凝胶中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="随时间变化的动力学曲线图：丙酮酸与乳酸强度随时间的变化，展示衰减模式。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="图 5"> 
图 5：重复测量中丙酮酸和乳酸信号的时间分辨检测。对同一份SCCVII细胞包埋样品，在间隔1.5小时的时间点采集超极化13C NMR谱图，以评估重复无损测量的可行性。每次采集的丙酮酸（空心圆圈）和乳酸（实心圆圈，放大1000倍）峰强度随时间变化作图。(A) 第一次测量。(B) 1.5小时后的第二次测量显示乳酸生成显著减少。(C) 再次间隔1.5小时后的第三次测量证实代谢活性持续处于低水平。基于曲线下面积（AUC）的定量分析表明，[乳酸]/[丙酮酸]比值从第一次测量的0.00134降至第二次的0.00019和第三次的0.00027。海藻酸盐凝胶中的最终细胞浓度约为1.0 × 107 个细胞/mL（4 mL中含4 × 107 个细胞）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="丙酮酸和乳酸信号强度随时间（秒）衰减动力学图；数据分析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68539/68539fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Figure 6"> 
图6： HeLa细胞中丙酮酸向乳酸的转化。 在活体HeLa细胞中测定了时间分辨的超极化13C NMR丙酮酸和乳酸信号。丙酮酸信号强度归一化至其在零时刻的最大值。乳酸信号强度为便于观察，按103倍进行缩放。基于曲线下面积（AUC）的定量分析显示，[乳酸]/[丙酮酸]比值为0.00121。海藻酸盐凝胶中的最终细胞浓度约为7.5 × 106 个细胞/mL（4 mL中含3 × 107 个细胞）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/68539fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
补充图1. 生物反应器系统中所用瓶塞隔垫的代表性图像。（A）使用前的硅胶/聚四氟乙烯（PTFE）隔垫（直径9 mm）。（B）实际使用中的同一隔垫，聚醚醚酮（PEEK）管路穿过打孔处插入。隔垫材料的弹性使其能够在管路周围重新密封，从而在超极化底物注射过程中维持密闭环境。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S1.tif" target="_blank">请点击此处下载该图</a>
补充图2：外部混合后获得的时间分辨超极化13C核磁共振谱。 使用台式核磁共振系统检测超极化丙酮酸与细胞在核磁管外混合后的[1-13C]丙酮酸代谢过程，得到的代表性时间分辨谱图。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Figure%20S2_RE.tif" target="_blank">请点击此处下载该图</a>
补充文件1：圆柱形支架的CAD设计。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68539/Supplementary%20file%201_RE.ipt" target="_blank">请点击此处下载该文件</a>

本方案将定制的生物反应器系统与超极化¹³C核磁共振波谱技术相结合，用于实时测量活细胞中的丙酮酸代谢，从而提高代谢研究和药物筛选应用中的可重复性和动力学准确性。

使用超极化13C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

该方案介绍了一种将自制生物反应器系统与超极化13C核磁共振（NMR）波谱技术联用的方法，以……

我们开发了一种利用先进的超极化核磁共振（NMR）技术无创测量血清实时代谢的方法。我们的目标是为多种生物学研究应用创建可及的工具。已有若干针对血清代谢的超极化NMR系统被报道。然而，直到目前，仍缺乏可用于广泛研究的标准化且可重复的实验方案。本方案利用市售组件提高了可及性。我们还提供了全面的验证，包括系统内混合优势和重复测量能力，以促进更广泛的应用。我们的结果能够在无干扰的情况下实现对活细胞内动态代谢变化的实时追踪。这为多种代谢探针应用中的长期药物研究开辟了新的可能性。我们的方法存在一些局限性，包括探针选项和自动化需求。解决这些挑战将为建立细胞代谢测量技术奠定基础，并丰富我们实验室未来在动态核极化（DNP）研究方面的努力。[旁白] 首先，向一个10厘米培养皿中加入2毫升0.25%（体积比）的胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻倾斜培养皿，确保溶液覆盖整个表面。然后吸除多余的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。将培养皿放入设定为37°C的培养箱中，孵育2分钟。随后向培养皿中加入10毫升培养基。使用移液器轻轻吹打数次，使细胞从表面脱落，并将全部细胞悬液收集至一个15毫升锥形管中。取约10微升细胞悬液，加入细胞计数仪中以确定细胞数量。确保测定结果表明细胞产量约为一千万个，必要时进行调整。将剩余的细胞悬液在120 × g条件下离心5分钟。离心后，吸除并弃去上清液。将所得细胞沉淀重悬于4毫升2%（质量/体积）海藻酸钠溶液中，缓慢吹打以尽量减少气泡产生。现在，向一个50毫升离心管中加入10毫升50毫摩尔的氯化钙溶液。将注射器固定在装有氯化钙溶液的离心管盖上。用一支配有3号规格、10毫米长针头的0.5毫升注射器吸取300微升细胞-海藻酸混合液。然后将装有注射器的离心管盖拧紧，将整个装置放入离心机中，在200 × g条件下轻柔离心5分钟。离心后去除上清液，并将所得凝胶重悬于培养基中。接下来，使用巴斯德移液器将包载细胞的凝胶转移至核磁共振（NMR）管中，并插入海绵固定装置以确保密封紧密。将含有5%（体积比）重水（氘代水）的培养基储液瓶置于37°C水浴中预热。以约500微升/小时的流速开始循环，以稳定系统条件。在继续操作前检查装置，确保无泄漏。向样品小瓶中加入18微升浓度为14.2摩尔的碳-13标记丙酮酸，其中掺杂有25毫摩尔OX063。将小瓶连接至动态核极化（DNP）极化系统的流路。接着，将连接好的小瓶插入动态核极化仪的磁体孔洞单元中。在约188吉赫频率、22毫瓦功率下施加微波辐照，持续60至80分钟。使用集成在动态核极化系统中的固态核磁共振波谱仪监测碳-13信号强度。通过系统控制软件每5分钟记录一次信号数据。现在，迅速将极化后的样品溶解于3.2毫升预热至生理温度的溶解缓冲液中。将制备好的样品装入NMR管，并将该管插入波谱仪中。在NMR控制台界面上启动自动化程序，对已放置的样品执行锁场、调谐、匹配和匀场操作，以确保最佳的谱图分辨率和信号稳定性。加载一个启用质子去耦的碳-13脉冲-采集序列（例如13-CPD）。将翻转角设为90度，脉冲时间为1微秒，标记为P1。设定采集时间为1.376秒，谱宽为23,663赫兹，采集点数（TD）为65,536。将弛豫延迟D1设为0秒。为TD1分配150个时间增量，以在伪二维模式下连续采集150张谱图，并将接收增益调至较低值（例如约1），以避免因超极化样品引起的信号饱和。现在停止蠕动泵，暂时中断培养基循环，然后通过进样管路注入超极化溶液。在溶解超极化底物前约10秒开始谱图采集，以确保在信号到达检测位置时能够捕获。当溶液从动态核极化极化器中流出时，用注射器吸取1毫升该溶液。切换生物反应器入口处的三通阀至B位，引导超极化溶液进入NMR管。注射完成后，将阀门切换回A位，恢复培养基循环并防止回流。最后，在采集软件中观察到自由感应衰减（FID）信号上升后，确认注射成功。确保最终溶液温度达到308至313开尔文之间，pH值约为7，然后转移进行核磁共振测量。对同一份SCCVII细胞包埋样品每隔1.5小时采集一次超极化碳-13核磁共振谱，以评估重复性无损测量的可行性。首次核磁共振测量显示乳酸信号显著增强，表明丙酮酸向乳酸的代谢转化活跃。后续每隔1.5小时的测量显示乳酸信号强度逐步降低，提示代谢活性随时间推移而下降。在HeLa细胞中，初始测量证实了成功的丙酮酸向乳酸转化，信号峰清晰可辨。尽管由于T2弛豫导致信号逐渐减弱，但在整个60秒采集过程中信噪比仍保持充足，表明当前方案具有广泛适用性，可作为多种细胞类型实时代谢谱分析的通用工具。

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科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

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我们描述了一种实验装置，可用于在持续灌注模式下向离体灌注的小鼠心脏输注超极化13C标记的代谢物。采用专门的13C核磁共振（NMR）采集方法，可实时定量测定代谢酶活性；同时通过多参数31P-NMR分析，测定组织中的ATP含量和pH值。...

使用超极化 [1-13C]丙酮酸及 13C/31P 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

荧光寿命成像（FLIM）已成为一种关键技术，用于成像活细胞中特定蛋白质和染料的环境及其相互作用。利用荧光分子转子的FLIM可实现对活细胞内黏度的成像图谱绘制。...

活细胞中分子转子的荧光寿命成像

我们开发了一种利用激光诱导超声检测循环黑色素瘤细胞的流式细胞仪，用于作为转移性疾病早期的指示指标。...

利用光声流式技术检测与分离循环黑色素瘤细胞

本文展示了一种利用原子力显微镜（AFM）通过微压痕法表征活细胞力学特性的实验方案。...

利用原子力显微镜测量活细胞的机械特性

用于双色荧光显微镜的双相机发射分光系统能够生成具有优异光学和时间分辨率的实时图像序列，这是某些活细胞检测（包括平行板流动腔黏附实验）所必需的。当使用软件将同时获取的发射通道图像进行合并时，可生成伪彩图像序列。...

同时利用双相机发射分光系统在两个发射通道中捕获实时图像：在细胞黏附研究中的应用

了解超极化¹³C核磁共振技术用于活细胞实时代谢检测的方法。该技术通过动态核极化实现丙酮酸代谢追踪，为药物筛选和代谢研究提供标准化、可重复的实验方案。

使用超极化¹³C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

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