从临床样本中提取组蛋白用于质谱法进行表观遗传学分析

我们的研究范围是分析癌症样本中的表观遗传学变化，发现新的诊断和预后生物标志物，并确定潜在的治疗靶点。临床样本的主要挑战在于样本量有限以及固定过程引起的假象。然而，通过我们优化的工作流程和高灵敏度质谱技术，仅需1000个细胞即可定量多达50种组蛋白翻译后修饰。

我们证明质谱技术可定量临床样本中的组蛋白翻译后修饰变化，有助于揭示表观遗传机制，并推动精准表观遗传治疗中的生物标志物发现和药物靶点鉴定。本方案满足了在多种类型的临床样本中对组蛋白翻译后修饰进行可靠、定量且高灵敏度分析的需求。质谱技术非常适合组蛋白翻译后修饰分析，能够实现无偏倚检测、同时进行多重修饰谱型分析以及在同一肽段上共发生的修饰检测，从而克服了基于抗体方法的局限性。

首先，将新鲜冷冻组织置于冰上解冻，使用解剖刀或刀片切取约20至30毫克的组织，体积约为2立方毫米。将切好的组织样本转移至1.5毫升离心管中。用剪刀将组织剪成小块。

加入一毫升新鲜配制的细胞核分离缓冲液，缓冲液中需添加指定的蛋白酶抑制剂，再次切碎组织。将样品转移至Dounce匀浆器中。先使用松散的研杵，再使用紧密的研杵，匀浆至肉眼不可见任何组织碎片为止。

将匀浆后的样品通过100微米细胞滤筛过滤，以去除组织碎片。使用200微升移液器剧烈吹打过滤后的样品，充分溶解细胞膜。将样品转移至新的1.5毫升离心管中。

将离心管放入台式离心机中，在4°C条件下以2,300 G离心15分钟，以沉淀细胞核。弃去上清液后，用50至100微升核分离缓冲液重悬核沉淀物，并加入0.1% SDS以溶解核膜。然后向重悬的样品中加入250单位的苯甲酸酶核酸酶，以消化核酸。

充分混匀，于37摄氏度孵育2分钟。对于最佳切割温度（OCT）包埋的冷冻样本，在切碎和组蛋白提取前，先用乙醇水和PBS洗涤组织。取1.5毫升离心管中的FFPE样本，加入1毫升石蜡溶解剂，最大速度涡旋振荡30秒，直至石蜡完全溶解。

将样品在室温下以16,000 G离心3分钟，然后使用装有细小吸头的移液器小心弃去上清液，避免触及沉淀。向沉淀中加入1毫升95%乙醇，最大速度涡旋振荡30秒。将样品在室温下以16,000 G离心3分钟，弃去上清液。

样本重悬后，向沉淀中加入 200 µL 裂解缓冲液。使用 3 mm 微量探头，通过数字信号发生器在裂解缓冲液中匀浆组织。匀浆完成后，将样本置于恒温混匀仪中孵育，并短暂打开管盖以使甲醛挥发。

离心样品后，将上清液转移至一个新的已标记的离心管中。使用手术刀切下对应于分子量在10至18千道尔顿之间的核心组蛋白蛋白的凝胶条带。切割凝胶条带后，使用同一把手术刀将切下的凝胶小块转移至一个1.5毫升的离心管中。

为脱色凝胶，加入含有50%乙腈的双蒸水溶液，将离心管置于恒温混匀仪中，在室温下以每分钟1,400转的速度孵育10分钟。通过加入100%乙腈使凝胶颗粒脱水。在恒温混匀仪中于室温下以每分钟1,400转的速度混合10分钟。

弃去上清液后，将凝胶小块置于真空离心机中，在室温下干燥五分钟。接着，向每管中加入15微升7.7摩尔的丙酸酐溶液和26微升1摩尔的碳酸氢铵溶液，并进行孵育。然后，用80微升1摩尔的碳酸氢铵溶液孵育样品。

然后用双蒸水洗涤凝胶颗粒三次，每次孵育后弃去液体。接着向凝胶颗粒中加入50%乙腈，于室温下以1,400转/分钟孵育15分钟。然后加入100%乙腈，以彻底脱水凝胶颗粒。

将样品在恒温混匀仪中于室温下以1,400转/分钟孵育15分钟。弃去液体后，将凝胶碎块置于真空离心浓缩仪中于室温干燥5分钟。向每管含有凝胶碎块的样品中加入4 µL胰蛋白酶溶液和20 µL消化缓冲液。

将离心管置于冰上孵育10分钟，使胰蛋白酶充分吸收进入凝胶。待胰蛋白酶完全吸收后，向每个离心管中加入80 µL消化缓冲液，完全覆盖凝胶颗粒，并在37 °C条件下于温控混匀仪中孵育过夜。为提取已消化的肽段，向每管中加入100 µL 100%乙腈，于室温下在温控混匀仪中以1,400 rpm振荡孵育20分钟。

现在，小心收集上清液，并将其转移至新的 1.5 毫升离心管中。用剩余的凝胶重复乙酸-硝基提取步骤后，合并上清液。在真空离心浓缩仪中浓缩合并后的肽段，直至体积达到 1 至 5 微升。

然后加入两微升（2 µL）1 摩尔的三乙基铵碳酸氢盐和三微升（3 µL）苯基异氰酸酯溶液。将样品置于恒温混匀仪中，在 37 摄氏度（37 °C）下以每分钟 350 转（350 rpm）的速度孵育 90 分钟。为终止衍生化反应，向每根试管中加入八微升（8 µL）1% 三氯乙酸溶液。

最后，通过加入100微升缓冲液A稀释每个样品，并将稀释后的样品加载至C18层析小柱上进行洗脱。采用针对每种组织类型特异的差异处理流程，已成功从新鲜冷冻、OCT包埋冷冻及福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样品中提取组蛋白。尽管富集效率较低且存在背景蛋白，但仍成功从FFPE样品中提取出组蛋白H3、H2A、H2B和H4，如泳道FFPE1和FFPE2中的条带所示，其含量与约一微克的H3.1标准品相当。

对来自福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本的组蛋白进行的纳米液相色谱及质谱分析显示，在55分钟梯度洗脱中实现了组蛋白肽段的有效分离，总离子流图中呈现出清晰的保留时间峰。提取离子流图证实了H3K4未修饰及甲基化形式的检测与定量，并针对每个m/z值显示出独立的洗脱曲线，从而能够计算每种修饰形式的相对百分丰度。

对正常样本与肿瘤样本之间的组蛋白修饰进行比较分析，发现肿瘤组织中某些类型的组蛋白修饰显著增加，而其他类型则减少。