活体成像表征雄性减数分裂前期着丝粒的运动 拟南芥

我们的研究探索植物减数分裂，旨在揭示减数分裂进程中指导同源染色体识别、排列和配对的分子机制。挑战在于可视化减数分裂过程中染色体的运动，这需要对活体组织进行高分辨率和高速成像以追踪其轨迹。首先，移除隔片一侧的保护膜，并将其置于载玻片中央。

然后移除第二层保护膜。取8 µL自来水滴加至间隔垫的中央。用镊子从主茎之一上夹取一个花序。

将花序置于配有刻度尺的体视显微镜下的一块新载玻片上。选择长度约为 0.5 毫米的花蕾。使用锋利的细针，轻轻拉开萼片和花瓣以打开花蕾，仅保留花药。

去除花萼和花瓣后，立即将花药束轻轻转移到间隔腔的水中，以防止脱水。将数个花药束放入间隔腔内。为避免产生气泡，在盖玻片上加入八微升水，然后将载玻片盖上盖玻片。

然后小心地将盖玻片倒置，使水滴朝向间隔层的空腔。确保花药簇完全浸入总共 16 µL 的水中，并且盖玻片与间隔层紧密贴合。通过在 488 nm 激发 GFP，并使用混合探测器在 494 nm 至 547 nm 范围内进行检测，来设置显微镜。

然后在明场照明下定位花药。利用明场通道，根据细胞的形态确定减数分裂阶段。在软件中观察花药，并以RFP信号作为细胞减数分裂阶段的额外指示指标。

要执行连续采集，请将时间间隔设置为零。然后使用斑点追踪模块自动追踪斑点。选择绿色通道，并将XY直径设置为一微米，用于标记GFPCENH3着丝粒。

然后根据控制窗口底部的图表，利用信号强度调整检测质量。使用自回归运动追踪算法追踪着丝粒轨迹，并可视化所有轨迹，以便轻松区分减数分裂细胞与体细胞组织。接下来，使用斑点模块在选定的细胞核上随时间追踪斑点。

通过选择“仅分割感兴趣区域”选项，定义感兴趣区域，并在该区域内进行荧光斑点追踪。所选的感兴趣区域应充分包含细胞核在所有三个维度及整个时间范围内的位置。在谱系图中，使用软件的3D查看器可视化所有轨迹。

通过选中并按键盘上的删除键，移除分析的花粉母细胞外部的轨迹。在编辑模式下，删除或添加对象时，需确保对象被添加到正确的平面上。在编辑轨迹模式下，需在对细胞进行三维充分分析后，手动在谱系图上连接新对象。

计算每个时间步的瞬时速度，以监测随时间变化的运动速度波动。通过计算连续时间步之间运动方向的变化来确定转向角，以揭示运动轨迹的模式。将结果与瞬时速度一并存储。

使用细胞示踪剂计算迁移距离比，以测量追踪对象相对于其起始位置的移动距离，反映其探索行为。计算每条轨迹的平均速度，以概括整个观察期间的运动特征。计算每条轨迹的平均转向角，用于分析运动、方向性及行为模式，并保存结果。

接下来，计算每个时间步的质心大小，以测量着丝粒围绕其平均位置的空间分散程度。利用质心大小随时间的变化来评估不同着丝粒轨迹之间的整体一致性，并存储结果。计算速度互相关性，以分析不同被追踪对象运动动力学之间的关系，揭示潜在的协调行为。

然后计算每条轨迹的均方位移，以量化着丝粒在给定时间间隔内移动的平均平方距离。减数分裂着丝粒的平均速度显著更高，达到每秒109.35纳米，相较于体细胞着丝粒。减数分裂着丝粒表现出更广的范围和更高的归一化伸展比率，相较于体细胞着丝粒。

减数分裂着丝粒与体细胞着丝粒的转向角分布存在差异。减数分裂着丝粒的均方位移随时间推移而增加，而体细胞着丝粒则基本保持静止。该方案首次实现了对拟南芥减数分裂染色体运动的定量分析，揭示了偶线期和粗线期着丝粒的显著动态行为。

该方案可用于研究减数分裂前期基因组区域的运动，并可适用于其他植物物种。本研究有助于探索染色体运动与重组之间的相互关系，加深对植物配子形成过程中驱动遗传多样性机制的理解。