使用超极化¹³C核磁共振对活细胞进行实时代谢检测

我们开发了一种利用先进的超极化核磁共振（NMR）技术无创测量血清实时代谢的方法。我们的目标是为多种生物学研究应用创建可及的工具。已有若干针对血清代谢的超极化NMR系统被报道。然而，直到目前，仍缺乏可用于广泛研究的标准化且可重复的实验方案。

本方案利用市售组件提高了可及性。我们还提供了全面的验证，包括系统内混合优势和重复测量能力，以促进更广泛的应用。我们的结果能够在无干扰的情况下实现对活细胞内动态代谢变化的实时追踪。这为多种代谢探针应用中的长期药物研究开辟了新的可能性。

我们的方法存在一些局限性，包括探针选项和自动化需求。解决这些挑战将为建立细胞代谢测量技术奠定基础，并丰富我们实验室未来在动态核极化（DNP）研究方面的努力。

[旁白] 首先，向一个10厘米培养皿中加入2毫升0.25%（体积比）的胰蛋白酶-EDTA溶液。轻轻倾斜培养皿，确保溶液覆盖整个表面。然后吸除多余的胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液。将培养皿放入设定为37°C的培养箱中，孵育2分钟。随后向培养皿中加入10毫升培养基。使用移液器轻轻吹打数次，使细胞从表面脱落，并将全部细胞悬液收集至一个15毫升锥形管中。取约10微升细胞悬液，加入细胞计数仪中以确定细胞数量。确保测定结果表明细胞产量约为一千万个，必要时进行调整。将剩余的细胞悬液在120 × g条件下离心5分钟。离心后，吸除并弃去上清液。将所得细胞沉淀重悬于4毫升2%（质量/体积）海藻酸钠溶液中，缓慢吹打以尽量减少气泡产生。现在，向一个50毫升离心管中加入10毫升50毫摩尔的氯化钙溶液。将注射器固定在装有氯化钙溶液的离心管盖上。用一支配有3号规格、10毫米长针头的0.5毫升注射器吸取300微升细胞-海藻酸混合液。然后将装有注射器的离心管盖拧紧，将整个装置放入离心机中，在200 × g条件下轻柔离心5分钟。离心后去除上清液，并将所得凝胶重悬于培养基中。接下来，使用巴斯德移液器将包载细胞的凝胶转移至核磁共振（NMR）管中，并插入海绵固定装置以确保密封紧密。将含有5%（体积比）重水（氘代水）的培养基储液瓶置于37°C水浴中预热。以约500微升/小时的流速开始循环，以稳定系统条件。在继续操作前检查装置，确保无泄漏。向样品小瓶中加入18微升浓度为14.2摩尔的碳-13标记丙酮酸，其中掺杂有25毫摩尔OX063。将小瓶连接至动态核极化（DNP）极化系统的流路。接着，将连接好的小瓶插入动态核极化仪的磁体孔洞单元中。在约188吉赫频率、22毫瓦功率下施加微波辐照，持续60至80分钟。使用集成在动态核极化系统中的固态核磁共振波谱仪监测碳-13信号强度。通过系统控制软件每5分钟记录一次信号数据。现在，迅速将极化后的样品溶解于3.2毫升预热至生理温度的溶解缓冲液中。将制备好的样品装入NMR管，并将该管插入波谱仪中。在NMR控制台界面上启动自动化程序，对已放置的样品执行锁场、调谐、匹配和匀场操作，以确保最佳的谱图分辨率和信号稳定性。加载一个启用质子去耦的碳-13脉冲-采集序列（例如13-CPD）。将翻转角设为90度，脉冲时间为1微秒，标记为P1。设定采集时间为1.376秒，谱宽为23,663赫兹，采集点数（TD）为65,536。将弛豫延迟D1设为0秒。为TD1分配150个时间增量，以在伪二维模式下连续采集150张谱图，并将接收增益调至较低值（例如约1），以避免因超极化样品引起的信号饱和。现在停止蠕动泵，暂时中断培养基循环，然后通过进样管路注入超极化溶液。在溶解超极化底物前约10秒开始谱图采集，以确保在信号到达检测位置时能够捕获。当溶液从动态核极化极化器中流出时，用注射器吸取1毫升该溶液。切换生物反应器入口处的三通阀至B位，引导超极化溶液进入NMR管。注射完成后，将阀门切换回A位，恢复培养基循环并防止回流。最后，在采集软件中观察到自由感应衰减（FID）信号上升后，确认注射成功。确保最终溶液温度达到308至313开尔文之间，pH值约为7，然后转移进行核磁共振测量。对同一份SCCVII细胞包埋样品每隔1.5小时采集一次超极化碳-13核磁共振谱，以评估重复性无损测量的可行性。首次核磁共振测量显示乳酸信号显著增强，表明丙酮酸向乳酸的代谢转化活跃。后续每隔1.5小时的测量显示乳酸信号强度逐步降低，提示代谢活性随时间推移而下降。在HeLa细胞中，初始测量证实了成功的丙酮酸向乳酸转化，信号峰清晰可辨。尽管由于T2弛豫导致信号逐渐减弱，但在整个60秒采集过程中信噪比仍保持充足，表明当前方案具有广泛适用性，可作为多种细胞类型实时代谢谱分析的通用工具。