Name: 过表达和纯化大肠杆菌中的有毒核酸酶 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: 学习在大肠杆菌C41(DE3)系统中过表达和纯化有毒核酸酶Nsp15的方法。本研究采用亲和层析和尺寸排阻层析技术，为其他难以表达的毒性蛋白纯化提供了可靠的实验框架。

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本工作由查尔斯顿学院自然科学与环境科学学院的启动资金、查尔斯顿学院本科生研究与创意活动暑期本科生师生合作研究资助项目，以及SC INBRE DRP子项目（编号P20GM103499）资助。

1. 缓冲液与试剂的准备
<ol>
	<li>过表达试剂
	<ol>
		<li>在2 L带挡板的锥形瓶中，将16 g胰蛋白胨、10 g酵母提取物、5 g氯化钠（NaCl）和900 mL去离子水混合，配制1 L的2xTY培养基。在液体循环模式下高压灭菌至少30分钟。 
		注意：每轮纯化至少需要2 L的2xTY培养基。</li>
		<li>根据质粒准备相应的抗生素母液。对于Nsp15-pET-14b，取1.5 g氨苄青霉素溶于去离子水中，定容至15 mL，配制成100 mg/mL的氨苄青霉素溶液，置于15 mL锥形管中。将抗生素母液储存于-20 ˚C备用。</li>
		<li>在500 mL玻璃瓶中，将2.5 g胰蛋白胨、1.25 g酵母提取物、2.5 g NaCl、3.75 g琼脂糖和250 mL去离子水混合，配制250 mL的Lysogeny Broth（LB）琼脂培养基。在液体循环模式下高压灭菌至少30分钟，然后冷却至手感温热。</li>
		<li>将25 mL温热的LB琼脂培养基转移至已灭菌的250 mL三角烧瓶中（每块平板使用25 mL），加入25 µL 100 mg/mL氨苄青霉素，轻轻旋转混匀。使用移液管将25 mL培养基混合物加入无菌塑料培养皿中，避免产生气泡。
		<ol>
			<li>倾注平板时，用20%乙醇擦拭实验台面，并点燃本生灯以维持无菌环境，防止污染。</li>
			<li>平板冷却后，于4 ˚C保存备用。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>在15 mL锥形管中，将3.574 g IPTG溶于去离子水中，配制15 mL 1 M IPTG溶液。分装为三份5 mL等分试样，避免反复冻融，储存于-20 ˚C备用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化试剂 
	注意：所有试剂应至少在纯化前一天配制
	<ol>
		<li>配制250 mL裂解缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，5%甘油，5 mM咪唑），4 ˚C保存。</li>
		<li>配制15 mL洗脱缓冲液（50 mM Tris pH 8.0，150 mM NaCl，5%甘油，250 mM咪唑），4 ˚C保存备用。</li>
		<li>配制250 mL切割缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，5%甘油），4 ˚C保存备用。</li>
		<li>配制1 L SEC缓冲液（20 mM HEPES pH 7.5，150 mM NaCl，5 mM MnCl2），使用0.22 µm PES滤膜通过真空过滤装置过滤。与FPLC系统一同在4 ˚C保存。</li>
		<li>在15 mL锥形管中，将3.595 g 4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐（AEBSF）溶于去离子水中，配制15 mL 1 M AEBSF溶液。分装为1 mL等分试样至1.5 mL微量离心管中，-20 ˚C保存备用。</li>
		<li>可选：通过将200 µL储存液（250 mM Tris pH 6.8，8% SDS，0.1%溴酚蓝，40%甘油，100 mM DTT）与400 µL去离子水混合，配制SDS凝胶上样缓冲液母液。</li>
		<li>准备凝胶样品管以追踪纯化过程。向每根试管中加入30 µL 1x上样缓冲液。</li>
		<li>在1 L烧瓶中，将30 g Tris碱、144 g甘氨酸和20 g SDS溶于1000 mL去离子水中，配制1 L 10x Tris-甘氨酸电泳缓冲液。使用时，取100 mL 10x溶液与900 mL去离子水混合，稀释为1x工作液。两种溶液均于室温保存备用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Nsp15 过表达
注意：所有试剂和材料应尽可能保持无菌，以防止污染风险。
<ol>
	<li>转化
	<ol>
		<li>从 -80 ˚C 取出 C41(DE3) E. coli 细胞，在冰上放置 10 分钟以解冻。将 1 µL 质粒 DNA 加入含有 C41 细胞的离心管中，冰上孵育 30 分钟。 
		注意：尽管质粒浓度可能有所不同，但本研究所用数据中，每次转化加入 10–20 ng DNA。C41(DE3) 细胞的商业转化方案推荐每次转化加入 10–50 ng DNA。本方案适用于任何使用 T7 启动子系统的质粒；然而，本实验中所用质粒为先前发表的 pET14b 质粒，其编码经密码子优化的 Nsp15，N 端带有 6xHis 标签及 TEV 切割位点和凝血酶切割位点；该质粒通过将 SARS-CoV-2 Nsp15 序列替换为 IBV Nsp15 序列（GENBANK: WIL95322.1, 5989–6324）而获得19。</li>
		<li>将离心管置于 42 ˚C 水浴中热激 45 秒，使细胞吸收质粒 DNA，随后立即放回冰上孵育 2 分钟。</li>
		<li>向含有 C41(DE3) 细胞和质粒的离心管中加入 200 µL 恢复培养基（SOC 或其他富集培养基），在 37 ˚C、210 rpm 条件下振荡培养 1 小时。</li>
		<li>从 4 ˚C 取出添加氨苄青霉素的 LB 琼脂平板，放入设定为 37 ˚C 的静止培养箱中预热。</li>
		<li>用移液器将菌液转移至琼脂平板表面，使用无菌涂布棒将菌液均匀涂布于平板上，随后将平板放入设定为 37 ˚C 的静止培养箱中培养 14–16 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 生长
<ol>
	<li>单菌落挑取 
	注意：使用当天的单菌落起始培养，而非过夜培养的起始菌液，以确保接种细胞处于对数生长期。对于过夜培养，细胞通常已进入稳定期或衰亡期，尤其是表达有毒蛋白时。此外，由于培养时间较长，污染物或突变株可能在培养中超越表达毒性核酸酶的菌株。
	<ol>
		<li>每升培养液准备一个50 mL灭菌的锥形瓶，并额外准备2–3个起始培养瓶。将其中一个锥形瓶标记星号，用于检测光密度（OD）。除非各瓶之间存在肉眼可见差异，否则该瓶测得的OD值将代表整体培养情况。 
		注意：相比15 mL起始培养管，锥形瓶能提供更佳的通气效果。</li>
		<li>配制含有适当抗生素的2xTY培养基主混合液，总体积为10 mL × 起始培养瓶数量。例如，进行4 L培养时需制备6个起始培养液。主混合液包含60 µL氨苄青霉素储备液（从-20 ˚C解冻）和60 mL 2xTY培养基（1:1000稀释）。轻轻摇匀后，分装10 mL至每个锥形瓶中。</li>
		<li>从培养箱中取出转化后的平板，使用无菌牙签或移液器吸头挑取一个孤立的单菌落。将带有菌落的牙签转移至含培养基的锥形瓶中。重复操作，直至每个锥形瓶中均插入一根牙签。</li>
		<li>将接种后的起始培养瓶置于摇床培养箱中，37 ˚C、210 rpm振荡培养约5–7小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>主培养接种
	<ol>
		<li>培养5小时后，使用微量比色皿和分光光度计检测标记星号的锥形瓶在600 nm处的光密度（OD600）。从瓶中取出1 mL培养液转移至微量比色皿中。定期重复测量，直至OD600达到0.8–1.0。</li>
		<li>在接种前30分钟至1小时（当OD600达到0.4时），将2 L的2xTY培养瓶预热至37 ˚C。预热培养基可减少接种后起始培养物引起的延迟期。</li>
		<li>从-20 ˚C取出100 mg/mL氨苄青霉素储备液解冻。当OD600达到目标值后，向四个2 L锥形瓶中各加入1 L 2xTY培养基，并分别加入1 mL 100 mg/mL氨苄青霉素（1:1000稀释），完成培养基准备。</li>
		<li>接种时，将一个起始培养瓶的内容物倒入一个2 L锥形瓶中。重复操作，直至所有2 L锥形瓶均完成接种。为便于后续细胞收获，避免将牙签倒入主培养瓶中。</li>
		<li>将接种后的2 L锥形瓶置于摇床培养箱中，37 ˚C、210 rpm振荡培养3小时后，进行首次OD600检测。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>IPTG诱导表达
	<ol>
		<li>使用移液管从培养瓶中取出1 mL培养液，检测OD600。重复测量直至OD600达到0.8–1.0。</li>
		<li>当OD600达到目标值后，向每升培养液中加入1 mL 1 M IPTG（从-20 ˚C解冻），终浓度为1&#160;mM，以诱导蛋白过表达。</li>
		<li>将2 L锥形瓶转移至16 ˚C、210 rpm摇床培养箱中进行过夜诱导（14–16小时）。 
		注意：较低温度可减缓大肠杆菌（E. coli）的生长速度，通过降低蛋白合成速率和核酸酶活性来减轻毒性效应。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>细胞收获
	<ol>
		<li>从摇床培养箱中取出诱导后的培养瓶，将内容物分别倒入1 L离心瓶中。使用去离子水平衡离心瓶重量。在4 ˚C条件下，4500 ×g离心10分钟，沉淀细胞。</li>
		<li>弃去上清液，使用刮铲将沉淀转移至50 mL锥形管中。将所有沉淀合并至同一锥形管内。于-80 ˚C保存，待后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Nsp15 纯化
注意：所有缓冲液和试管均应置于冰上。所有离心步骤均应在 4 ˚C 下进行。以下实验方案假设目标蛋白带有 His 标签。
可选：每一步骤后可取凝胶样品以监测纯化过程的进展。
<ol>
	<li>细胞裂解与裂解物澄清
	<ol>
		<li>将每1.2 g菌体沉淀重悬于2 mL裂解缓冲液中。每10 mL裂解缓冲液中加入100 µL的1 M AEBSF作为蛋白酶抑制剂。若使用来自4 L培养液的合并菌体沉淀，加入100 µL DNase I，使其终浓度为200 U。 
		注意：可使用每升一粒无EDTA蛋白酶抑制剂混合物片剂作为蛋白酶抑制剂。</li>
		<li>短暂涡旋振荡管内物质30秒，使沉淀与缓冲液充分混合。将涡旋后的沉淀转移至Dounce组织研磨器中，使用松配合研杵均质化内容物（约10次冲程）。</li>
		<li>将匀浆后的样品转移至金属烧杯中进行超声处理。
		<ol>
			<li>为确保获得最大量的样品，用5 mL裂解缓冲液冲洗含有原始沉淀物的离心管，并短暂涡旋振荡。将内容物倒入Dounce匀浆器中，进行约5次研磨，然后转移至超声破碎杯中。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>向金属烧杯中加入 75 µL Triton X-100，以促进膜裂解和溶解。将金属烧杯置于冰浴中，确保样品在超声处理过程中保持低温。</li>
		<li>将超声探头放入金属烧杯中，以每2秒脉冲一次、70%放大功率的条件对样品超声处理6分30秒。 
		警告：若超声波探头未封闭，请使用听力保护装置。</li>
		<li>使用血清移液管将裂解液转移至离心管中。向同一管中加入1 M AEBSF，按1:100比例稀释，作为新鲜的蛋白酶抑制剂。离心澄清裂解液 通过 26,915 × g 离心 g 50 分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>重力过滤亲和层析 
	注意：与镍树脂相比，钴树脂显著降低了非特异性金属结合物21.
	<ol>
		<li>超声处理的同时，取2 mL钴树脂浆液，用25 mL裂解缓冲液在新的锥形管中重悬。将重悬的树脂在500 × g下离心5 min g离心后，倒出上清液，注意不要丢失任何树脂。</li>
		<li>用25 mL裂解缓冲液分别洗涤两次，每次洗涤后进行离心。最后一次洗涤后的上清液在准备进行批量结合前不要弃去。准备操作时，倒出最后一次树脂洗涤所用的裂解缓冲液，并用新鲜裂解缓冲液重悬树脂（每1 mL树脂加入10 mL缓冲液，总量10 mL）。</li>
		<li>将可溶性组分加入管中，置于摇床上，在 4 ˚C 下孵育 45 分钟，使 6x His 标签蛋白与树脂进行批次结合。 
		注意：如果批次结合体积超过 50 mL，请在 250 mL 烧杯中进行此步骤，加入搅拌子并在 4 ˚C 下以极慢速度搅拌。使用裂解缓冲液进行此步骤时，将所有树脂转移至烧杯中。</li>
		<li>批处理结合后，将内容物倒入重力过滤柱中，用125 mL锥形瓶收集穿流液。瓶内液体应为未与树脂结合的蛋白质；带His标签的Nsp15将结合在树脂上。另取一个锥形瓶用于收集，用移液管以8次每次25 mL缓冲液洗涤树脂，总体积至少200 mL（约为原始体积的5倍）。 
		注意：将缓冲液沿柱壁缓慢加入，而非直接加至柱中央，以避免扰动树脂层，否则可能导致清洗效率降低或不均匀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白洗脱
	<ol>
		<li>用洗脱缓冲液分三次洗脱带His标签的Nsp15。第1次和第2次洗脱体积为2 mL，第3次洗脱体积为1 mL。</li>
		<li>执行 &#34;快速粗略&#34; 通过将考马斯亮蓝试剂与水按1:1比例稀释配制考马斯亮蓝法工作液。取10 µL各洗脱组分转移至离心管中，颠倒混匀。若存在蛋白质，溶液应变为蓝色。通过观察颜色变化判断如何合并洗脱组分。 
		注意：如果洗脱液1和2较强而洗脱液3较弱，则合并洗脱液1和2后继续操作；如果三管洗脱液均较弱，则合并全部三管。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛋白浓度与标签切割
	<ol>
		<li>将合并的洗脱样品转移至30 kD MWCO浓缩管（或根据目标蛋白选择合适截留分子量的浓缩管）中，于3,000 x g离心浓缩蛋白至≤2 mL g 孵育10分钟。将浓缩后的样品转移至2 mL微量离心管中。如有需要，用裂解缓冲液将样品终体积调至2 mL。</li>
		<li>根据制造商说明准备一次性脱盐柱（例如 PD-10 柱）。将 2 mL 样品加入柱中。将柱置于洁净的 50 mL 锥形管中，于 1,000 x g 条件下离心洗脱 g 2 分钟。 
		注意：此步骤可快速去除会干扰凝血酶切割的咪唑，同时在使用截留分子量（MWCO）浓缩装置进行缓冲液置换时，避免因浓缩导致的蛋白聚集。</li>
		<li>向洗脱液中加入 β-Me 和 CaCl₂2，使其终浓度均为 2 mM。加入 50 µL 浓度为 1 U/µL 的凝血酶储存液。添加所有组分后，将试管直立置于摇床中，室温下轻轻振荡孵育 4 小时。 
		注意：某些蛋白质可在 4 ˚C 条件下过夜裂解；但与 4 ˚C 过夜裂解相比，室温下裂解 4 小时可提高 Nsp15 的得率。</li>
		<li>重新用裂解缓冲液平衡重力过滤柱（用25 mL裂解缓冲液洗涤3次）。确保旋塞关闭，加入5 mL裂解缓冲液以防止树脂干燥。在裂解期间将层析柱置于4 ˚C保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分离切割后的蛋白与切割后的 His 标签及未切割蛋白
	<ol>
		<li>使用血清移液管，将裂解反应液小心地直接加入树脂中，并将洗脱液收集至15 mL锥形管中。</li>
		<li>用2 mL裂解缓冲液洗涤树脂，并收集至同一支15 mL离心管中。重复洗涤一次，共洗涤两次。洗涤完成后，向离心管中加入AEBSF以淬灭凝血酶，使其终浓度达到10 mM。</li>
		<li>将重悬的样品转移至新的30 kD MWCO浓缩管中，通过3,000 x g离心浓缩蛋白质至≤500 µL。 g 10 分钟后，将浓缩的样品转移至 0.5 mL 微离心管中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>尺寸排阻色谱
	<ol>
		<li>根据制造商的说明，使用S200 Increase分析柱（或其他适用于目标蛋白的尺寸排阻色谱柱）进行层析。用SEC缓冲液平衡，并将FPLC的组分收集体积设为500 µL。</li>
		<li>将峰值部分的收集管转移至新的1.5 mL微量离心管中，向每管加入2.5 µL 1 M DTT（终浓度为5 mM），以保持纯化的Nsp15处于还原状态。</li>
		<li>测量 A280 使用纳米分光光度计测定各组分的值。测量前用SEC缓冲液作为空白对照校准仪器。将纯化的Nsp15样品于4 ˚C保存，以备后续使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>可选：纯度检测
	<ol>
		<li>将凝胶样品管置于95 ˚C金属浴中加热10分钟。加热后短暂离心管子，以收集管壁上的冷凝液。将样品上样至4–20% Stain-free Mini-Protean TGX凝胶，于300 V电压下电泳17分钟。成像凝胶以检测样品纯度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

作者声明无利益冲突。

本文介绍了一种详细的实验方案，可成功在 E. coli 中过表达具有毒性的核酸酶，并通过亲和层析和尺寸排阻层析进行纯化。采用当天制备的10 mL单菌落起始培养物替代过夜起始培养物，显著提高了不同培养批次间生长时间和蛋白产量的一致性。我们选择使用C41(DE3)细胞，该细胞含有降低T7 RNA聚合酶活性的突变，有助于缓解重组蛋白的毒性效应1,4,8,9,10。在优化或调整本方案时，建议测试目标蛋白在Rosetta2、C43(DE3)或pLysS菌株中的表达情况。在撰写本文期间，我们发现本方案所用C41(DE3)细胞的商业来源已停产。目前我们找到了另外两家销售C41(DE3)等效细胞的公司，但尚未进行测试。另一种未在本方法中探讨的细胞类型是BL21-AI细胞，其通过pBAD启动子调控T7聚合酶的表达，...

Escherichia coli （E. coli）&#160;是一种广泛用于生产重组&#160;蛋白的细菌。目前已开发出多种突变菌株，包括BL21(DE3)及其衍生菌株，用于表达目标蛋白1。该过程通常由编码的噬菌体T7 RNA聚合酶驱动，并通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导，IPTG是乳糖的类似物，可通过释放lac阻遏蛋白来激活lac操纵子1,2,3。由于IPTG不能被水解，因此可实现持续的mRNA表达，从而提高蛋白产量3。
尽管这类系统对于许多蛋白质而言具有使用方便和表达稳定的特点，但某些类型的重组蛋白会在其中产生毒性 E. coli，导致蛋白质产量低下。重组蛋白的存在可能对细菌产生毒性，影响其生长，这可能是由于诱导前存在渗漏表达，或诱导后对细菌造成应激所致。3,4结果是细菌的生长速率和存活率下降5抑制泄漏表达在成功表达毒性蛋白的过程中可能发挥重要作用。表达菌株的 E. coli 含有 pLysS 质粒（例如 BL21(DE3)pLysS、C41(DE3)pLysS 等）的菌株通过表达T7溶菌酶来抑制诱导前的T7聚合酶活性，从而抑制泄漏表达6,7其他菌株，如 C41(DE3) 和 C43(DE3) 菌株，含有可降低 T7 聚合酶活性的突变，其机制是减少 T7 聚合酶的 mRNA 水平，同时缺失 lon 和 ompT 蛋白酶1,4,8,9,10. 抑制泄漏表达或降低重组蛋白的产生速率（通过 T7聚合酶调控或降低温度有助于提高毒性蛋白的产量1,9.
核酸酶在使用时通常具有毒性且难以表达 E. coli 由于其对细胞DNA或RNA的酶活性，表达系统1例如，存在于冠状病毒和其他尼多病毒中的内切核糖核酸酶 Nsp15&#160;对细菌具有毒性，导致生长速度减慢和产量降低11,12,13,14,15,16,17由于其催化作用可切割病毒RNA中尿苷酸的3'端，Nsp15在重组表达时被认为可同时作用于自身及细胞的mRNA，从而导致代谢失调和重组蛋白表达异常11,14对于Nsp15而言，寡聚化是其酶活性所必需的。以往对β冠状病毒（如SARS和SARS-CoV-2）Nsp15的研究表明，该酶在溶液中主要形成同源六聚体，而单体形式无活性。16,18,19,20当突变为仅形成单体时，产量显著增加14此外，当将催化三联体中的一个催化残基突变为丙氨酸时，在与野生型（WT）相同的条件下观察到表达量提高，进一步支持Nsp15对宿主的毒性作用 E. coli 由其核酸酶活性驱动13,16,17在本实验方案中，我们展示了野生型γ-冠状病毒（传染性支气管炎病毒）Nsp15与催化失活突变体（通过突变其中一个催化位点的组氨酸残基H223A获得）在产量上的差异。
本文介绍了一种在C41(DE3)表达系统中过表达重组Nsp15的逐步方法，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析对蛋白进行纯化。采用N端6×His标签结合基于钴离子的固定化金属亲和层析（IMAC）来分离目标蛋白。进一步通过尺寸排阻层析（SEC）根据Nsp15的寡聚状态进行分离，以获得具有活性的六聚体形式。该方法为有毒核酸酶的过表达与纯化提供了有效途径，适用于生化及结构研究。

<table><tbody><tr><td>0.22 &amp;micro;m PES，无菌，低蛋白结合，过滤系统，1 L</td><td>Corning</td><td>431098</td><td></td></tr><tr><td>AEBSF 丝氨酸蛋白酶抑制剂</td><td>Goldbio</td><td>30827-99-7</td><td></td></tr><tr><td>细菌学琼脂</td><td>Amresco</td><td>J637</td><td></td></tr><tr><td>&amp;Auml;KTA go 纯化系统</td><td>Cytiva</td><td>29383015</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 mL，30 kDa 分子量截留浓缩管</td><td>Millipore</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠</td><td>Goldbio</td><td>A-301-25</td><td></td></tr><tr><td>带挡板摇瓶</td><td>Nalgene&amp;nbsp;</td><td>F0527</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>5920R</td><td></td></tr><tr><td>BioPhotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td>E-BP6132</td><td></td></tr><tr><td>牛凝血酶</td><td>BioPharm</td><td>91-030</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 染料试剂</td><td>Boston BioProducts</td><td>BPA-200</td><td></td></tr><tr><td>溴酚蓝</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114931</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>数字干浴器</td><td>Bio Rad</td><td>1660562</td><td></td></tr><tr><td>一次性L型涂布棒</td><td>MedSupply Partners</td><td>62-1014-1</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇</td><td>Goldbio</td><td>27565-41-9</td><td></td></tr><tr><td>牛胰脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Douce 组织研磨器，40 mL</td><td>Wheaton</td><td>357546</td><td></td></tr><tr><td>Econo-column 层析柱</td><td>Bio-Rad</td><td>737-1532</td><td></td></tr><tr><td>Enduro minimix 摇床混合器</td><td>Labnet</td><td>S0600</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>Excella E25R 制冷摇床</td><td>Eppendorf</td><td>NB-E25R</td><td></td></tr><tr><td>FastPette V2</td><td>Labnet</td><td>P2000</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX 固定角转子</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-041075</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F21-8x50y 固定角转子</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>096-084275</td><td></td></tr><tr><td>Gel Doc EZ 成像仪</td><td>Bio-Rad</td><td>1708270</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>甘氨酸</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0718</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>加热磁力搅拌器</td><td>VWR</td><td>12365-346</td><td></td></tr><tr><td>盐酸</td><td>VWR</td><td>BDH3028</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Goldbio</td><td>I-902-25</td><td></td></tr><tr><td>异丙基-&amp;szlig;-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Goldbio</td><td>12481C25</td><td></td></tr><tr><td>Lemo21(DE3) 感受态大肠杆菌细胞</td><td>New England Biolabs</td><td>C2528J</td><td></td></tr><tr><td>四水合氯化锰(II)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3634</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，0.5 mL</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，1.7 mL</td><td>MedSupply Partners</td><td>15-1151</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管，2 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN tetra 垂直电泳槽</td><td>Bio-Rad</td><td>10025025</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tris-甘氨酸凝胶，4-20%</td><td>Bio-Rad</td><td>4568094</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 小型离心机</td><td>MedSupply Partners</td><td>C1008-B</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene 1 L 超速离心瓶</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3141-1006</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Oak Ridge 离心管</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31139-0050</td><td></td></tr><tr><td>Nanophotometer</td><td>Implen</td><td>3769</td><td></td></tr><tr><td>非振荡培养箱</td><td>Labnet</td><td>I 5110&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>C41(DE3) 化学感受态过表达细胞</td><td>Biosearch Technologies</td><td>60442-1</td><td></td></tr><tr><td>C41(DE3) 化学感受态过表达细胞</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMC0017</td><td>已停产；可选用 Biosearch C41(DE3) 细胞或 NEB Lemo21 细胞作为替代</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>MedSupply Partners</td><td>62-1077-3</td><td></td></tr><tr><td>质粒（pET-14b 载体）</td><td>Genscript</td><td>定制订单</td><td></td></tr><tr><td>塑料微量比色皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955127</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac universal 电源</td><td>Bio-Rad</td><td>1645070</td><td></td></tr><tr><td>Precision glide 针头</td><td>Becton Dixon</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>Precision plus protein 未染色标准蛋白</td><td>Bio-Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>表达恢复培养基&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CMR0001K</td><td></td></tr><tr><td>S-4x1000 水平转子</td><td>Eppendorf</td><td>EP-S4X1</td><td></td></tr><tr><td>移液管，10 mL</td><td>Faclon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>移液管，25 mL</td><td>Faclon</td><td>35725</td><td></td></tr><tr><td>移液管，5 mL</td><td>Faclon</td><td>35743</td><td></td></tr><tr><td>移液管，50 mL</td><td>Pr1ma</td><td>PR-Sero-50</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>十二烷基硫酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td></td></tr><tr><td>超声破碎仪</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB505</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Lynx 4000 离心机</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75006580</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-25 M PD-10 层析柱</td><td>Cytiva</td><td>17085101</td><td></td></tr><tr><td>&amp;szlig;-巯基乙醇</td><td>Millipore</td><td>444203</td><td></td></tr><tr><td>不锈钢 Griffin 烧杯</td><td>Polar Ware</td><td>13977-010-EA</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Falcon 管，15 mL</td><td>Falcon</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>无菌 Falcon 管，50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL 层析柱</td><td>Cytiva</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>注射器，1 mL</td><td>Air-Tite&amp;nbsp;</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>注射器，3 mL</td><td>Becton Dixon</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>TALON 金属亲和树脂</td><td>Takara</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>牙签</td><td>Creativity Street</td><td>PAC3690-01</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Goldbio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>MP Biomedicals</td><td>807423</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>Research Products International</td><td>T60065</td><td></td></tr><tr><td>Vornado</td><td>Benchmark</td><td>BV101-G</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Research Products International</td><td>Y20025</td><td></td></tr></tbody></table>

过表达并纯化一种来自 escherichia coli 的毒性核酸酶

Overexpressing and Purifying a Toxic Nuclease from Escherichia coli

大肠杆菌（Escherichia coli）已被广泛用作表达系统以生产重组蛋白。然而，某些类型的重组蛋白（如核酸酶）由于其对细胞DNA或RNA的酶活性，在大肠杆菌（E. coli）中进行重组过表达时可能较为困难。此类毒性效应可能导致细胞生长缓慢和蛋白产量低下。冠状病毒的内切核糖核酸酶Nsp15即为一例：野生型（WT）γ冠状病毒Nsp15的产量远低于无催化活性的Nsp15。为解决这一问题，我们采用了C41(DE3)细胞以及同日单菌落起始培养的方法，以减轻毒性影响。带有N端6xHis标签的重组Nsp15通过钴基亲和层析进行过表达和纯化，随后采用尺寸排阻层析（SEC）进一步纯化。所得纯化蛋白的产量足以用于生化检测及冷冻电子显微镜结构研究。该方法已被证实可有效缓解毒性效应，并获得满足后续研究分析所需的蛋白产量。

由于Nsp15作为核酸酶具有毒性，起始培养通常需要约7小时才能达到OD600为0.8–1.0。接种后，通常还需约3–5小时才能达到诱导所需的相同最佳OD600（0.8–1.0）。在此情况下，倍增时间约为1小时。当表达Nsp15的催化失活突变体时，E. coli细胞的倍增时间表现正常（约20分钟），进一步证明核酸酶活性是导致毒性的原因（图1A）。
经过过夜诱导后，通常每2 L野生型培养物可收获6-9 g湿重的细胞沉淀。在多次不同Nsp15突变体的培养实验中，我们观察到较小的细胞沉淀与较高的核酸酶活性相关。对于催化失活的Nsp15，每2 L培养物获得的沉淀量明显更大，约为18-30 g。这些结果进一步支持核酸酶活性在表达过程中导致细胞毒性，但由于资源限制，我们尚缺乏以Western印迹形式提供的直接证据。
在实验流程中不同阶段取样进行凝胶电泳分析，结果显示，成功实现了对源自γ冠状病毒——传染性支气管炎病毒（In...

本文介绍了一种在C41(DE3)表达系统中过表达重组Nsp15（一种具有毒性的核酸酶）的方法，随后通过亲和层析和尺寸排阻层析纯化带标签的蛋白。这些方案可适用于其他难以表达的毒性蛋白。

过表达并纯化一种来自 Escherichia coli 的毒性核酸酶

大肠杆菌已被广泛用作表达系统以生产重组蛋白。然而，某些类型的重组蛋白，例如……

本实验室旨在对包括冠状病毒在内的尼多病毒（nidoviruses）中发现的一种保守的核酸内切酶进行结构与生化表征，以建立其进化模型，并为治疗靶点的开发提供依据。由于核酸酶可作用于细胞内的DNA或RNA，导致大肠杆菌（E. coli）表达系统中菌体生长缓慢且蛋白产量低下，因此这类蛋白的表达往往较为困难。我们的研究发现将使我们能够纯化来自其他尼多病毒的毒性核酸酶，进而开展后续的生化与结构研究。首先，每升培养液使用一个 50 毫升的灭菌锥形瓶，并额外准备两到三个锥形瓶作为种子培养。标记其中一个锥形瓶，加星号以专门用于光密度检测，除非各锥形瓶之间存在肉眼可见的差异，否则其测量值将代表整体生长情况。使用量筒，通过混合 60 毫升 2X TY 培养基和从 -20 摄氏度解冻的 60 微升氨苄青霉素储备液，配制母液混合物。轻轻混匀混合物，将主混合液各10毫升分装至每个锥形瓶中。现在，从培养箱中取出转化后的琼脂平板。使用无菌牙签或移液器吸头，挑取平板上单个分离的菌落，并直接转移至含有培养基的锥形瓶中。重复此操作，直至每个烧瓶中均含有接种了菌落的牙签。将接种后的烧瓶放入摇床培养箱中，在 210 转/分钟、37 摄氏度条件下振荡培养约 5 至 7 小时。为检测 600 纳米处的光密度，使用血清学移液管从标有星号的烧瓶中取出 1 毫升培养基。持续定期检测，直至光密度达到 0.8 至 1.0 之间。当达到目标光密度时，向每个锥形瓶中加入 1 毫升从 -20 摄氏度解冻的一摩尔 IPTG 溶液，以诱导蛋白过表达。随后，将两升锥形瓶转移至摇床培养箱中，在 210 转/分钟、16 摄氏度条件下振荡培养 14 至 16 小时，进行过夜诱导。每1.2克菌体沉淀加入2毫升裂解缓冲液，重悬菌体沉淀。每10毫升裂解缓冲液中加入100微升1摩尔AESBF作为蛋白酶抑制剂。若使用来自4升培养液的菌体沉淀，加入100微升DNase I，使其终浓度为200单位。涡旋振荡30秒后，将涡旋混合物转移至Dounce组织研磨器中，使用松配合的研杵进行约10次研磨以均质化样品。然后，将均质化后的样品转移至金属烧杯中进行超声处理。为最大程度回收样品，用5 mL裂解缓冲液冲洗原始沉淀管，并短暂涡旋振荡。将洗涤液倒入Dounce匀浆器中，用研杵轻轻研磨约5次，然后将内容物转移至超声杯中。向金属杯中加入75 µL Triton X-100，以促进膜裂解和溶解。将金属杯置于冰浴中，以确保样品在超声过程中保持低温。现在，将超声探头插入金属烧杯中，以70%的功率对样品进行超声处理，总时长为6分30秒，每2秒脉冲一次。然后，使用血清学移液管将裂解液转移至离心管中。加入1摩尔的AEBSF作为新鲜蛋白酶抑制剂，按1:100的比例稀释后加入同一离心管中，并在26,915 G条件下离心50分钟，以澄清裂解液。通过重力过滤进行亲和层析后，分

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Research

科研

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

过表达和纯化大肠杆菌中的有毒核酸酶

蛋白质转导技术能够将具有生物活性的蛋白质直接递送至细胞内。与传统的DNA转染或病毒转导方法相比，这种非侵入性策略能够以可调节的方式实现高效的细胞操控，避免了因永久性基因修饰所导致的细胞毒性及致癌转化风险。...

可穿透细胞的蛋白质的构建

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绘制细菌功能网络与通路 大肠杆菌 使用合成遗传阵列

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一种基于荧光的外切酶检测方法用于表征人类早衰相关WRN外切酶的果蝇同源蛋白DmWRNexo及其在其他核酸酶中的应用

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用于合成生物学的基于 Escherichia coli 的 TX-TL 无细胞表达系统的实施方案

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Escherichia coli中蛋白共表达的多重优势

一种高产率的一步法负向纯化重组蛋白方法 幽门螺杆菌 幽门螺杆菌中过表达的中性粒细胞激活蛋白（HP-NAP） 大肠杆菌 通过使用二乙氨基乙基树脂进行批次纯化的方法进行了描述。采用该方法纯化的HP-NAP有助于开发针对幽门螺杆菌的疫苗、药物或诊断试剂 H. pylori相关疾病.

一步法负向色谱纯化 幽门螺杆菌 中性粒细胞激活蛋白过表达于 大肠杆菌 批量模式

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人源蛋白的过表达与纯化 顺式- prenyltransferase 在 大肠杆菌

本文介绍一种利用已有的抗生素抗性盒缺失构建体作为基础，在其他大肠杆菌（E.

通过带有可切除抗生素抗性盒的 P1 转导在 Escherichia coli 中实现基因缺失

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无核酸酶氧清除剂原儿茶酸3,4-双加氧酶的表达与纯化

可以从识别部分简并序列的酶出发，开发出具有新序列特异性的限制性内切酶。本文提供了我们成功用于改变NlaIV酶序列特异性的详细实验方案。该方案的关键要素包括转录/翻译反应的体外区室化，以及具有新序列特异性的变体筛选。...

体外定向进化具有更高特异性的限制性内切酶

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可扩展的细胞外囊泡分离与纯化方法 大肠杆菌 及其他细菌

学习在大肠杆菌C41(DE3)系统中过表达和纯化有毒核酸酶Nsp15的方法。本研究采用亲和层析和尺寸排阻层析技术，为其他难以表达的毒性蛋白纯化提供了可靠的实验框架。

过表达并纯化一种来自 Escherichia coli 的毒性核酸酶

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